1、第第7 7章蛋白質的分離、純化章蛋白質的分離、純化和表征和表征Protein Separation, Purification and CharacterizationOUTLINEnIonization of proteinIonization of proteinnProtein size and shapeProtein size and shapenProteinProteins colloid character and s colloid character and depositiondepositionnPrinciples of Protein purificationPri

2、nciples of Protein purificationnProtein content and purity Protein content and purity determinationdetermination因材施法，有的放矢因材施法，有的放矢Protein Purification and Protein Purification and CharacterizationCharacterization對蛋白質分子進行的各種研究，對蛋白質分子進行的各種研究，要建立在對蛋白質分子本身的性質（特別是區別于其它生要建立在對蛋白質分子本身的性質（特別是區別于其它生物與化學分子的獨特的

3、性質）物與化學分子的獨特的性質）和各種實驗手段的原理和適用性深入了解的基礎上。和各種實驗手段的原理和適用性深入了解的基礎上。蛋白蛋白質質大分大分子子半透半透膜膜小分小分子子小分小分子子Protein Purification and Protein Purification and CharacterizationCharacterizationn分離和純化蛋白質的分離和純化蛋白質的各種各種方法主要是利方法主要是利用蛋白質之間各種特性的差異，包括：用蛋白質之間各種特性的差異，包括：n分子的大小和形狀分子的大小和形狀n酸堿性質酸堿性質n溶解度溶解度n吸附性質吸附性質n對配體分子的特異生物學親和力

4、對配體分子的特異生物學親和力Protein Purification and Protein Purification and CharacterizationCharacterizationnThe aim of protein purification is to isolate one particular protein from all the others in the starting material, exploits利用: Solubility Size Charge Hydrophobicity or/and specific binding affinity of th

5、e protein of interestProtein Purification and Protein Purification and CharacterizationCharacterizationn.1 .1 蛋白質的酸堿性質蛋白質的酸堿性質nIonization of proteinIonization of proteinn對某一種蛋白質來說，在某一對某一種蛋白質來說，在某一pHpH，它所帶的正，它所帶的正電荷和負電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這電荷和負電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一一pHpH稱為蛋白質的稱為蛋白質的等電點等電點 ( (isoelectric isoelect

6、ric point, pIpoint, pI) )。Ionization of proteinIonization of proteinn蛋白質的滴定曲線形狀和等電點，在有中性鹽存在下蛋白質的滴定曲線形狀和等電點，在有中性鹽存在下可以發生明顯的變化。可以發生明顯的變化。n蛋白質等電點在一定程度上決定于介質中離子的組成。蛋白質等電點在一定程度上決定于介質中離子的組成。n沒有其他鹽類干擾時，蛋白質質子供體基團解沒有其他鹽類干擾時，蛋白質質子供體基團解離出來的質子數與質子受體基團結合的質子數離出來的質子數與質子受體基團結合的質子數相等時的相等時的pHpH稱為稱為等離子點等離子點( (isoionic

7、 pointisoionic point) )。acid excess positive charge Cation exchangerisoelectric pointbalanced positive and negative chargealkalineexcess negative chargeAnion exchanger310pH_+Overall charge on proteinThe overall charge on a protein depends on pHIonization of proteinIonization of proteinn7.2 7.2 蛋白質分子

8、的大小與形狀蛋白質分子的大小與形狀nProtein size and shapeProtein size and shapen7.2.1 7.2.1 根據化學組成測定最低相對分子質量根據化學組成測定最低相對分子質量 鐵的原子量鐵的原子量n鐵的百分含量鐵的百分含量= = 100100 最低相對分子質量最低相對分子質量 鐵的原子量鐵的原子量n最低相對分子質量最低相對分子質量=100100鐵的百分含量鐵的百分含量 55.8例如，肌紅蛋白相對分子質量=100 0.335 =16700 用其他物理化學法法測得的肌紅蛋白Mr與此極為接近，可見肌紅蛋白分子中只含一個鐵原子。nProtein size and

9、 shapeProtein size and shape7.2.2 7.2.2 滲透壓法測定相對分子質量滲透壓法測定相對分子質量滲透與滲透壓滲透與滲透壓n滲透壓法測定相對分子質量滲透壓法測定相對分子質量n溶劑分子由純溶劑（或稀溶液）向溶液（或濃溶液）單方向凈移動現象稱為滲透滲透(osmosis)(osmosis)。n滲透的結果，溶液內的體積增加，液面升高，直至達到一定的靜水壓力時維持平衡。這時的靜水壓力就是溶液在平衡濃度時的滲透壓滲透壓（osmotic pressure)osmotic pressure)。n滲透壓滲透壓是單位體積內溶質質點數的函數質點數的函數，而與溶質的性質和形狀無關。n在濃

10、度不大時，滲透壓與溶質的相對分子量的在濃度不大時，滲透壓與溶質的相對分子量的關系為：關系為：n= RT(c/Mr + K c= RT(c/Mr + K c2 2 ) )nMr = RT/ lim/cMr = RT/ lim/cn c0 c0滲透壓法測定相對分子質量滲透壓法測定相對分子質量n7.2.3 7.2.3 蛋白質的擴散和擴散系數蛋白質的擴散和擴散系數n擴散（擴散（diffusiondiffusion）ndm/dt =-DA dc/dxdm/dt =-DA dc/dxnD D 擴散系數，擴散系數， A A 擴散面積擴散面積n擴散系數隨擴散系數隨MrMr的增加而降低。的增加而降低。n但擴散系

11、數對但擴散系數對MrMr的變化并不敏感，一般不單獨的變化并不敏感，一般不單獨用來確定用來確定MrMr。n7.2.4 7.2.4 沉降分析法測定相對分子質量沉降分析法測定相對分子質量n蛋白質溶液在受到蛋白質溶液在受到強大的離心力強大的離心力作用時，如果蛋白質作用時，如果蛋白質的密度大于溶液的密度，蛋白質分子就會沉降。的密度大于溶液的密度，蛋白質分子就會沉降。n沉降的速率與蛋白質分子大小和密度有關，而且與分沉降的速率與蛋白質分子大小和密度有關，而且與分子形狀、溶液的密度和粘度有關。子形狀、溶液的密度和粘度有關。n沉降速率法沉降速率法n沉降平衡法沉降平衡法沉降分析法測定相對分子質量沉降分析法測定相對

12、分子質量n離心機離心機n轉速轉速 60 000-80 000rpm60 000-80 000rpm（rotation per rotation per minute minute ）n離心力離心力 400 00- 700 000g400 00- 700 000g沉降分析法測定相對分子質量沉降分析法測定相對分子質量離心力離心力 442 2 v v 2 2 r r F = - F = - g gF :F :離心力，單位以地心引力的倍數離心力，單位以地心引力的倍數g g表示（即表示（即g g 或或g g）g :g :重力加速度，等于重力加速度，等于980.6 cm980.6 cm2 2/s/s2 2

13、. .r : r : 通常指自離心管中軸底部內壁到離心轉軸中心之間通常指自離心管中軸底部內壁到離心轉軸中心之間的距離（的距離（cmcm）v v : :為轉速，即離心機每秒的轉數，若以每分鐘轉數為轉速，即離心機每秒的轉數，若以每分鐘轉數（rpmrpm）表示，則上式應為）表示，則上式應為 442 2 v v 2 2 r r F = - F = - （1/601/60）2 2 g gn7.2.4.1 7.2.4.1 沉降速率法沉降速率法n沉降界面沉降界面n當分子顆粒以恒定速度移動時，凈離心力與摩擦力的當分子顆粒以恒定速度移動時，凈離心力與摩擦力的關系：關系：nF Fc c- F- Fb b= F=

14、Ff fn dx/dt m dx/dt mp p(1-)(1-)n = = n 2 2 f fn dx/dtdx/dtn s= s= n 2 2n單位離心場的沉積速度是個定值，稱為單位離心場的沉積速度是個定值，稱為沉降系沉降系數數（sedimentation coefficient)sedimentation coefficient)或或沉降常沉降常數數。n蛋白質、核酸、核糖體和病毒的沉降系數介于蛋白質、核酸、核糖體和病毒的沉降系數介于1 11010-13-13 到到20020010 10 - - 1313 秒的范圍。秒的范圍。n10 10 - - 1313 秒作為一個單位，斯維得貝格單位或沉

15、降系數秒作為一個單位，斯維得貝格單位或沉降系數單位，即單位，即S S。沉降分析法測定相對分子質量沉降分析法測定相對分子質量n7.2.4.2 7.2.4.2 沉降平衡法沉降平衡法n利用沉降平衡法測定相對分子質量是在較低速度利用沉降平衡法測定相對分子質量是在較低速度（8000 -20000r/min8000 -20000r/min）的離心場中進行的。）的離心場中進行的。n蛋白質的沉降平衡蛋白質的沉降平衡（圖7-3）沉降分析法測定相對分子質量沉降分析法測定相對分子質量n在時間在時間dtdt內濃度為內濃度為c c的溶液越過橫截面的溶液越過橫截面A A的溶質量：的溶質量： dm=-cA dx/dt dt

16、dm=-cA dx/dt dtn因此擴散作用沿相反方向越過橫截面因此擴散作用沿相反方向越過橫截面A A的溶質量：的溶質量： dmdm=- DA dc/dx dt=- DA dc/dx dt沉降沉降分析分析法測法測定相定相對分對分子質子質量量n當凈離心力與擴散力平衡時，在離心池內從液當凈離心力與擴散力平衡時，在離心池內從液面到液底形成一個由低到高的恒定濃度梯度，面到液底形成一個由低到高的恒定濃度梯度，因此：因此：n 2RTdln(c2 / c1)nMr = n (1-) 2(x22-x12)沉降分析法測定相對分子質量沉降分析法測定相對分子質量n7.2.5 7.2.5 凝膠過濾法測定相對分子質量凝

17、膠過濾法測定相對分子質量nGel filtration chromatographyGel filtration chromatographyn凝膠過濾法的原理凝膠過濾法的原理Gel filtration chromatographyGel filtration chromatographynSize exclusion chromatography n Molecular sieve（篩子）（篩子） chromatography Molecules are separated on the basis of their size and shape. The protein sample i

18、n a small volumes is applied to the top of a column of porous(有孔的有孔的) beads that are made of an insoluble but highly hydrated （親水的親水的）polymer such as polyacrylamide (Bio-Gel) or the carbohydrates dextran （葡聚糖（葡聚糖 ）(Sephadex) or agarose (瓊脂糖瓊脂糖) (Sepharose) Small molecules can enter the pores in the

19、beads whereas larger or more elongated molecules cannot. The smaller molecules therefore have a larger volume of liquid accessible （可達到的，可接近（可達到的，可接近的）的） to them; both the liquid surrounding the porous heads and that inside the beads. In contrast, the larger molecules have only the liquid surroundin

20、g the beads accessible to them, and thus move through the column faster, emerging out of the bottom (eluting洗脫洗脫) first. The smaller molecules move more slowly through the column and elute later.層析柱的洗脫體積與分子量的關系：層析柱的洗脫體積與分子量的關系：Ve=K1-K2lgM凝凝膠膠過過濾濾法法測測定定相相對對分分子子質質量量lgn7.2.6 SDS7.2.6 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定聚丙烯

21、酰胺凝膠電泳法測定 相對分子質量相對分子質量SDSSDS， 有效變性劑，帶負電荷有效變性劑，帶負電荷巰基乙醇，巰基乙醇，打開二硫鍵打開二硫鍵蛋白質亞基在電場中的行為只與分子大小有關。蛋白質亞基在電場中的行為只與分子大小有關。nR Rf f = = K K1 1- -K K2 2 lg lg M MMarkerElectrophoresis of ProteinnIn polyacrylamide( (聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺) ) gel electrophoresis (PAGE) proteins are applied to a porous(可滲透的，多孔的可滲透的，多孔的) polyac

22、rylamide gel and separated in an electric field on the basis of their net negative charge and their size. nSmall/more negatively-charged proteins migrate further through the gel than larger/less negatively-charged proteinsn7.3 7.3 蛋白質的膠體性質蛋白質的膠體性質 與蛋白質的沉淀與蛋白質的沉淀ProteinProteins colloid character and

23、depositions colloid character and deposition n7.3.1 7.3.1 蛋白質的膠體性質蛋白質的膠體性質n蛋白質溶液是一個分散系統蛋白質溶液是一個分散系統n分散相質點 100nm的為懸濁液，n 介于1-100nm的為膠體溶液。Protein colloid character and depositionProtein colloid character and depositionn膠體系統的穩定條件：膠體系統的穩定條件：n1 1 分散相質點的大小分散相質點的大小n2 2 分散相質點帶有同種電荷分散相質點帶有同種電荷n3 3 分散相質點能與溶劑形成

24、溶劑化層分散相質點能與溶劑形成溶劑化層+ + + +n每克蛋白質分子能結合每克蛋白質分子能結合0.3-0.50.3-0.5克水。克水。n蛋白質溶液具有：丁達爾效應，布朗運動及蛋白質溶液具有：丁達爾效應，布朗運動及 不能通過半透膜的性質。不能通過半透膜的性質。Protein colloid character and depositionProtein colloid character and depositionThe hydrophobic and hydrophilic parts on the surface of proteinProtein colloid character an

25、d depositionProtein colloid character and depositionn7.3.2 7.3.2 蛋白質的沉淀蛋白質的沉淀n沉淀蛋白質的方法沉淀蛋白質的方法 ：n1 1）鹽析法）鹽析法n 鹽析一般不引起蛋白質的變性鹽析一般不引起蛋白質的變性n2 2）有機溶劑沉淀法）有機溶劑沉淀法 脫去水化層及降低介電常數脫去水化層及降低介電常數( (酒精，丙酮酒精，丙酮) )n3 3）重金屬鹽沉淀法）重金屬鹽沉淀法 生成不溶性的復合物生成不溶性的復合物n4 4）生物堿試劑和某些酸類沉淀法）生物堿試劑和某些酸類沉淀法 單寧酸，三氯醋酸，磺基水楊酸和硝酸單寧酸，三氯醋酸，磺基水楊酸

26、和硝酸n5 5）加熱變性沉淀法）加熱變性沉淀法n7.4 7.4 蛋白質分離純化的一般原則蛋白質分離純化的一般原則nPrinciples of Protein purificationPrinciples of Protein purification n蛋白質分離純化的程序包括：蛋白質分離純化的程序包括：n1 1）前處理）前處理n2 2）粗分級分離）粗分級分離n3 3）細分級分離）細分級分離n4 4）結晶）結晶n7.5 7.5 蛋白質的分離純化方法蛋白質的分離純化方法nMethods of Protein Purification Methods of Protein Purification

27、 n根據蛋白質在溶液中性質的分離純化方法：根據蛋白質在溶液中性質的分離純化方法：n1 1）分子大小）分子大小n2 2）溶解度）溶解度n3 3）電荷）電荷n4 4）吸附性質）吸附性質n5 5）對配體分子的生物學親和力）對配體分子的生物學親和力n7.5.1 7.5.1 根據分子大小不同的純化方法根據分子大小不同的純化方法n7.5.1.1 7.5.1.1 透析和超過濾透析和超過濾n常用的半透膜是玻璃紙或稱賽璐玢紙。n透析裝置透析裝置n利用壓力和離心力的超過濾裝置利用壓力和離心力的超過濾裝置Methods of Protein PurificationMethods of Protein Purifi

28、cationMethods of Protein PurificationMethods of Protein Purification大分子大分子膜膜小分子小分子小分子小分子蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法n密度梯度（區帶）離心法密度梯度（區帶）離心法n蛋白質顆粒的沉降不僅決定于它的大小大小，而且也決定于它的密度密度。Methods of Protein PurificationMethods of Protein PurificationMethods of Protein PurificationMethods of Protein Purification凝膠過濾凝膠過濾 ge

29、l filtration chromatographygel filtration chromatography1903-1906，M. Tswett 將葉將葉綠 素 的 石 油 醚 溶 液 通 過綠 素 的 石 油 醚 溶 液 通 過CaCO3管柱，并繼續以石油管柱，并繼續以石油醚淋洗，由于醚淋洗，由于CaCO3對葉綠對葉綠素中各種色素的吸附能力不素中各種色素的吸附能力不同，色素被逐漸分離，在管同，色素被逐漸分離，在管柱中出現了不同顏色的譜帶，柱中出現了不同顏色的譜帶，所以稱色譜圖。所以稱色譜圖。Methods of Protein PurificationMethods of Protei

30、n PurificationnGel Filtration ChromatographyGel Filtration Chromatographyn也稱：也稱： 凝膠過濾層析 分子排阻層析 凝膠滲透層析 分子篩層析Gel Filtration ChromatographyGel Filtration Chromatographyn常使用的凝膠有：常使用的凝膠有：n交聯葡聚糖（交聯葡聚糖（Sephadex）n聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(Bio-gel P)n瓊脂糖瓊脂糖 (Sepharose Bio-gel A)n凝膠的交聯度和孔度（網孔大小）決定了凝膠的分離分級范圍nGel Filtrati

31、on ChromatographyGel Filtration Chromatographyn凝膠過濾的原理：凝膠過濾的原理：n當不同分子大小的蛋白質流經凝膠層析柱時，當不同分子大小的蛋白質流經凝膠層析柱時，比凝膠孔徑大的分子比凝膠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構，不能進入珠內網狀結構，而被排阻在凝膠珠之外隨著溶劑在凝膠珠之間而被排阻在凝膠珠之外隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下移動并最先流出柱外的空隙向下移動并最先流出柱外n比網孔小的分子比網孔小的分子能不同程度地自由出入凝膠珠能不同程度地自由出入凝膠珠的內外的內外n這樣由于不同大小分子所經過的路徑不同而得這樣由于不同大小分子所經過的路徑不同而得

32、到分離到分離凝凝膠膠過過濾濾柱層析的基本裝置柱層析的基本裝置ColumnColumn 蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法 層析柱通常是玻璃層析柱通常是玻璃的。總的說來，長的。總的說來，長柱分辨率高。但大柱分辨率高。但大量物質的處理則用量物質的處理則用粗的柱比較適宜。粗的柱比較適宜。ColumnColumn蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法n凝膠過濾的術語:V Vt t 凝膠柱床的總（床）體積凝膠柱床的總（床）體積V Ve e 洗脫體積洗脫體積V V0 0 孔隙體積，外水體積孔隙體積，外水體積V Vi i 內水體積內水體積V Vm m 凝膠基質體積凝膠基質體積 V Vt = t =

33、V Vi i +V+V0 0 + + V Vm m蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法Gel Filtration ChromatographyGel Filtration Chromatographyn7.5.2 7.5.2 利用溶解度差別的純化方法利用溶解度差別的純化方法n7.5.2.1 7.5.2.1 等電點沉淀和等電點沉淀和pHpH控制控制蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法利用溶解度差別的純化方法利用溶解度差別的純化方法n7.5.2.2 7.5.2.2 蛋白質的鹽溶和鹽析蛋白質的鹽溶和鹽析n鹽溶：少量鹽促進蛋白質溶解的現象鹽溶：少量鹽促進蛋白質溶解的現象n鹽析：大量鹽使得蛋白

34、質沉淀的現象鹽析：大量鹽使得蛋白質沉淀的現象n鹽析作用鹽析作用n 大量中性鹽的加入使水的活度降低，原來溶液中的大部分甚至全部的自由水轉變為鹽離子的水化水n 那些被迫與蛋白質表面的疏水基團接觸并掩蓋它們的水分子成為下一步最自由地可利用的水分子，因此被移去以溶劑化鹽離子，留下暴露出來的疏水基團n 隨著鹽濃度的增加，蛋白質疏水表面進一步暴露，由于疏水作用蛋白質聚集而沉淀n 最先聚集的蛋白質是表面上疏水殘基最多的蛋白質。蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法n利用溶解度差別的純化方法利用溶解度差別的純化方法n7.5.2.3 7.5.2.3 有機溶劑分級分離法有機溶劑分級分離法n與水互溶的有機溶劑（如

35、甲醇，乙醇和丙酮等）與水互溶的有機溶劑（如甲醇，乙醇和丙酮等）能使蛋白質在水中的溶解度顯著降低。室溫下，能使蛋白質在水中的溶解度顯著降低。室溫下，有機溶劑不僅能引起蛋白質沉淀，而且伴隨著變有機溶劑不僅能引起蛋白質沉淀，而且伴隨著變性。性。n控制有機溶劑濃度也可以分離純化蛋白質。控制有機溶劑濃度也可以分離純化蛋白質。n有機溶劑引起蛋白質沉淀的主要原因之一是改變有機溶劑引起蛋白質沉淀的主要原因之一是改變了介質的介電常數。了介質的介電常數。n介電常數的降低將增加兩個相反電荷之間的引力。介電常數的降低將增加兩個相反電荷之間的引力。蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法利用溶解度差別的純化方法利用溶解

36、度差別的純化方法n7.5.2.4 溫度對蛋白質溶解度的影響溫度對蛋白質溶解度的影響n在一定溫度范圍內，約在一定溫度范圍內，約 0-40 0-40 之間，大部分之間，大部分球狀蛋白的溶解度隨溫度升高而增加。球狀蛋白的溶解度隨溫度升高而增加。n人的血紅蛋白從人的血紅蛋白從0-250-25，溶解度隨溫度上升而上升，溶解度隨溫度上升而上升。蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法利用溶解度差別的純化方法利用溶解度差別的純化方法脲或鹽酸胍的變性作用脲或鹽酸胍的變性作用n7.5.3 根據電荷不同的純化方法根據電荷不同的純化方法n7.5.3.1 電泳電泳 ElectrophoresisElectrophor

37、esis n在外電場作用下，帶電顆粒，如不處于等電在外電場作用下，帶電顆粒，如不處于等電點的蛋白質分子，將向著與其電性相反的電點的蛋白質分子，將向著與其電性相反的電極移動，這種現象稱為電泳極移動，這種現象稱為電泳蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法ElectrophoresisElectrophoresisn區帶電泳(zone electrophoresis)可分四類：na 濾紙電泳和薄膜電泳；nb 粉末電泳；nc 細絲電泳；nd 凝膠電泳，適于分離蛋白質和多核苷酸、核 酸。v電泳裝置主要包括兩個部分：電源電泳裝置主要包括兩個部分：電源( (電泳儀）和電電泳儀）和電泳槽。泳槽。v電源提供直

38、流電，在電泳槽中產生電場，驅動帶電電源提供直流電，在電泳槽中產生電場，驅動帶電分子的遷移。分子的遷移。ElectrophoresisElectrophoresis蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法ElectrophoresisElectrophoresisn7.5.3.2 7.5.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳nPolyacrylamide Gel ElectrophoresisPolyacrylamide Gel Electrophoresisn(PAGE)(PAGE)n有時用不連續的膠（濃縮膠與分離膠）有時用不連續的膠（濃縮膠與分

39、離膠）n不連續的聚丙烯酰胺凝膠電泳有不連續的聚丙烯酰胺凝膠電泳有3 3種物理作用：種物理作用： 1.1.樣品的濃縮效應樣品的濃縮效應 2.2.分子篩效應分子篩效應 3.3.電荷效應電荷效應蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法 n孔徑不連續性n緩沖體系離子成分及pH值的不連續性（前導離子CI-,尾隨離子Gly）n電位梯度的不連續性濃縮效應：濃縮效應：Polyacrylamide Gel Electrophoresis Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)(PAGE)nThe greater the net charge the faster th

40、e molecule will move.n In PAGE the electrophoretic separation is carried out in a gel which serves as a molecular sieve.n Small molecules move readily through the pores in the gel, whereas larger molecules are retarded.nThe pore sizes in the gel can be controlled by choosing appropriate concentratio

41、ns of acrylamide（丙烯酰胺）（丙烯酰胺） and the cross-linking reagent, methylene bisacrylamide（甲叉雙丙烯酰胺）（甲叉雙丙烯酰胺）.nThe higher the concentration of acrylamide used , the smaller the pores size in the final gel.SDS-PAGE原理原理蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法Acrylamid 丙烯酰胺丙烯酰胺N,Nmethylenebisacrylamide N，N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺v聚丙烯酰胺凝膠的

42、孔徑可以通過改變丙烯酰胺和甲叉聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來控制，丙烯酰胺的濃度可以在雙丙烯酰胺的濃度來控制，丙烯酰胺的濃度可以在3 33030之間。之間。v低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3-43-4的聚丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質沒有明顯的阻礙作用，可用于等電聚焦凝膠對蛋白質沒有明顯的阻礙作用，可用于等電聚焦或作為或作為PAGEPAGE電泳的濃縮膠，也可以用于分離電泳的濃縮膠，也可以用于分離DNADNA。v高濃度凝膠具有較小的孔徑，對蛋白質有分子篩的作高濃度凝膠具有較小的孔徑，對蛋白質有分子篩的作用，用， 可以用于根據蛋白質

43、的分子量進行分離的電泳中，可以用于根據蛋白質的分子量進行分離的電泳中，如如10102020的凝膠常用于的凝膠常用于PAGEPAGE電泳的分離膠。電泳的分離膠。SDS-PAGESDS-PAGE原理原理蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法SDS-PAGESDS-PAGEnIn sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE, the proteins are denatured and coated with an overall negative charge (due to bound SDS) and thus the basis for their separati

44、on is only their massSDS-PAGESDS-PAGEnThe protein mixture is first treated with a reducing agent such as 2-mercaptoethanol（巰基乙醇）巰基乙醇） or dithiothreitol（二硫叔糖醇）（二硫叔糖醇） to break all the disulfide bonds. nThe strong anionic detergent SDS is then added which disrupts nearly all the noncovalent interactio

45、ns in the protein, unfolding the polypeptide chain.SDS-PAGESDS-PAGEnApproximately one molecule of SDS binds via its hydrophobic alkyl（烷基）（烷基） chain to the polypeptide backbone for every two amino acid residues, which gives the denatured protein a large net negative charge that is proportional(成比成比例例

46、 的的) to its mass 蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法n7.5.3.3 7.5.3.3 毛細管電泳毛細管電泳 Capillary ElectrophoresisCapillary Electrophoresisn電泳是在微內徑管（一般為電泳是在微內徑管（一般為50um50um內徑和內徑和300um300um外徑）內進行的外徑）內進行的. .n一般管長一般管長5050100 cm100 cm，電壓，電壓101050 kV50 kV，時間，時間101030 min30 min。蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法Capillary ElectrophoresisCapill

47、ary Electrophoresisn雖然被分析樣品因電泳遷移而分離，然而雖然被分析樣品因電泳遷移而分離，然而電電滲作用滲作用(electroendosmosis)(electroendosmosis)使他們向負使他們向負極移動。由于電滲流很強，其速度一般比樣品極移動。由于電滲流很強，其速度一般比樣品的電泳速度大，因此所有的正、負離子和中性的電泳速度大，因此所有的正、負離子和中性分子都被推向負極。分子都被推向負極。/ 蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法Capillary ElectrophoresisCapillary Electrophores

48、isn7.5.3.4 7.5.3.4 等電聚焦等電聚焦n（isoelectric focusing, IEFisoelectric focusing, IEF）n等電聚焦或稱電聚焦等電聚焦或稱電聚焦(electric focusing,EF)(electric focusing,EF) 兩性電解質兩性電解質 pHpH梯度梯度蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法The principle of isoelectric focusingThe principle of isoelectric focusing 在在IEFIEF的電泳中，具有的電泳中，具有pHpH梯度的介質其分布是從陽極到陰極，

49、梯度的介質其分布是從陽極到陰極，pHpH值逐漸增大。值逐漸增大。 蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特征，這樣在堿性區域蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特征，這樣在堿性區域蛋白質分子帶負電荷，向陽極移動，直至某一蛋白質分子帶負電荷，向陽極移動，直至某一pHpH位點時失去電荷位點時失去電荷而停止移動，此處介質的而停止移動，此處介質的pHpH恰好等于聚焦蛋白質分子的等電點。恰好等于聚焦蛋白質分子的等電點。 同理，位于酸性區域的蛋白質分子帶正電荷向陰極移動，直同理，位于酸性區域的蛋白質分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點上聚焦為止。到它們的等電點上聚焦為止。 在電場內經過一定時間后，等電點不同的蛋

50、白質混合物的各在電場內經過一定時間后，等電點不同的蛋白質混合物的各組分將分別聚焦在各自等電點相應的組分將分別聚焦在各自等電點相應的pHpH位置上，形成分離的蛋白位置上，形成分離的蛋白質區帶。質區帶。 蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法The principle of isoelectric focusingThe principle of isoelectric focusing蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法The apparatus of isoelectric focusingThe apparatus of isoelectric focusing蛋蛋白白質質的的分分離離

51、純純化化方方法法Application of Application of isoelectric focusingisoelectric focusing1 1分離等電點不同的蛋白質。分離等電點不同的蛋白質。2 2測定某個未知蛋白質的等電點。測定某個未知蛋白質的等電點。3 3研究蛋白質微觀不均一性。研究蛋白質微觀不均一性。4 4. . 蛋白質純化制備。蛋白質純化制備。 5 5用于用于IEF/SDS-PAGEIEF/SDS-PAGE雙向電泳。雙向電泳。 蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法The principle of isoelectric focusingThe principle

52、of isoelectric focusingnIsoelectric focusing electrophoretically separates proteins on the basis of their relative content of positively and negatively charged groups. When a protein is at its pI, its net charge is zero and hence it will not move in an electric fieldThe principle of isoelectric focu

53、singThe principle of isoelectric focusingnIn isoelectric focusing, a polyacrylamide gel is used which has large pores and contains a mixture of polyampholytes (small multicharged polymer that have many pI values). If an electric field is applied to the gel, the polyampholytes migrate and produce a p

54、H gradient. Each protein will migrate through the gel until it reaches a position at which the pH is its pI .雙向電泳（雙向電泳（2-DE2-DE）與蛋白質組學）與蛋白質組學Two-dimensional gel electrophoresis Two-dimensional gel electrophoresis and proteomicsand proteomics蛋白質組學蛋白質組學不是一個封閉的、概念化的、穩定的不是一個封閉的、概念化的、穩定的知識體系知識體系,而是一個領域。而

55、是一個領域。它旨在闡明生物體全部蛋白質的它旨在闡明生物體全部蛋白質的表達模式表達模式及及功能功能模式模式，其內容包括蛋白質的定性鑒定、定量檢測、，其內容包括蛋白質的定性鑒定、定量檢測、細胞內定位、相互作用研究等，是連接基因組細胞內定位、相互作用研究等，是連接基因組序列與基因功能之間的橋梁。序列與基因功能之間的橋梁。 蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法雙向電泳（雙向電泳（2-DE）低氧蛋白質組的低氧蛋白質組的2-D電泳圖電泳圖 蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法n7.5.3.6 7.5.3.6 離子交換層析離子交換層析（Ion Exchange Chromatography，IEC）

56、蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法Ion Exchange ChromatographynIn ion exchange chromatography, proteins are separated on the basis of their overall (net) charge.nIf a protein has a net negative charge at pH7,it will bind to a column containing positively-charged beads, whereas a protein with no charge or a net pos

57、itive charge will not bind nThe negatively-charged proteins bound to such a column can then be eluted by washing the column with an increasing gradient (increasing concentration) of a solution of sodium chloride (Na+ Cl- ions) at the appropriate pH.Ion Exchange ChromatographynThe Cl- ion compete wit

58、h the protein for the positively-charged groups on the columnnProteins having a low density of negative charge elute first, followed by those with a higher density of negative charge.Ion Exchange Chromatography 離子交換層析是以離子交換層析是以離子交換劑離子交換劑為為固定相固定相，依據流動相中的依據流動相中的不同帶電組分不同帶電組分與交換劑上的平與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的能力的

59、差別（與離子衡離子進行可逆交換時的能力的差別（與離子交換劑結合力的差別）而進行分離的一種層析交換劑結合力的差別）而進行分離的一種層析方法。方法。 離子交換層析是生物化學領域中常用的離子交換層析是生物化學領域中常用的一種層析方法，廣泛的應用于各種生化物質如一種層析方法，廣泛的應用于各種生化物質如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。等的分離純化。蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法Ion Exchange Chromatographyn纖維素離子交換劑纖維素離子交換劑n交聯葡聚糖離子交換劑交聯葡聚糖離子交換劑n鹽濃度的微小變化就會直接影響它對蛋白質電鹽濃度的微小變

60、化就會直接影響它對蛋白質電荷吸附容量。荷吸附容量。 因此，蛋白質混合物的分離可以由改變溶液因此，蛋白質混合物的分離可以由改變溶液中的鹽離子強度和中的鹽離子強度和pHpH來完成。來完成。 梯度混合器梯度混合器蛋蛋白白質質的的分分離離純純化化方方法法Ion Exchange Chromatography離子交換層析的原理n離子交換層析是依據各種離子或離子化合物與離子交換劑離子交換層析是依據各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不同而進行分離純化的。的結合力不同而進行分離純化的。n離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合