1、第二章第二章 酶的生產酶的生產第一節 微生物酶的開發一、應用微生物開發酶的優點：一、應用微生物開發酶的優點： (1)微生物生長微生物生長快快、周期短。生產能力、周期短。生產能力 大，大，能滿足市場需求。能滿足市場需求。 (2)微生物種類微生物種類多多，不同的環境下的微生物，不同的環境下的微生物以特殊的代謝方式分解利用不同的底物。為以特殊的代謝方式分解利用不同的底物。為酶品種的多樣性提供了物質基礎。酶品種的多樣性提供了物質基礎。(3)通過基因工程使動植物細胞中的酶都能用通過基因工程使動植物細胞中的酶都能用微生物細胞獲得。因此，有計劃地篩選菌種，微生物細胞獲得。因此，有計劃地篩選菌種，可以生產幾乎

2、任何一種酶。可以生產幾乎任何一種酶。二、微生物酶開發的一般程序(一一) 樣品的采集樣品的采集 采樣的目的、采樣地點、采樣方法及采樣的數采樣的目的、采樣地點、采樣方法及采樣的數量。量。(二二) 菌種的分離菌種的分離 培養基的確定、培養條件的確定。培養基的確定、培養條件的確定。(三三) 菌種的初篩菌種的初篩 (1)用簡單的定性反應進行初篩；用簡單的定性反應進行初篩； (2) 最初分離階段給予特殊的培養基或培養條最初分離階段給予特殊的培養基或培養條 件，讓目的菌株大量繁殖。件，讓目的菌株大量繁殖。(四四) 菌種的復篩菌種的復篩 初篩之后，還要進行復篩。復篩的目的是篩初篩之后，還要進行復篩。復篩的目的

3、是篩選產酶量高、性能更符合生產要求的菌種。選產酶量高、性能更符合生產要求的菌種。 酶活的測定方法的建立對其很重要。酶活的測定方法的建立對其很重要。(五五) 對復篩獲得菌株的要求對復篩獲得菌株的要求 (1)不是致病菌；不是致病菌； (2)菌株不易變易和退化；菌株不易變易和退化； (3)不易感染噬菌體；不易感染噬菌體； (4)微生物產酶量高；微生物產酶量高； (5)酶的性質符合應用需要，最好是胞外酶；酶的性質符合應用需要，最好是胞外酶； (6) 便于分離和提取，得率高；便于分離和提取，得率高； (7)微生物培養營養要求低。微生物培養營養要求低。(六六) 最佳產酶條件的初步確定最佳產酶條件的初步確定

4、 (1)培養方式的確定；培養方式的確定； (2)最佳培養條件組合；最佳培養條件組合； (3) 產酶特性產酶特性(胞內酶、胞外酶胞內酶、胞外酶)； (4)微生物酶收集的時間順序；微生物酶收集的時間順序； (七七) 微生物產酶性能的進一步提高微生物產酶性能的進一步提高 (1)獲得高產菌種的突變體；獲得高產菌種的突變體； (2)利用代謝工程和代謝調節機理來提高酶產量；利用代謝工程和代謝調節機理來提高酶產量； (3)運用基因工程技術將原有菌株中目的基因轉運用基因工程技術將原有菌株中目的基因轉移到對生產環境更適應的菌株內，使其高效表移到對生產環境更適應的菌株內，使其高效表達；達； (八八) 微生物酶的提

5、取方法微生物酶的提取方法 (1)酶的粗提；酶的粗提； (2)酶的精制。酶的精制。 (九九) 微生物產酶菌種的保藏微生物產酶菌種的保藏 (1)斜面；斜面； (2)沙土管；沙土管； (3)冷凍。冷凍。 代謝流分析與控制 代謝工程是當今國際生化工程界的新興交叉學科，它將計算機技術、自動控制、基因操作技術與發酵工程結合起來，研究生產過程中細胞代謝流的分布，利用代謝控制理論和網絡剛性理論尋找限制代謝流率的代謝瓶頸和代謝網絡中制約轉化率提高的酶反應，為定向菌種選育和發酵控制提供思路。Glucose=G6PF6PGAPG3PPEPPyrAcCoADHAPRibu5PRib5PXyl5P1,6FDPSed7P

6、E4PaKGIsocitSucCoASucMalOaaGluGlnNADPHCO2CO2NH4+ATPCO2CO2GluGln=細胞膜CO2PEPPyr細胞膜ValLacAla谷氨酸與谷氨酰胺產生代謝網絡圖谷氨酸脫氫酶既可利用NADH作為其輔酶，也可利用NADPH作為其輔酶。形成谷氨酸形成谷氨酸谷氨酸谷氨酰-5-磷酸谷氨酰胺ATPADPNH4+Pi + H+E:谷氨酰胺合成酶形成谷氨酰胺形成谷氨酰胺谷氨酸棒桿菌產生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸代代謝網絡圖謝網絡圖由由 -酮戌二酸合成脯氨酸酮戌二酸合成脯氨酸谷氨酸激酶谷氨酸脫氫酶谷氨酰-半醛自動環化自動環化二氫吡咯二氫吡咯-5-羧酸還原酶羧酸

7、還原酶由由 -酮戌二酸合成精氨酸酮戌二酸合成精氨酸瓜氨酸氨甲酰磷酸轉乙酰基酶N-乙酰谷氨酸乙酰谷氨酸激酶N-乙酰-谷氨酰磷酸還原N-乙酰谷氨酸半醛轉氨酶N-乙酰鳥氨酸轉乙酰基酶鳥氨酸轉氨基甲酰酶精氨酸琥珀酸裂解酶生物酶技術專題生物酶技術專題( 2014最新版最新版) 固體培養法 好氧培養 搖瓶培養 液體培養法獲得單細胞 發酵罐（純培養） 厭氧培養（厭氧罐技術、滾管 技術、厭氧手套箱技術）一、微生物的培養方法第二節 微生物的培養一個微生物細胞一個微生物細胞合適的外界條件，吸收營養物質，進行代謝。合適的外界條件，吸收營養物質，進行代謝。如果同化作用的速度超過了異化作用如果同化作用的速度超過了異化作

8、用個體的生長個體的生長原生質的總量（重量、體積、大小）就不斷增加原生質的總量（重量、體積、大小）就不斷增加如果各細胞組分是按恰當的比例增長時，則達到一定程度后就如果各細胞組分是按恰當的比例增長時，則達到一定程度后就會發生繁殖，引起個體數目的增加。會發生繁殖，引起個體數目的增加。群體內各個個體的進一步生長群體內各個個體的進一步生長群體的生長群體的生長個體生長個體生長微生物細胞個體吸收營養物質，進行新微生物細胞個體吸收營養物質，進行新陳代謝，原生質與細胞組分的增加為個體生長。陳代謝，原生質與細胞組分的增加為個體生長。群體生長群體生長群體中個體數目的增加。可以用重量、群體中個體數目的增加。可以用重量

9、、體積、密度或濃度來衡量。體積、密度或濃度來衡量。（由于微生物的個體極（由于微生物的個體極小，所以常用群體生長來反映個體生長的狀況）小，所以常用群體生長來反映個體生長的狀況） 個體生長個體生長個體繁殖個體繁殖 群體生長群體生長 群體生長群體生長 = = 個體生長個體生長 + + 個體繁殖個體繁殖純培養純培養(pure culture)微生物學中把從一個細胞或一群相同的細胞經過培微生物學中把從一個細胞或一群相同的細胞經過培養繁殖而得到的后代養繁殖而得到的后代,稱純培養。稱純培養。二、微生物的同步生長及同步培養方法n同步培養法同步培養法：使培養基中所有微生物細胞：使培養基中所有微生物細胞處于相同的

10、生長階段的培養方法。處于相同的生長階段的培養方法。n同步生長同步生長：培養物中所有的微生物細胞都：培養物中所有的微生物細胞都處于同一生長階段，并能同時分裂的生長處于同一生長階段，并能同時分裂的生長方式。方式。化學誘導物理誘導誘導法誘導法過濾法區帶密度梯度離心法膜洗脫法篩選法篩選法同步培養法同步培養法獲得同步生長的方法：獲得同步生長的方法主要有兩類：獲得同步生長的方法主要有兩類：環境條件誘導法：環境條件誘導法：抗生素、變換溫度、光線、培養基等。造成抗生素、變換溫度、光線、培養基等。造成與正常細胞周期不同的周期變化。與正常細胞周期不同的周期變化。機械篩選法：機械篩選法：選擇性過濾、梯度離心或膜洗脫

11、法。選擇性過濾、梯度離心或膜洗脫法。物理方法，隨機選擇，不影響細胞代謝。物理方法，隨機選擇，不影響細胞代謝。 硝酸纖維素膜 法原理：原理：一些細菌細胞會緊緊粘附于具不同電荷的硝酸纖一些細菌細胞會緊緊粘附于具不同電荷的硝酸纖維微孔濾膜上。維微孔濾膜上。步驟：步驟：菌懸液通過微孔濾膜，細胞吸附其上；菌懸液通過微孔濾膜，細胞吸附其上； 反置濾膜，以新鮮培養液通過濾膜，洗掉浮游細胞；反置濾膜，以新鮮培養液通過濾膜，洗掉浮游細胞； 除去起始洗脫液后就可以得到剛剛分裂下來的新生細除去起始洗脫液后就可以得到剛剛分裂下來的新生細胞，即為同步培養。胞，即為同步培養。 這種細胞在培養過程中，一般經這種細胞在培養過

12、程中，一般經2 3個分裂周期就會喪失其同步性。個分裂周期就會喪失其同步性。 三、微生物生長繁殖的測定方法（一）測生長量 測體積（離心） 1.直接法 離心法（單細胞微生物） 稱干重 過濾法（絲狀微生物） 比濁法（分光光度計）2.間接法 含氮量 生理指標法 含碳量 DNA含量測定（二）計繁殖數 血球計數法 直接計數法 涂片計數法 涂布平板法 間接計數法 倒平板法四、微生物的群體生長一）無分支單細胞微生物的群體生長一）無分支單細胞微生物的群體生長G = t/n 1.特征：指數生長。特征：指數生長。2.典型生長曲線 （Growth curve） 延延滯滯期期對對數數期期穩定期穩定期衰亡期衰亡期時期的劃

13、分：按照生長速率常數時期的劃分：按照生長速率常數R（growth race constant）的不同）的不同又稱：停滯期、調整期、適應期又稱：停滯期、調整期、適應期1.現象：現象：活菌數沒增加，曲線平行于橫軸。活菌數沒增加，曲線平行于橫軸。2.特點：特點：生長速率常數生長速率常數R= 0細胞形態變大或增長細胞形態變大或增長細胞內細胞內RNA特別是特別是rRNA含量增高，原生質嗜堿性增強含量增高，原生質嗜堿性增強合成代謝活躍（核糖體、酶類、合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產生誘合成加快），易產生誘導酶導酶對外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素等化對外界不良條件敏感，（如

14、氯化鈉濃度、溫度、抗生素等化學藥物）學藥物）3.原因：原因：適應新的環境條件，合成新的酶，積累必要的中間產物適應新的環境條件，合成新的酶，積累必要的中間產物延滯期（lag phase）認識延遲期的特點及形成原因對實踐的指導意義：在發酵工業上需設法盡量縮短延遲期，措施有：在發酵工業上需設法盡量縮短延遲期，措施有：接種齡：采用對數生長期的接種齡：采用對數生長期的健壯菌種健壯菌種；增加接種量；一般來說，增加接種量；一般來說， 接種量增大可縮短甚至消接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發酵工業上一般采用除延遲期（發酵工業上一般采用1/10的的接種量接種量）；）； 調整培養基的成分，應適當豐富，且調整培養基

15、的成分，應適當豐富，且發酵培養基成發酵培養基成分分盡量與種子培養基的成分接近。盡量與種子培養基的成分接近。 對數期（logarithmic phase，指數期） 在生長曲線中，緊接著延滯期的一段細胞數目以幾在生長曲線中，緊接著延滯期的一段細胞數目以幾 何級數增長的時期。何級數增長的時期。其對數與時間呈直線關系。其對數與時間呈直線關系。 指數期的特點：指數期的特點： 生長速率常數生長速率常數R最大，即最大，即代時最短代時最短; 細胞進行細胞進行平衡生長平衡生長，菌體大小、形態、生理特征菌體大小、形態、生理特征 等比較一致等比較一致; 酶系活躍，代謝最旺盛酶系活躍，代謝最旺盛; 細胞對理化因素較敏

16、感。細胞對理化因素較敏感。指數期中的的三個重要參數n繁殖代數（繁殖代數（n） 指數生長方式：指數生長方式： 1、 2、4、8 2n 設接種時細胞數為設接種時細胞數為x1, 時間為時間為t1, 到時間到時間t2后，繁殖后，繁殖n代，細胞數為代，細胞數為x2，它們之間的相互關系為：它們之間的相互關系為： x2 = x12n以對數表示：以對數表示： x2 = x1 + n2 n = = 3.322( x2 - x1 ) x2 - x12x2x1t2t1培養時間培養時間Lg 細胞數細胞數/mlt2 - t13.322(lgx2-lgx1)生長速率常數生長速率常數R=t2 - t13.322(lgx2-

17、lgx1)代時代時G= 繁殖代數繁殖代數 n=3.322(lgx2-lgx1)代時代時在不同種微生物中的變化很大，多數微生物的代在不同種微生物中的變化很大，多數微生物的代時為時為13h，然而有些快速生長的微生物的代時還不到，然而有些快速生長的微生物的代時還不到10min,而另一些微生物的代時卻可長達幾小時或幾天；而另一些微生物的代時卻可長達幾小時或幾天； 另外，同一種微生物，在不同的生長條件下其代時的另外，同一種微生物，在不同的生長條件下其代時的長短也不同；但是，在一定條件下，每一種微生物的代長短也不同；但是，在一定條件下，每一種微生物的代時是恒定的，因此它是微生物菌種的一個重要特征。時是恒定

18、的，因此它是微生物菌種的一個重要特征。影響指數期微生物代時長短的因素（1）菌種：不同菌種其代時差別極大。）菌種：不同菌種其代時差別極大。 （2）營養成分：同一種微生物，在營養豐富的培養基上）營養成分：同一種微生物，在營養豐富的培養基上 生長時，其代時較短，反之則長。生長時，其代時較短，反之則長。 （3）營養物濃度：既影響微生物的生長速率，又影響它）營養物濃度：既影響微生物的生長速率，又影響它 的生長總量。的生長總量。 （濃度（濃度0.12.0mg/mL影響生長速影響生長速 率，濃度率，濃度2.08.0mg/mL時影響最終產量）時影響最終產量） （4）培養溫度：溫度對微生物的生長速率明顯的影響。

19、）培養溫度：溫度對微生物的生長速率明顯的影響。 營養物濃度與對數期生長速率和產量：影響微影響微生物的生長速率和生物的生長速率和總生長量。總生長量。：凡是處于較低濃度凡是處于較低濃度范圍內，可影響生范圍內，可影響生長速率和菌體產量長速率和菌體產量的營養物就稱生長的營養物就稱生長限制因子。限制因子。8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收只最大收獲量受影響獲量受影響生長速度和最大生長速度和最大收獲量受影響收獲量受影響時間時間細胞數或菌體量細胞數或菌體量應用意義：應用意義：指數期的微生物具有整個群體的生理

20、特性一致、細指數期的微生物具有整個群體的生理特性一致、細胞各成分平衡增長和生長速率恒定等優點，是：胞各成分平衡增長和生長速率恒定等優點，是：（1 1）用作代謝、生理等研究的良好材料；）用作代謝、生理等研究的良好材料；（2 2）是增殖噬菌體的最適宿主；）是增殖噬菌體的最適宿主；（3 3）是發酵工業中用種子的最佳材料。）是發酵工業中用種子的最佳材料。（4 4）進行染色、形態觀察等進行染色、形態觀察等的良好材料的良好材料。穩定期（stationary phase，恒定期、最高生長期）特點：特點：（1）R=0，即處于新繁殖的細胞數與衰亡的細胞數，即處于新繁殖的細胞數與衰亡的細胞數相等，或正生長與負生長

21、相等的動態平衡之中。相等，或正生長與負生長相等的動態平衡之中。培養培養物中的細胞數目達到最高值。物中的細胞數目達到最高值。（2）菌體產量達到了最高點；）菌體產量達到了最高點；（3）菌體產量與營養物質的消耗間呈現出有規律的比例關系）菌體產量與營養物質的消耗間呈現出有規律的比例關系（可用生長產量常數（可用生長產量常數Y生長得率來表示：表示微生物對生長得率來表示：表示微生物對基質利用效率的高低基質利用效率的高低 。Y=菌體干重菌體干重/ 消耗營養物質的濃度消耗營養物質的濃度 根據產量常數可確定微生物對營養物質的需要量根據產量常數可確定微生物對營養物質的需要量意義：消耗每意義：消耗每g或或mol營養物

22、質所產生的菌體干重（營養物質所產生的菌體干重（g）。）。（4）細胞內開始積聚糖原、異染顆粒和脂肪等內含物；）細胞內開始積聚糖原、異染顆粒和脂肪等內含物；（5）芽孢桿菌一般在這時開始形成芽孢；）芽孢桿菌一般在這時開始形成芽孢；（6）通過復雜的次生代謝途徑合成抗生素等對人類有用的各）通過復雜的次生代謝途徑合成抗生素等對人類有用的各種次生代謝物（穩定期產物）。種次生代謝物（穩定期產物）。Y=x x0C0 C=x x0C0穩定期到來的原因（1）營養物尤其是生長是限制因子耗盡；）營養物尤其是生長是限制因子耗盡；（2）營養物的比例失調；）營養物的比例失調；（3）酸、醇、毒素或）酸、醇、毒素或H2O2等有害

23、代謝產物的累積；等有害代謝產物的累積；（4）pH、氧化還原勢等物理化學條件越來越不適宜；等、氧化還原勢等物理化學條件越來越不適宜；等等等.生產實踐的重要指導意義（1 1）對以生產菌體或菌體生長相平行的代謝產物的最佳）對以生產菌體或菌體生長相平行的代謝產物的最佳收獲期；收獲期；（2 2）是對維生素、堿基、氨基酸等物質進行生物測定的）是對維生素、堿基、氨基酸等物質進行生物測定的最佳測定時期；最佳測定時期；（3 3）通過對穩定期到來原因的研究，促進了連續培養原）通過對穩定期到來原因的研究，促進了連續培養原理的提出和工藝、技術的創建。理的提出和工藝、技術的創建。衰亡期（decline phase）1、

24、特點：、特點：（1）細胞死亡數增加，死亡數大大超過新增殖的細胞數，群體中細胞死亡數增加，死亡數大大超過新增殖的細胞數，群體中的活菌數目急劇下降，出現的活菌數目急劇下降，出現“負生長負生長” （ R0 ） ；（2）細胞內顆粒更明顯，細胞出現多形態、畸形或衰退形；細胞內顆粒更明顯，細胞出現多形態、畸形或衰退形；（3）因菌體本身產生的因菌體本身產生的水解水解酶及代謝產物的作用，使菌體死亡、酶及代謝產物的作用，使菌體死亡、自溶等，發生自溶的菌生長曲線表現為向下跌落的趨勢。自溶等，發生自溶的菌生長曲線表現為向下跌落的趨勢。（4）有的微生物合成或釋放對人類有益的抗生素等次生代謝）有的微生物合成或釋放對人類

25、有益的抗生素等次生代謝（5）芽孢桿菌在此期釋放芽孢；等等。）芽孢桿菌在此期釋放芽孢；等等。 衰亡期比其他各時期時間衰亡期比其他各時期時間長，它的長短也與菌種和環境條件有關。長，它的長短也與菌種和環境條件有關。2、產生原因：、產生原因：生長條件的進一步惡化，使細胞內的分解代謝大生長條件的進一步惡化，使細胞內的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導致菌體的死亡大超過合成代謝，繼而導致菌體的死亡不立即繁殖不立即繁殖繁殖速度繁殖速度最快最快出生率等于死出生率等于死亡率亡率, ,活菌數活菌數最大最大, ,代謝產代謝產物大量積累物大量積累死亡超過死亡超過繁殖繁殖適應新環境適應新環境條件適宜條件適宜生存條生存條件

26、件開始惡開始惡化化生存條件生存條件極度惡化極度惡化代謝活躍代謝活躍, ,體體積增長較快積增長較快個體形態和個體形態和 生理特性穩定生理特性穩定有些種有些種類類出現芽出現芽孢孢出現畸變出現畸變與菌種和培與菌種和培養條件有關養條件有關生產用菌種生產用菌種科研材料科研材料改善和控改善和控制條件制條件, ,延延長穩定期長穩定期細胞裂解細胞裂解釋放產物釋放產物微生物群體生長的規律n生長曲線代表在新的適應環境中生長、分裂直至生長曲線代表在新的適應環境中生長、分裂直至衰老、死亡全過程的動態變化規律。分為遲緩期、衰老、死亡全過程的動態變化規律。分為遲緩期、對數期、穩定期和死亡期四個主要的時期。對數期、穩定期和

27、死亡期四個主要的時期。n生長曲線的不同時期反映的是群體而不是單個細生長曲線的不同時期反映的是群體而不是單個細胞的生長規律胞的生長規律。n認識和掌握微生物的生長曲線有重要的實踐意義。認識和掌握微生物的生長曲線有重要的實踐意義。如設法縮短遲緩期、延長對數期以及在穩定期收如設法縮短遲緩期、延長對數期以及在穩定期收集菌體。集菌體。二）絲狀微生物的群體生長絲狀微生物的純培養采用孢絲狀微生物的純培養采用孢子接種，在液體培養基中振子接種，在液體培養基中振蕩培養或深層通氣加攪拌培蕩培養或深層通氣加攪拌培養，菌絲體通過斷裂繁殖不養，菌絲體通過斷裂繁殖不形成產孢結構。形成產孢結構。以菌絲干重作為衡量生長的以菌絲干

28、重作為衡量生長的指標，即以時間為橫坐標，指標，即以時間為橫坐標，以菌絲干重為縱坐標，繪制以菌絲干重為縱坐標，繪制生長曲線。生長曲線。培養時間與菌絲體干重的立培養時間與菌絲體干重的立方根成直線關系。方根成直線關系。可分為三個階段：可分為三個階段：1、停滯期（生長延滯期）、停滯期（生長延滯期）2、迅速生長期（快速生長期）、迅速生長期（快速生長期）3、衰亡期（生長衰退期）、衰亡期（生長衰退期）1、生長停滯期、生長停滯期: 造成生長停滯的原因一是孢子萌發前真正的造成生長停滯的原因一是孢子萌發前真正的停滯狀態，另一種是生長已經開始，但還無法測定。停滯狀態，另一種是生長已經開始，但還無法測定。2、迅速生長

29、期、迅速生長期:菌絲體干重迅速增加，其立方根與時間呈直菌絲體干重迅速增加，其立方根與時間呈直線關系，菌絲干重不以幾何級數增加，沒有對數生長期。生線關系，菌絲干重不以幾何級數增加，沒有對數生長期。生長主要表現在菌絲尖端的伸長和出現分支、斷裂等，此時期長主要表現在菌絲尖端的伸長和出現分支、斷裂等，此時期的菌體呼吸強度達到高峰，有的開始積累代謝產物。的菌體呼吸強度達到高峰，有的開始積累代謝產物。3、衰退期、衰退期:菌絲體干重下降，到一定時期不再變化。大多數菌絲體干重下降，到一定時期不再變化。大多數次級代謝產物在此期合成，大多數細胞都出現大的空泡。有次級代謝產物在此期合成，大多數細胞都出現大的空泡。有

30、些菌絲體還會發生自溶菌絲體，這與菌種和培養條件有關。些菌絲體還會發生自溶菌絲體，這與菌種和培養條件有關。絲狀微生物的群體生長五、微生物的連續培養（continuous culture）分批培養分批培養（batch culture） ：將微生物置于一定容積的定量：將微生物置于一定容積的定量的培養基中培養，培養基一次性加入。不再補充和更換，最的培養基中培養，培養基一次性加入。不再補充和更換，最后一次性收獲。后一次性收獲。連續培養連續培養（continuous culture） ：在微生物培養的過程中，：在微生物培養的過程中，不斷地供給新鮮的營養物質，同時排除含菌體及代謝產物的不斷地供給新鮮的營養物

31、質，同時排除含菌體及代謝產物的發酵液，讓培養的微生物長時間地處于對數生長期，以利于發酵液，讓培養的微生物長時間地處于對數生長期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩定狀態。微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩定狀態。連續培養連續培養理論基礎理論基礎：由于對典型生長曲線中穩定期到來原因：由于對典型生長曲線中穩定期到來原因的認識，采取相應有效措施推遲其來臨，從而發展出現在的的認識，采取相應有效措施推遲其來臨，從而發展出現在的連續培養技術。連續培養技術。當微生物在單批培養方式下生長達到對數期后期時，一方當微生物在單批培養方式下生長達到對數期后期時，一方面以一定的速度流進新鮮培養基并攪拌，另一方

32、面以溢流方式面以一定的速度流進新鮮培養基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養液，使培養物達到動態平衡，其中的微生物就能長期流出培養液，使培養物達到動態平衡，其中的微生物就能長期保持對數期的平衡生長狀態和穩定的生長速率。保持對數期的平衡生長狀態和穩定的生長速率。單批培養單批培養 恒濁法恒濁法恒化法恒化法 單批培養單批培養連續培養連續培養時間時間連續流入連續流入新鮮培養液新鮮培養液lg細胞數（個細胞數（個/ml）連續培養連續培養 （一）連續培養原理連續連續培養培養器器按控制方式分按控制方式分按培養器的級數分按培養器的級數分按細胞狀態分按細胞狀態分按用途分按用途分內控制（控制菌體密度）：恒濁器內控制（

33、控制菌體密度）：恒濁器外控制（控制培養液流速、以控制外控制（控制培養液流速、以控制生長速率）：恒化器生長速率）：恒化器單級連續培養器單級連續培養器多級連續培養器多級連續培養器一般連續培養器一般連續培養器固定化細胞連續培養器固定化細胞連續培養器實驗室科研用：連續培養器實驗室科研用：連續培養器發酵生產用：連續發酵罐發酵生產用：連續發酵罐（二）連續培養器（三）連續培養技術1、恒化連續培養恒化連續培養概念概念：以恒定流速使營養物質濃度恒定而保持微生物：以恒定流速使營養物質濃度恒定而保持微生物始終在低于其最高生長速率的條件下達到連續培養。始終在低于其最高生長速率的條件下達到連續培養。原理：原理：通過控制

34、某一種營養物濃度通過控制某一種營養物濃度（如碳、氮源、生（如碳、氮源、生長因子等）長因子等） ，使其始終成為生長限制因子，而達到控，使其始終成為生長限制因子，而達到控制培養液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最制培養液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進行生長繁殖。高生長速率條件下進行生長繁殖。特點：特點：維持營養成分的維持營養成分的亞適量亞適量，控制微生物生長速率。，控制微生物生長速率。菌體生長速率恒定，菌體均一、密度穩定，產量低于菌體生長速率恒定，菌體均一、密度穩定，產量低于最高菌體產量。最高菌體產量。應用范圍：應用范圍：實驗室科學研究實驗室科學研究恒化器（Chemo

35、stat 或bactogen）概念：概念：根據培養器內微生物的根據培養器內微生物的生長密度，借光電控制系統來生長密度，借光電控制系統來控制培養液流速，以取得菌體控制培養液流速，以取得菌體高密度、生長速度恒定的微生高密度、生長速度恒定的微生物細胞。物細胞。原理原理：通過調節新鮮培養基流：通過調節新鮮培養基流入的速度和培養物流出的速度入的速度和培養物流出的速度來來維持菌液濃度不變維持菌液濃度不變,即濁度不即濁度不變變。當濁度高時，使新鮮培養。當濁度高時，使新鮮培養基的流速加快，濁度降低，則基的流速加快，濁度降低，則減慢培養基的流速。減慢培養基的流速。特點：特點：基質過量，微生物始終基質過量，微生物

36、始終以最高速率進行生長，以最高速率進行生長，并可在并可在允許范圍內控制不同的菌體密允許范圍內控制不同的菌體密度度；但工藝復雜，煩瑣。；但工藝復雜，煩瑣。2、恒濁培養使用范圍：使用范圍：用于生產大量菌用于生產大量菌體、生產與菌體生長相平行體、生產與菌體生長相平行的某些代謝產物，如乳酸、的某些代謝產物，如乳酸、乙醇等。乙醇等。裝置裝置控制對象控制對象培養基培養基培養基流培養基流速速生長生長速率速率產物產物應用范應用范圍圍恒濁器恒濁器菌體密度菌體密度（內控制（內控制）無限制生無限制生長因子長因子不恒定不恒定最高最高大量菌體或大量菌體或與菌體形成與菌體形成相平行的產相平行的產物物生產為生產為主主恒化器

37、恒化器培養基流培養基流速（外控速（外控制）制）有限制生有限制生長因子長因子恒定恒定低于低于最高最高不同生長速不同生長速率的菌體率的菌體實驗室實驗室為主為主恒濁器與恒化器的比較（四）連續發酵（continuous fermentation）將連續培養用于發酵，即為連續發酵。相對于單批發酵而言。將連續培養用于發酵，即為連續發酵。相對于單批發酵而言。SCPSCP的生產、乙醇、乳酸、丙酮和丁醇的發酵、石油脫蠟、污水處理等的生產、乙醇、乳酸、丙酮和丁醇的發酵、石油脫蠟、污水處理等應用。應用。優點：優點： 高效，簡化了操作裝料、滅菌、出料、清洗發酵罐等單元操作；高效，簡化了操作裝料、滅菌、出料、清洗發酵罐

38、等單元操作； 自控：便于利用各種儀表進行自動控制；自控：便于利用各種儀表進行自動控制； 產品質量穩定；產品質量穩定； 節約大量動力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、電的負荷均節約大量動力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、電的負荷均衡合理。衡合理。缺點：菌種易于退化；易于遭到雜菌污染；營養物利用率低于單批缺點：菌種易于退化；易于遭到雜菌污染；營養物利用率低于單批培養。培養。連續發酵的生產時間受以上因素限制，一般只能維持數月連續發酵的生產時間受以上因素限制，一般只能維持數月 1 1年年。第三節 酶發酵動力學發酵動力學：研究微生物生長、產物合成、底物消耗發酵動力學：研究微生物生長、產物合成、底物消耗之間之間

39、動態定量關系，定量描述動態定量關系，定量描述微生物微生物生長和產物生長和產物形成形成過程。過程。主要研究：主要研究：1 1、發酵動力學參數特征、發酵動力學參數特征：微生物生長速率、發酵產：微生物生長速率、發酵產物合成速率、底物消耗速率及轉換率、效率等；物合成速率、底物消耗速率及轉換率、效率等；2 2、影響發酵動力學參數的各種理化因子、影響發酵動力學參數的各種理化因子；3 3、發酵動力學的數學模型、發酵動力學的數學模型 研究發酵過程中細胞生長速度研究發酵過程中細胞生長速度, ,產物生成速度及產物生成速度及環境因素對這些速度的影響環境因素對這些速度的影響. .酶發酵動力學研究意義酶發酵動力學研究意

40、義: :了解酶生物合成模式、規律了解酶生物合成模式、規律發酵工藝條件優化控制，確定發酵工藝條件優化控制，確定最優發酵參數最優發酵參數，如：基質濃度、溫度、如：基質濃度、溫度、PHPH、溶氧等、溶氧等提高酶產量，效率和轉化率提高酶產量，效率和轉化率. .一、酶生物合成的模式細胞生長一般經細胞生長一般經4 4個階段個階段, ,如圖如圖: :細胞生長曲線細胞生長曲線根據酶的合成與細胞生長之間的關系，可將根據酶的合成與細胞生長之間的關系，可將酶的生物合成分酶的生物合成分3種模式種模式n生長偶聯型： 同步合成型 中期合成型n部分生長偶聯型：延期合成型n非生長偶聯型：滯后合成型酶生物合成的四種類型酶生物合

41、成的四種類型比較酶產生與細胞比較酶產生與細胞生長的關系生長的關系, ,可把可把酶生物合成模式分酶生物合成模式分成成4 4種類型種類型: :酶生物合成的四種類型（1 1）同步合成型：）同步合成型： 酶的合成與細胞的生長同步進行酶的合成與細胞的生長同步進行（2 2）延續合成型：）延續合成型： 酶的合成伴隨著細胞的生長而開始，生長進入平衡期酶的合成伴隨著細胞的生長而開始，生長進入平衡期后，酶又延續合成一段時間后，酶又延續合成一段時間（3 3）中期合成型）中期合成型 酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，進入平衡期酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，進入平衡期后，酶的合成隨之停止。后，酶的合成隨之停止。

42、 (4) (4) 滯后合成型滯后合成型 當細胞進入平衡期后，才開始并大量積累酶當細胞進入平衡期后，才開始并大量積累酶（1 1）酶的生物合成）酶的生物合成可以誘可以誘 導，不受分解代謝物導，不受分解代謝物 阻遏和反應產物阻遏阻遏和反應產物阻遏；（2 2）當除去誘導物或細胞）當除去誘導物或細胞進入平衡期后，酶的合成立進入平衡期后，酶的合成立即停止；即停止；（3 3）酶所對應的）酶所對應的mRNAmRNA很不很不穩定。穩定。同步合成型的特點同步合成型的特點在單寧（Tannins ）或沒食子酸的誘導（1 1）酶的合成可以誘導，不受分解代謝物或產物的阻遏；）酶的合成可以誘導，不受分解代謝物或產物的阻遏；

43、（2 2）酶所對應的）酶所對應的mRNAmRNA相當穩定，在生長平衡期后仍可繼續較長相當穩定，在生長平衡期后仍可繼續較長時間用于酶的合成。時間用于酶的合成。延續合成型的特點延續合成型的特點中期合成的特點中期合成的特點（1 1）酶的合成受）酶的合成受到反饋阻遏或分解到反饋阻遏或分解代謝物代謝物阻遏阻遏；（2 2）所對應的）所對應的mRNAmRNA不穩定。不穩定。（1 1）在對數生長期不）在對數生長期不合成酶（可能是受到合成酶（可能是受到分解代謝物阻遏的影分解代謝物阻遏的影響）；響）；（2 2）所對應的）所對應的mRNAmRNA穩穩定性高。定性高。滯后期合成型的特點滯后期合成型的特點（1 1）mR

44、NAmRNA的穩定性；的穩定性；（2 2）培養基中阻遏物存在與否。）培養基中阻遏物存在與否。總結：影響酶生物合成的模式的主要因素是：總結：影響酶生物合成的模式的主要因素是：（1 1）mRNAmRNA穩定性高，細胞停止生長后繼續合成其所對應的酶；穩定性高，細胞停止生長后繼續合成其所對應的酶；（2 2）mRNAmRNA穩定性差，酶的合成隨著細胞停止生長而終止；穩定性差，酶的合成隨著細胞停止生長而終止；（3 3）受某些物質阻遏，細胞生長一段時間或在平衡期后（解）受某些物質阻遏，細胞生長一段時間或在平衡期后（解除阻遏），開始合成酶。除阻遏），開始合成酶。（4 4）不受某些物質阻遏，酶的合成隨著細胞生長

45、而同步增長。）不受某些物質阻遏，酶的合成隨著細胞生長而同步增長。規規 律：律：（1 1）選擇最理想的酶合成模式）選擇最理想的酶合成模式延續合成型；延續合成型；（2 2）改造非理想模式）改造非理想模式 A A、同步合成型：適當降低發酵溫度，盡量提同步合成型：適當降低發酵溫度，盡量提 高相應的高相應的mRNAmRNA的穩定性；的穩定性； B B、滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝 物阻遏，使酶合成提早開始；物阻遏，使酶合成提早開始； C C、中期合成型：努力提高中期合成型：努力提高mRNAmRNA穩定性，解穩定性，解 除代謝物阻遏物。除代謝物阻遏物。選擇與改造

46、選擇與改造二、細胞生長動力學主要研究細胞生長速度及其受外界環境影響的規律。主要研究細胞生長速度及其受外界環境影響的規律。19501950年年, ,法國的法國的MonodMonod首先提出表述微生物生長的動力首先提出表述微生物生長的動力學方程學方程, ,細胞生長速率與細胞濃度成正比細胞生長速率與細胞濃度成正比. .Rx =dX/dt= X: 比生長速率比生長速率只存在一種限制性基質時只存在一種限制性基質時: :MonodMonod方程是基本的細胞生長動力學方程方程是基本的細胞生長動力學方程; ;從不同情況出發對其進行修飾從不同情況出發對其進行修飾. .nm為最大比生長速率, 即不因基質濃度變化而

47、改變的最大值;nKs為飽和常數，即在數量上相當于=0.5m時的S值。nKs值愈小，說明在低基質濃度范圍中，S對愈為敏感,而保持m的臨界S值愈低 dx/dt=(-D)X D：稀釋率稀釋率連續全混流反應器發酵過程中連續全混流反應器發酵過程中, ,穩態時游離細胞連穩態時游離細胞連續發酵的生長動力學方程續發酵的生長動力學方程: :D=0,分批發酵分批發酵;D細胞濃度下降細胞濃度下降,S升高升高, 回升回升; Dm X趨于零趨于零;MonodMonod方程與米氏方程相似方程與米氏方程相似, ,參數參數u um m與與KsKs也也可由雙倒數作圖法求出可由雙倒數作圖法求出. .雙倒數作圖法雙倒數作圖法三、產

48、酶動力學宏觀產酶動力學宏觀產酶動力學（非結構動力學）（非結構動力學）: :從整個發酵系統著眼從整個發酵系統著眼, ,研究群體細胞的產酶速率及其影響因素研究群體細胞的產酶速率及其影響因素 ；微觀產酶動力學微觀產酶動力學（結構動力學）（結構動力學）: :從細胞內部著眼從細胞內部著眼, ,研究細胞中酶合成速率其影響因素研究細胞中酶合成速率其影響因素 ；1、分類、分類研究細胞產酶速率及各因素對其的影響研究細胞產酶速率及各因素對其的影響. .X細胞濃度；細胞濃度；u細胞比生長速率；細胞比生長速率； 生長偶聯的比產酶系數；生長偶聯的比產酶系數； 非生長偶聯的比產酶速率。非生長偶聯的比產酶速率。2、宏觀產酶

49、動力學方程通式、宏觀產酶動力學方程通式dE/dt=(+)x（1 1）同步合成型：生長偶聯型）同步合成型：生長偶聯型 =0=0，dE/dt=dE/dt=X X（2 2）中期合成型：）中期合成型： 特殊生長偶聯型特殊生長偶聯型 =0=0，dE/dt=dE/dt= X X 有阻遏存在時，有阻遏存在時， =0 =0，無酶產生，無酶產生 dE/dt=dE/dt= 0 0 阻遏解除后才開始合成酶阻遏解除后才開始合成酶. .細胞產酶模式不同，產酶速率與細胞生長動力學關系也不同。細胞產酶模式不同，產酶速率與細胞生長動力學關系也不同。討論討論: :（3 3）滯后合成型：非生長偶聯型，）滯后合成型：非生長偶聯型，

50、 =0 , =0 , dE/dt=XdE/dt=X（4 4）延續合成型：部分生長偶聯型，）延續合成型：部分生長偶聯型， 00， 00 dE/dt=dE/dt= X+XX+X有關模型參數一般通過線性化處理及嘗試有關模型參數一般通過線性化處理及嘗試誤差法求出誤差法求出. .dE/dt=(+)xRA、Ri：有、無活性的阻遏蛋白；有、無活性的阻遏蛋白；Si、Sr：誘導物和阻遏物；誘導物和阻遏物；cc：環腺苷酸接受蛋白環腺苷酸接受蛋白CRP與環腺苷酸與環腺苷酸CAMP的復合物；的復合物；RSi：RA與與Si的結合物，不與操縱基因結合；的結合物，不與操縱基因結合；RSr：Ri與與Sr的結合物，可與操縱基因

51、結合，而使的結合物，可與操縱基因結合，而使 mRNA無法合成無法合成 。N：RNA的分解產物。的分解產物。附附:3、微觀產酶動力學、微觀產酶動力學（1）細胞內酶生物合成的一般模型）細胞內酶生物合成的一般模型（cf.P54)M：細胞中細胞中mRNA濃度（濃度（mol/L）E：細胞中酶濃度（細胞中酶濃度（U/L） ：細胞比生長速率（細胞比生長速率（h-1） 對非生長偶聯型對非生長偶聯型,u=0 （2）酶的生物合成速率）酶的生物合成速率dE/dt=K10M E假設細胞中假設細胞中K1和和DNA濃度為常數濃度為常數.mRNA濃度濃度: dM/dt=k7CC-k11N- Mcc濃度濃度: dCC/dt=

52、k4CRPcAMP-k-4CC- CCCRP濃度濃度: dCRP/dt=k1DNA-k4CRPcAMP+k-4CC- CRPn(注：注：M、CC、CRP與細胞生長有關）與細胞生長有關）（3）受分解代謝物阻遏的酶生物合成模型）受分解代謝物阻遏的酶生物合成模型假設假設K2和和DNA濃度為常數濃度為常數,ndM/dt=k8RSi-k11M- MndRSi/dt=k5RASi-k-5RSi- RSindRA/dt=k2DNA-k5RASi+k-5RSi- RA（4）誘導系酶合成模型）誘導系酶合成模型（CRP與與CAMP復合物的濃度足量或過量）復合物的濃度足量或過量）K3和和DNA濃度設定為常數：濃度設

53、定為常數：ndM/dt=k9Ri-k11M- MndRi/dt=k3DNA-k6RiSr+k-6RSr- RindRSr/dt=k6RiSr-k-6RSr- RSr（5）阻遏系酶合成模型）阻遏系酶合成模型動力學模型參數的估算是一項重要動力學模型參數的估算是一項重要又復雜的問題又復雜的問題;參數值是通過大量實驗數據分析估參數值是通過大量實驗數據分析估算出來的算出來的;數據呈隨機性數據呈隨機性,有時借助數學方法和有時借助數學方法和計算機計算機.實際發酵過程非常復雜實際發酵過程非常復雜,以上模型進行以上模型進行修正和發展才可修正和發展才可;第四節 固定化細胞發酵產酶又稱固定化活細胞、固定化增殖細胞又

54、稱固定化活細胞、固定化增殖細胞, ,用各種方法固用各種方法固定在載體上又能進行生長、繁殖和新陳代謝的細胞。定在載體上又能進行生長、繁殖和新陳代謝的細胞。是是7070年代后期年代后期(1978)(1978)發展起來的技術發展起來的技術; ;在發酵生產淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等胞外酶方面在發酵生產淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等胞外酶方面取得了成功。取得了成功。 固定化細胞：固定化細胞：一、固定化細胞發酵產酶的特點；一、固定化細胞發酵產酶的特點；二、固定化細胞生長和產酶動力學；二、固定化細胞生長和產酶動力學；三、固定化細胞發酵產酶的工藝條件控制。三、固定化細胞發酵產酶的工藝條件控制。本節主要內容：本節主

55、要內容：一、固定化細胞發酵產酶的特點1 1、提高產酶率：、提高產酶率：細胞密度增大細胞密度增大 生化反應加速生化反應加速 產酶率產酶率提高提高固定化細胞發酵產酶的特點2 2、可在高稀釋度下連續發酵：不影響固定化細胞、可在高稀釋度下連續發酵：不影響固定化細胞; ;3 3、基因工程菌的質粒穩定，不易丟失；、基因工程菌的質粒穩定，不易丟失；4 4、發酵穩定性好：細胞受載體保護，、發酵穩定性好：細胞受載體保護，pHpH和和T T適應性寬；適應性寬；5 5、縮短發酵周期，提高設備利用率；、縮短發酵周期，提高設備利用率；6 6、產品容易分離純化；、產品容易分離純化；7 7、適于胞外酶等胞外產物的生產。、適

56、于胞外酶等胞外產物的生產。二、固定化細胞發酵產酶的工藝條件控制與游離細胞發酵大同小異，需特別注意的幾個問題：與游離細胞發酵大同小異，需特別注意的幾個問題：1 1、固定化細胞的預培養、固定化細胞的預培養 先預培養，使固定在載體上的細胞生長繁殖，長好后，再用于發酵先預培養，使固定在載體上的細胞生長繁殖，長好后，再用于發酵產酶，其培養基和工藝條件可以相同或不同。產酶，其培養基和工藝條件可以相同或不同。2 2、溶解氧的供給、溶解氧的供給 由于受到載體的影響，使氧的供給成為主要的限制性因素。由于受到載體的影響，使氧的供給成為主要的限制性因素。解決辦法：解決辦法：（1 1）加大通氣量（強烈攪拌會破壞固定化細胞）；）加大通氣量（強烈攪拌會破壞固定化細胞）；（2 2）改變固定化載體，如少用瓊脂等對氧擴散不利的載體；）改變固定化載體，如少用瓊脂等對氧擴散不利的載體；（3 3）過氧化氫酶與細胞共固定化，培養基加入適量的）過氧化氫酶與細胞共固定化，培養基加入適量的H H2 2O O2 2；（4 4）降低培養基的濃度，以降