1、實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 凝膠過(guò)濾法使蛋白質(zhì)脫鹽凝膠過(guò)濾法使蛋白質(zhì)脫鹽山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)之生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)之【實(shí)驗(yàn)原理【實(shí)驗(yàn)原理】 凝膠層析又稱分子篩層析、排阻層析凝膠層析又稱分子篩層析、排阻層析或凝膠過(guò)濾，是以凝膠為載體或凝膠過(guò)濾，是以凝膠為載體，根據(jù)蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行分離和純化。行分離和純化。 該方法廣泛用于生物大分子的分離、純?cè)摲椒◤V泛用于生物大分子的分離、純化、濃縮等。化、濃縮等。【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?學(xué)習(xí)凝膠過(guò)濾法分離純化蛋白質(zhì)的原學(xué)習(xí)凝膠過(guò)濾法分離純化蛋白質(zhì)的原理與操作技術(shù)理與操

2、作技術(shù) 凝膠是一類(lèi)具有多孔立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的不溶凝膠是一類(lèi)具有多孔立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的不溶性珠狀顆粒。多是交聯(lián)的聚糖性珠狀顆粒。多是交聯(lián)的聚糖( (如葡聚糖或瓊脂如葡聚糖或瓊脂糖糖) )類(lèi)物質(zhì)，用它來(lái)進(jìn)行物質(zhì)分離，主要是根據(jù)類(lèi)物質(zhì)，用它來(lái)進(jìn)行物質(zhì)分離，主要是根據(jù)多孔凝膠對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量的物質(zhì)具有不同多孔凝膠對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量的物質(zhì)具有不同的排阻效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。的排阻效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。 葡聚糖凝膠的商品名稱為葡聚糖凝膠的商品名稱為Sephadex，它具有三維空間的，它具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，呈珠狀顆粒。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，呈珠狀顆粒。 本實(shí)驗(yàn)用本實(shí)驗(yàn)用G-25使蛋白質(zhì)與使蛋白質(zhì)與(NH4)2SO4分離，當(dāng)分離，當(dāng)?shù)?/p>

3、白質(zhì)的鹽溶液進(jìn)入葡聚糖凝膠時(shí)，小分子的蛋白質(zhì)的鹽溶液進(jìn)入葡聚糖凝膠時(shí)，小分子的(NH4)2SO4擴(kuò)散進(jìn)入擴(kuò)散進(jìn)入G-25的網(wǎng)孔中，而大分子的的網(wǎng)孔中，而大分子的蛋白質(zhì)因顆粒直徑大，不能進(jìn)入網(wǎng)孔中，被排阻蛋白質(zhì)因顆粒直徑大，不能進(jìn)入網(wǎng)孔中，被排阻在凝膠顆粒的外面。加入洗脫液洗脫時(shí)，因大分在凝膠顆粒的外面。加入洗脫液洗脫時(shí)，因大分子的蛋白質(zhì)從凝膠顆粒的間隙隨洗脫液向下流動(dòng)，子的蛋白質(zhì)從凝膠顆粒的間隙隨洗脫液向下流動(dòng)，首先被洗脫下來(lái)，而小分子的首先被洗脫下來(lái)，而小分子的(NH4)2SO4可以擴(kuò)散可以擴(kuò)散進(jìn)出凝膠顆粒的網(wǎng)孔之中，隨洗脫液移動(dòng)時(shí)受到進(jìn)出凝膠顆粒的網(wǎng)孔之中，隨洗脫液移動(dòng)時(shí)受到阻滯力較大，在

4、層析柱中移動(dòng)較慢，這樣蛋白質(zhì)阻滯力較大，在層析柱中移動(dòng)較慢，這樣蛋白質(zhì)與與(NH4)2SO4很容易地分離開(kāi)，從而達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)很容易地分離開(kāi)，從而達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)樣品脫鹽的目的樣品脫鹽的目的。 。凝膠過(guò)濾層析過(guò)程示意凝膠過(guò)濾層析過(guò)程示意圖圖【器材與試劑【器材與試劑】（一）器材（一）器材 1. 層析柱層析柱 (15mm300mm） 2. 鐵架臺(tái)鐵架臺(tái) 3. 滴定管夾滴定管夾 4. SephadexG25 5. 刻度吸管刻度吸管 （二）試劑（二）試劑 1. 樣品溶液樣品溶液 蛋白質(zhì)硫酸銨溶液蛋白質(zhì)硫酸銨溶液 2.10黃柳酸黃柳酸 3.鈉氏試劑鈉氏試劑 4.洗脫液（去離子水）洗脫液（去離子水）【實(shí)驗(yàn)操作【

5、實(shí)驗(yàn)操作】（一）凝膠的溶脹（一）凝膠的溶脹 取取Sephadex G25， 加入去離子水置室加入去離子水置室溫溶脹溫溶脹 24小時(shí)小時(shí)以上，反復(fù)傾以上，反復(fù)傾瀉去掉細(xì)顆粒，瀉去掉細(xì)顆粒，或沸水浴中煮沸或沸水浴中煮沸23小時(shí)，可去小時(shí)，可去除顆粒內(nèi)部的空除顆粒內(nèi)部的空氣及滅菌。氣及滅菌。（二）連接層析裝置二）連接層析裝置 1. 1. 先將層析柱垂直固定在鐵架臺(tái)上。先將層析柱垂直固定在鐵架臺(tái)上。 2. 2. 按下圖將各部位連接起來(lái)。按下圖將各部位連接起來(lái)。洗洗脫脫液液連連接接軟軟管管層層析析柱柱收收集集容容器器連連接接軟軟管管（三）裝柱與層析（三）裝柱與層析 1.1.裝柱裝柱 向?qū)游鲋凶⑷肷倭肯?/p>

6、向?qū)游鲋凶⑷肷倭肯疵撘海ㄈルx子水），將凝膠脫液（去離子水），將凝膠漿液沿玻棒緩慢傾入柱中漿液沿玻棒緩慢傾入柱中（注滿）。凝膠自然沉積約（注滿）。凝膠自然沉積約1 12cm 2cm 高度后打開(kāi)下端出高度后打開(kāi)下端出水口水口, ,待凝膠床面上升到約待凝膠床面上升到約3/43/4柱高停止。關(guān)閉出水口柱高停止。關(guān)閉出水口, ,靜置。靜置。 2.2.洗柱洗柱 通過(guò)細(xì)乳膠管小心地將燒杯中的洗脫液與層通過(guò)細(xì)乳膠管小心地將燒杯中的洗脫液與層析柱接通，然后擰松螺旋夾，讓洗脫液滴下沖洗析柱接通，然后擰松螺旋夾，讓洗脫液滴下沖洗層析柱，以除雜質(zhì)并使柱床均勻密實(shí)（此步也稱層析柱，以除雜質(zhì)并使柱床均勻密實(shí)（此步也稱作

7、平衡）。適當(dāng)時(shí)間后（流下的洗脫液體積一般作平衡）。適當(dāng)時(shí)間后（流下的洗脫液體積一般為柱床體積的為柱床體積的23倍），再擰緊螺旋夾。倍），再擰緊螺旋夾。 洗柱過(guò)程中注意調(diào)整流速約洗柱過(guò)程中注意調(diào)整流速約2ml/min。3.3.加樣與洗脫加樣與洗脫 用刻度吸管吸取用刻度吸管吸取1ml樣品（蛋白質(zhì)硫酸樣品（蛋白質(zhì)硫酸銨溶液），其尖頭小心沿層析柱內(nèi)壁伸到床面銨溶液），其尖頭小心沿層析柱內(nèi)壁伸到床面之上，慢慢將樣品加到凝膠床面上（不可攪動(dòng)之上，慢慢將樣品加到凝膠床面上（不可攪動(dòng)床面），此時(shí)能看到床面上樣品與洗脫液之間床面），此時(shí)能看到床面上樣品與洗脫液之間有一清晰界面。擰松螺旋夾，待樣品全部進(jìn)入有一清晰界面。擰松螺旋夾，待樣品全部進(jìn)入凝膠柱中凝膠柱中, 接通洗脫液，開(kāi)始洗脫并收集洗出接通洗脫液，開(kāi)始洗脫并收集洗出液。液。 用刻度離心管收集洗出液，每管收集用刻度離心管收集洗出液，每管收集1ml。 邊收集邊進(jìn)行蛋白質(zhì)與銨鹽的檢查。邊收集邊進(jìn)行蛋白質(zhì)與銨鹽的檢查。 （1）取洗出液）取洗出液2滴加入白瓷板穴中，加入鈉滴加入白瓷板穴中，加入鈉氏試劑氏試劑1滴，如有銨鹽洗脫下來(lái)，則有黃紅色沉滴，如有銨鹽洗脫下來(lái)，則有黃紅色沉淀。淀。