1、綜合實驗：多管發酵法測自來水大腸菌群組員：李妍、馬萬貴、石真真、李招柳、池小輝一、實驗目的1、 學習檢測水中大腸菌群的方法，了解大腸菌群數量與水質狀況的關系；2、 測定自來水是否符合飲用水的衛生標準；3、 培養學生自主設計并完成實驗的能力，激發學生的科研主動性與積極性；4、 通過實驗了解檢測水中大腸菌群的原理和方法。二、實驗原理大腸菌群一一能在37c24-48h內發酵乳糖產酸與產氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽抱桿菌，易于培養和觀察。糞便中存在大量的大腸菌群細菌，并且它們與水中存在的腸道病原菌成正相關性。水中病原菌濃度很低，測定手續復雜，工作人員還有被感染傳播的危險。所以檢測水的細菌學衛生標

2、準，通常檢測大腸菌群。多管發酵法包括初發酵、平板分離和復發酵3個部分。初發酵中發酵乳糖產酸、產氣，根據培養基內指示劑顏色變化及杜氏小管內有無氣體，判斷是否為陽性（液體培養基含有乳糖、蛋白月東和澳甲酚紫。由于許多細菌不能發酵乳糖，不生長，而大腸菌群可發酵乳糖產酸（有機酸），產氣（CQ+d）乳糖起選擇性碳源的作用。澳甲酚紫是PH指示劑（堿性條件：紫藍色；酸性條件：黃色，變色點PH=6.7）,當大腸菌群的細菌利用乳糖產酸后，使原來的PH由中性下降呈酸性，培養基從紫色變為黃色。另外，澳甲酚紫還具有抑制其他細菌（如芽抱桿菌）生長的作用）。平板分離一般利用大腸菌群在伊紅美藍（EMB培養基）上形成紫色金屬光

3、澤菌落并結合革蘭氏染色進行判斷（作為指示劑，大腸菌群發酵乳糖造成酸性環境時該兩種染料即結合成復合物，使大腸菌群產生帶核的、有金屬光澤的深紫色菌落。將符合大腸菌群菌落特征的菌落進行革蘭氏染色，只有染色為革蘭氏陰性、無芽胞桿菌的菌落，才是大腸菌群菌落）。最后進行復發酵進一步證實。三、實驗材料及用具1、 培養基：伊紅美藍培養基（EMB培養基）、乳糖蛋白月東半固體培養基、乳糖蛋白培養液、3倍濃縮乳糖蛋白月東培養液2、 溶液和試劑：革蘭氏染色液、無菌水3、 儀器及用具：三角瓶（2個）、發酵用試管（32個）、發酵用燒瓶（4個）、杜氏小管（36個）、培養皿（12個）、移液管、接種環、酒精燈、記號筆、油鏡四、

4、操作步驟（一）水樣的采取1、自來水：先將自來水龍頭用火焰燒灼3min滅菌，再開放水龍頭使水流5min后，以滅菌三角燒瓶接取水樣，以待分析2、池水：采用郵電學院噴泉水池中的水。取距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的帶塞玻璃瓶，瓶口向下浸人水中，然后翻轉過來，除去玻璃塞，水即流人瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。（二）多管發酵法檢測大腸菌群1、自來水的檢測（1）初發酵試驗接種水樣總量為300ml:在2個含有50ml3倍濃縮的乳糖蛋白月東培養液發酵燒瓶（內倒置杜氏小管）中，各加入100ml水樣。在10支含有5ml3倍濃縮乳糖蛋白月東培養液發酵管（內倒置杜氏小管）中，各加入10ml水樣。混

5、勻后，37c培養24h,24h未產氣的繼續培養至48ho（2）平板分離：取出培養后的發酵管，觀察管中顏色變為黃色者記錄為產酸，杜氏小管中有氣泡者記錄為產氣。將產酸產氣和只產酸的兩類發酵管（瓶）分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板上，37c下培養24h。挑選：深紫黑色、有金屬光澤；紫黑色、不帶或略帶金屬光澤；淡紫紅色、中心顏色較深的菌落（其初發酵管記錄為陽性）的一部分進行革蘭氏染色，鏡檢。（3）復發酵實驗：經涂片、染色、鏡檢，如果是革蘭氏陰性無芽抱桿菌，則挑取菌落的另一部分，重新接種于乳糖蛋白月東培養液的復發酵管（內倒置杜氏小管）中，每管可接種同一發酵管的典型菌落13個，37c培養24h。若為產酸產氣

6、者表明試管內有大腸菌群存在，記錄為陽性管，再根據初發酵實驗的陽性管（瓶）數查表9-10,即得總大腸菌群。表g-io大腸菌群槍數表接種水樣總量300ml100ml2份，10ml10份)100ml水量的陽性瓶敷卜。ml水黃的陽性管故0I_n比水樣中大腿菌群數1L水樣中大森菌群收IL水樣中大胸菌胖數10<3411138IS,27,1327311IE3841424525tS3070Gnn369272743J208315】6Ig36股2304069>230；2、池水的檢測(1)將水樣稀釋成10-1與10.2.分別吸取lml101與10-2的稀釋水樣和lml原水樣，各注入裝有10ml乳糖蛋白月

7、東培養液發酵管中。另取10ml和100ml原水樣，分別注人裝有5ml和50ml三倍濃縮乳糖蛋白月東發酵液的試管(瓶)中。(3)初發酵實驗、平板分離和復發酵實驗(4)發酵結果查閱接種水樣總量為111.11ml檢索表。表XVT大腦備檢立惠接種水樣牯|111ml(tOOmL10mL1ml.0.EmlX1價)接腫水一P/ml每升水樣中100IQ10,1大腸藻腓載一一<9一一4-9一+.石.一9.5+IB+一4-19.一+|=工工+一23-*2»+92一+一194+*iMfi+*一一230+*M)1+.十一23X0*一1+73HO*”大1b”發陽性-*大及解炭斛性一五、結果記錄1、自來水多管發酵法實驗結果記錄初發醉管數產酸產氣管數只產酸管數陽性管數復發酵陽性管數10大腸菌群數：2、池水多管發酵法實驗結果記錄