1、生物化學實驗生物化學實驗 張志紅張志紅, ,付永貴付永貴張志紅TEL:22361599:付永貴 : 25119146: 主要內容主要內容 緒論 實驗室普通規那么及實驗室平安 實驗報告的撰寫及實驗成果的評定 本學期實驗內容及布置 實驗一 蛋白質沉淀、變性反響生物化學實驗室規那么11 1、遵守紀律，不得無故遲到、早退、大聲談笑。、遵守紀律，不得無故遲到、早退、大聲談笑。2 2、預習，熟習實驗目的、原理、步驟。、預習，熟習實驗目的、原理、步驟。3 3、嚴厲聽從教師的指點，及時記錄實驗原始數據。、嚴厲聽從教師的指點，及時記錄實驗

2、原始數據。4 4、實驗場所整潔、公用試劑用后放回原位，實驗終了，清洗、實驗場所整潔、公用試劑用后放回原位，實驗終了，清洗實驗器皿、拾掇臺面，方可分開。實驗器皿、拾掇臺面，方可分開。5 5、留意節約試劑，防止損壞儀器。運用貴重儀器時，嚴厲遵、留意節約試劑，防止損壞儀器。運用貴重儀器時，嚴厲遵守操作規程，發現缺點，立刻報告教師，不得擅自檢修。守操作規程，發現缺點，立刻報告教師，不得擅自檢修。生物化學實驗室規那么26 6、乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加熱，遠離火源操作及放置。、乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加熱，遠離火源操作及放置。 7 7、一切廢液、廢棄物等，均搜集在指定容器內，不得倒在水槽

3、內或四、一切廢液、廢棄物等，均搜集在指定容器內，不得倒在水槽內或四處亂仍。強酸和強堿不能直接倒在水槽中，應先稀釋，然后倒入水處亂仍。強酸和強堿不能直接倒在水槽中，應先稀釋，然后倒入水槽，再用大量自來水沖洗水槽及下水道。槽，再用大量自來水沖洗水槽及下水道。8 8、室內嚴禁吸煙！煤氣、水管用完即關。、室內嚴禁吸煙！煤氣、水管用完即關。Long hair should be tied back to avoid burns. In addition, Long hair should be tied back to avoid burns. In addition, avoid wearing lo

4、ose articles of clothing such as ties or avoid wearing loose articles of clothing such as ties or dangling jewelry that may come into contact with dangling jewelry that may come into contact with laboratory surfaces.laboratory surfaces.實驗室平安實驗室平安-平安用電平安用電 運用電學儀器時，要留意電壓、電流能否符合儀器的要求，運用電學儀器時，要留意電壓、電流能否

5、符合儀器的要求，必要時需運用穩壓設備。必要時需運用穩壓設備。 嚴厲按照電器運用規程操作，不能隨意裝配，擺弄電器。嚴厲按照電器運用規程操作，不能隨意裝配，擺弄電器。 嚴防觸電。絕不可用濕手或眼睛旁視時開電閘和電器開關。嚴防觸電。絕不可用濕手或眼睛旁視時開電閘和電器開關。檢查電器設備能否漏電時，應運用試電筆。凡是漏電儀器一檢查電器設備能否漏電時，應運用試電筆。凡是漏電儀器一概不能運用。概不能運用。實驗室平安實驗室平安-防止火災防止火災 起火的緣由：有電流短路，不平安地運用電爐、煤氣燈起火的緣由：有電流短路，不平安地運用電爐、煤氣燈和易燃易爆藥物著火。和易燃易爆藥物著火。 實驗必需配備一定數量的消防

6、器材，請按消防規定保管實驗必需配備一定數量的消防器材，請按消防規定保管運用，最重要的是每個實驗者都應有實驗室平安觀念，運用，最重要的是每個實驗者都應有實驗室平安觀念，時辰堅持警惕。時辰堅持警惕。 實驗室內嚴禁儲存大量的易燃物如乙醚、丙酮、乙醇實驗室內嚴禁儲存大量的易燃物如乙醚、丙酮、乙醇，苯等。，苯等。 必需存放的少量即將運用的易燃物，也應將它放在遠離必需存放的少量即將運用的易燃物，也應將它放在遠離火源處，火焰熄滅后才可大量傾倒這些液體。火源處，火焰熄滅后才可大量傾倒這些液體。 低沸點的有機溶劑不準在火焰上直接加熱，只能利用帶低沸點的有機溶劑不準在火焰上直接加熱，只能利用帶回流冷凝管的安裝在水

7、浴上加熱或蒸餾。回流冷凝管的安裝在水浴上加熱或蒸餾。 實驗室平安實驗室平安-防止火災防止火災實驗室平安實驗室平安- 防止火災防止火災2020.03.13 2020.03.13 東南大學東南大學2007.03.28 2007.03.28 蘭州理工大學蘭州理工大學名稱名稱 沸點沸點/ 閃點閃點/自燃點自燃點/乙醚乙醚 34.5 34.54040180180丙酮丙酮 56 561717538538二硫化碳二硫化碳 46 463030100100苯苯 80 801111乙醇乙醇 78 78 12 12400400閃點：液體外表的蒸汽和空氣的混合物在遇明火或火花時著火的最低溫度。閃點：液體外表的蒸汽和空

8、氣的混合物在遇明火或火花時著火的最低溫度。自燃點：液體蒸汽在空氣中自燃時的溫度。自燃點：液體蒸汽在空氣中自燃時的溫度。常見有機溶劑的易燃性常見有機溶劑的易燃性不能放冰箱中儲存！不能在火源附近儲存、操作！不能放冰箱中儲存！不能在火源附近儲存、操作！易燃物蒸汽在空氣中的爆炸極限易燃物蒸汽在空氣中的爆炸極限名稱爆炸極限體積百分數乙醚1.936.5丙酮2.613乙醇3.319氫氣4.174.2甲醇6.736.5乙炔382實驗室內嚴禁儲存大量的易燃物！實驗室內嚴禁儲存大量的易燃物！實驗室平安實驗室平安-嚴防中毒嚴防中毒 化學試劑有相對無毒、中度毒性和劇毒之分，在處置劇毒藥物時要特別慎重、小心。國際上常用

9、某些標志標示不同毒型的化學藥品。 運用毒性物質和致癌物必需根據試劑瓶上標簽闡明嚴厲操作，平安稱量、轉移和保管。操作戴手套，必要時戴口罩或防毒面具，并在通風櫥中進展。沾過毒性、致癌物的容器應單獨清洗 、處置。實驗室平安實驗室平安-嚴防中毒嚴防中毒 水銀溫度計、氣量計等汞金屬設備破損時必需立刻采取措施回收汞，并在污染處撒上一層硫磺粉以防汞蒸氣中毒，留意室內通風 。警告標志有輻射性有輻射性 平安公告平安公告生物危險品生物危險品高度可燃的高度可燃的爆炸性的爆炸性的危險化學藥品標志危險化學藥品標志有毒的有毒的腐蝕性的腐蝕性的刺激性有害的刺激性有害的有氧化作用的有氧化作用的氯化鈉氯化鈉優級純優級純化學藥品

10、的質量標簽化學藥品的質量標簽氯化鈉氯化鈉分析純分析純化學藥品的質量標簽化學藥品的質量標簽氯化鈉氯化鈉化學純化學純化學藥品的質量標簽化學藥品的質量標簽實驗室平安實驗室平安-防止燒傷和創傷防止燒傷和創傷 運用玻璃、金屬器材時留意防止割傷及機械創傷。如發生不測，找實驗室任務人員少量急用藥物備用。 濃酸、濃堿腐蝕性很強，必需極為小心地操作。用吸量管量取這些試劑包括有毒物時，必需運用橡皮球，絕對不能用口汲取。 實驗室平安實驗室平安-預防生物危害預防生物危害 微生物、動物的組織、細胞培育物、微生物、動物的組織、細胞培育物、血液和分泌物血液和分泌物 都能夠存在細菌和病都能夠存在細菌和病毒感染的潛在危害，處置

11、生物資料必毒感染的潛在危害，處置生物資料必需小心慎重，做完實驗必需用肥皂、需小心慎重，做完實驗必需用肥皂、洗滌劑或消毒液洗手。洗滌劑或消毒液洗手。 被污染的物品，必需進展高壓消毒或被污染的物品，必需進展高壓消毒或燒成灰燼。燒成灰燼。 被污染的玻璃器具應在清洗和高壓消被污染的玻璃器具應在清洗和高壓消毒前立刻浸泡在適當的消毒液中。毒前立刻浸泡在適當的消毒液中。實驗室急救實驗室急救 1機械損傷：立刻止血，到醫院診治。強堿：先用大量自來水沖洗，再用5%硼酸溶液或 2%乙酸溶液涂洗。強酸：大量自來水沖洗，再以5%碳酸氫鈉溶液洗滌。酚： 用酒精洗滌。煤氣中毒：立刻到室外，嚴重者就醫。實驗室急救實驗室急救

12、2 玻璃割傷：檢查傷口內有無玻璃碎片，硼酸水洗凈， 涂擦碘酒或紅汞水，必要時用紗布包扎。 燙傷：濃酒精消毒，涂上苦味酸軟膏。 觸電：封鎖電源 用干木棍使電線與被害者分開。 著火： 汽油、乙醚等有機溶劑：石棉布、沙土 電線：切斷電源或用四氯化碳滅火器 衣服：勿奔走，濕衣包裹或躺地滾動。實驗報告的撰寫實驗報告的撰寫 實驗報告分為以下幾部分：實驗報告分為以下幾部分： 原理原理 實驗步驟實驗步驟 結果與討論結果與討論 問答問答 實驗成果的評定：實驗成果的評定： 實驗報告實驗報告 平常操作、表現平常操作、表現姓名，班級，學號，課室，實驗時間、實驗教師實驗內容及布置實驗內容及布置 72學時學時 1、緒論、

13、蛋白質沉淀、變性反響、緒論、蛋白質沉淀、變性反響 9月月26-272、蛋白質濃度測定、蛋白質濃度測定考馬斯亮藍法考馬斯亮藍法 10月月10-113、 陽離子交換樹脂層析分別氨基酸陽離子交換樹脂層析分別氨基酸 10月月17-184、血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳、血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳 10月月24-255、聚丙烯酰胺凝膠電泳分別血清蛋白、聚丙烯酰胺凝膠電泳分別血清蛋白 10月月31-11月月16、影響酶促反響速度要素、影響酶促反響速度要素最適最適pH、激活劑抑制劑、激活劑抑制劑 11月月7-87、脂肪酶活性的測定、脂肪酶活性的測定 11月月14-158、過氧化氫酶米氏常數測定、過氧化氫酶米氏常

14、數測定 11月月21-22實驗內容及布置續實驗內容及布置續9、 糖的定量測定糖的定量測定 11月月28-2910、 維生素維生素C的定量測定的定量測定 12月月5-611、 脂肪酸脂肪酸B氧化作用氧化作用 12月月12-1312、轉氨基作用、轉氨基作用 12月月19-2013、魚類、魚類DNA的提取的提取 12月月26-2714、核酸濃度測定、核酸濃度測定UV吸收法吸收法 1月月2-315、聚合酶鏈式反響、聚合酶鏈式反響PCR 1月月2-316、 DNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳 1月月9-10一、實驗目的一、實驗目的 1 1、了解蛋白質的一些理化性質，認識蛋白、了解蛋白質的一些理化性質

15、，認識蛋白質的質的 可逆反響和不可逆反響。可逆反響和不可逆反響。 2 2、了解蛋白質的沉淀反響、變性作用和、了解蛋白質的沉淀反響、變性作用和凝固作用的凝固作用的 原理及它們的相互關系。原理及它們的相互關系。實驗一實驗一 蛋白質沉淀、變性反響蛋白質沉淀、變性反響 蛋白質是由氨基酸組成的大分子化合物蛋白質是由氨基酸組成的大分子化合物, 其分子量頗大，其分子量頗大，介于一萬到百萬之間，是一種親水膠體。介于一萬到百萬之間，是一種親水膠體。 蛋白質分子外表的親水基團蛋白質分子外表的親水基團-OH,-COOH,-NH3,以及肽鍵以及肽鍵等，在水溶液中能與水分子起水化作用等，在水溶液中能與水分子起水化作用H

16、ydration，使蛋，使蛋白質分子外表構成一個水化層。每克蛋白質分子能結合白質分子外表構成一個水化層。每克蛋白質分子能結合0.3-0.5克水。克水。 蛋白質分子外表上的可解離基團，在適當的蛋白質分子外表上的可解離基團，在適當的PH條件下，都條件下，都帶有一樣的凈電荷，與其周圍的反離子構成穩定的雙電層。帶有一樣的凈電荷，與其周圍的反離子構成穩定的雙電層。二、實驗原理二、實驗原理 由于蛋白質溶液具有水化層和雙電層兩方面的穩定要素，由于蛋白質溶液具有水化層和雙電層兩方面的穩定要素，所以膠體系統是相當穩定的。所以膠體系統是相當穩定的。 在一定物理化學要素如鹽析、重金屬離子、有機酸、無在一定物理化學要

17、素如鹽析、重金屬離子、有機酸、無機酸和加熱影響下機酸和加熱影響下, ,蛋白質顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，蛋白質顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，以固態方式從溶液中析出，這個過程稱為蛋白質的沉淀反響。以固態方式從溶液中析出，這個過程稱為蛋白質的沉淀反響。這種反響可分為兩種類型：這種反響可分為兩種類型：1 1、可逆沉淀反響：蛋白質分子內部構造并未發生顯著變化，根、可逆沉淀反響：蛋白質分子內部構造并未發生顯著變化，根本堅持本堅持 原有的性質，沉淀要素除去后，能溶于原來原有的性質，沉淀要素除去后，能溶于原來的溶劑中。的溶劑中。2 2、不可逆沉淀反響：蛋白質分子內部構造、空間構象遭到破壞，、不可逆沉淀反響

18、：蛋白質分子內部構造、空間構象遭到破壞， 失去原來的天然性質。失去原來的天然性質。蛋白質溶液的沉淀穩定是相對的，有條件的。假設條件發生改動，破壞了蛋白質溶液的穩定性，蛋白質就會從溶液中沉淀出來。蛋白質分子外表蛋白質分子外表水化層水化層雙電層雙電層穩定的親水膠穩定的親水膠脫水，失去電荷脫水，失去電荷沉淀反響沉淀反響可逆沉淀反響可逆沉淀反響不變性沉淀反響不變性沉淀反響如：鹽析作用如：鹽析作用不可逆沉淀反響不可逆沉淀反響變性沉淀反響變性沉淀反響如：重金屬鹽沉淀作用如：重金屬鹽沉淀作用蛋白質沉淀變性的常見方法蛋白質沉淀變性的常見方法常用方法常用方法原理原理常用試劑常用試劑實用實用鹽析鹽析破壞蛋白質膠體

19、溶液的水化層和電荷破壞蛋白質膠體溶液的水化層和電荷層層 NH42S04、Na2S04、Na3P04、NaCl、MgS04常用此法來分別和純化蛋白質。常用此法來分別和純化蛋白質。有機試劑鹽有機試劑鹽析析脫水作用；降低水的介電常數和蛋白脫水作用；降低水的介電常數和蛋白質溶解度；蛋白質析出質溶解度；蛋白質析出乙醇、丙酮、甲醇乙醇、丙酮、甲醇低溫乙醇提取血液中的蛋白質組低溫乙醇提取血液中的蛋白質組分分強酸、強堿強酸、強堿沉淀沉淀破壞蛋白質分子構造發生蛋白質變性破壞蛋白質分子構造發生蛋白質變性鹽酸鹽酸, , 硫酸硫酸, , 硝酸、氫硝酸、氫氧化鈉氧化鈉 滅活病毒滅活病毒加熱加熱變性變性雞蛋、肉類等加工雞

20、蛋、肉類等加工重金屬鹽沉重金屬鹽沉淀淀變性；生成不溶性鹽變性；生成不溶性鹽Ag+Ag+，Hg2+Hg2+，Cu2+Cu2+和和Pb2+Pb2+臨床上常用蛋清或牛乳挽救誤服臨床上常用蛋清或牛乳挽救誤服重金屬鹽的病人重金屬鹽的病人有機酸沉淀有機酸沉淀生成不溶性鹽生成不溶性鹽苦味酸、鞣酸、三氯醋酸、苦味酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水楊酸等生物堿試劑磺基水楊酸等生物堿試劑沉淀蛋白濾液等沉淀蛋白濾液等三、實驗資料及設備三、實驗資料及設備蛋白質溶液：取蛋白質溶液：取10ml鮮雞蛋清，用蒸餾水稀釋至鮮雞蛋清，用蒸餾水稀釋至100ml，攪，攪拌后用拌后用4-8層紗布過濾，新穎配制。層紗布過濾，新穎配制。蛋白質氯化

21、鈉溶液：取蛋白質氯化鈉溶液：取20ml蛋清，加蒸餾水蛋清，加蒸餾水200ml和飽和氯和飽和氯化鈉溶液化鈉溶液l00ml，充沛攪勻后用，充沛攪勻后用4-8層紗布濾去不溶物層紗布濾去不溶物加氯化鈉的目的是溶解球蛋白。加氯化鈉的目的是溶解球蛋白。 1. 資料資料2. 試劑3%硝酸銀，0.5%乙酸鉛，10%三氯乙酸溶液，飽和硫酸銨溶液，10%氫氧化鈉溶液，濃鹽酸，濃硫酸，濃硝酸，5%磺基水楊酸，0.1%硫酸銅，飽和硫酸銅溶液，0.1%乙酸，10%乙酸，飽和氯化鈉溶液，硫酸銨粉。3. 器材水浴鍋,漏斗,濾紙,吸管,試管及試管架,量筒等。四、實驗內容四、實驗內容1. 蛋白質的可逆反響蛋白質的可逆反響蛋白質

22、的鹽析蛋白質的鹽析步驟步驟現象現象解釋結論解釋結論取一支試管，參與3mL蛋白質氯化鈉溶液和等量的飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置10分鐘觀察有無蛋白質球蛋白的沉淀過濾后，向濾液中參與硫酸銨粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，直至粉末不再溶解，直至飽和觀察有無沉淀清蛋白析出靜置，棄去上清液，取出部分清蛋白，加少量蒸餾水觀察沉淀的再溶解操作現象操作現象Tube 11mL蛋白質溶液 3-4滴3%硝酸銀溶液 過量的硝酸銀 Tube 21mL蛋白質溶液 1-3滴0.5%乙酸鉛 過量的乙酸鉛 Tube 31mL蛋白質溶液 3-4滴0.1%硫酸銅 過量的硫酸銅 2. 蛋白質的不可逆反響蛋白質的不可逆反響2.1. 重金屬離子沉淀蛋白質重金屬離子沉淀蛋白質3支支試管試管操作現象Tube 10.5mL蛋白質溶液數滴10%三氯乙酸溶液 Tube 20.5mL蛋白質溶液數滴5%磺基水楊酸2. 蛋白質的不可逆反響蛋白質的不可逆反響2.2 有機酸沉淀蛋白質有機酸沉淀蛋白質2支試支試管管操作現象操作現象Tube 1 15滴濃鹽酸 沿管壁參與6滴