1、1熒光光譜的原理及應用熒光光譜的原理及應用2熒光熒光是指一種是指一種光致發光光致發光的冷發光現象。的冷發光現象。當某種常溫物質經某種波長的入射光當某種常溫物質經某種波長的入射光（通常是紫外線）照射（通常是紫外線）照射,吸收光能后進吸收光能后進入激發態入激發態,并且立即退激發并發出比入并且立即退激發并發出比入射光的的波長長的出射光（通常波長射光的的波長長的出射光（通常波長在可見光波段）在可見光波段）;而且一旦停止入射光而且一旦停止入射光,發光現象也隨之立即消失。具有這種發光現象也隨之立即消失。具有這種性質的出射光就被稱之為熒光。性質的出射光就被稱之為熒光。 3磷光磷光是一種緩慢發光的光致冷發光現

2、象。當某種是一種緩慢發光的光致冷發光現象。當某種常溫物質經某種波長的入射光（通常是紫外線）照常溫物質經某種波長的入射光（通常是紫外線）照射射,吸收光能后進入激發態（具有和基態不同的自吸收光能后進入激發態（具有和基態不同的自旋多重度）旋多重度）,然后緩慢地退激發并發出比入射光的然后緩慢地退激發并發出比入射光的的波長長的出射光的波長長的出射光,而且與熒光過程不同而且與熒光過程不同,當入射光當入射光停止后停止后,發光現象持續存在。發出磷光的退激發過發光現象持續存在。發出磷光的退激發過程是被量子力學的躍遷選擇規則禁戒的程是被量子力學的躍遷選擇規則禁戒的,因此這個因此這個過程很緩慢。過程很緩慢。456主

3、要內容主要內容熒光光譜的基本原理熒光光譜的基本原理1熒光光譜儀的原理、操作及數據處理熒光光譜儀的原理、操作及數據處理2熒光光譜的應用熒光光譜的應用3參考資料參考資料47熒光光譜的基本原理熒光光譜的基本原理8分子能級比原子能級復雜分子能級比原子能級復雜; ; 在每個電子能級上在每個電子能級上, ,都存在振動、轉動能級都存在振動、轉動能級; ; 一、分子能級與躍遷一、分子能級與躍遷激發激發: 基態基態( (S S0 0)激發態激發態( (S S1 1、S S2 2激發態振動能級激發態振動能級):):吸收特吸收特定頻率的輻射定頻率的輻射; ;量子化量子化; ;躍遷一次到位躍遷一次到位; ;失活失活:

4、 激發態激發態 基態基態: :多種途徑和方式多種途徑和方式( (見能級圖見能級圖) ); ;速度最速度最快、激發態壽命最短的途徑占優勢快、激發態壽命最短的途徑占優勢; ; 第一、第二、第一、第二、電子激發電子激發單重態單重態 S S1 1 、S S2 2 ; ; 第一、第二、第一、第二、電子激發電子激發三重態三重態 T T1 1 、T T2 2 ; ;9 電子激發態的多重度電子激發態的多重度: M = 2S+1 S為電子自旋量子數的代數和為電子自旋量子數的代數和(0或或1); 電子激發態的多重度電子激發態的多重度單重態單重態: : 一個分子中所有電子自旋都配對的電子狀態。一個分子中所有電子自旋

5、都配對的電子狀態。三重態三重態: : 有兩個電子的自旋不配對而平行的狀態。有兩個電子的自旋不配對而平行的狀態。激發三重態能量激發三重態能量較激發單重態低。較激發單重態低。1011躍遷規則躍遷規則 躍遷前后躍遷前后原子核的構型原子核的構型沒有發生改變、躍遷過程中沒有發生改變、躍遷過程中電子自旋電子自旋沒有改變、躍遷前后沒有改變、躍遷前后電子的軌道電子的軌道在空間有較大的在空間有較大的重疊重疊和和軌道的對軌道的對映性映性發生了改變的躍遷是允許的發生了改變的躍遷是允許的;（S S0 0 S1允許躍遷）允許躍遷） 躍遷過程中躍遷過程中電子自旋電子自旋發生了改變、躍遷前后發生了改變、躍遷前后電子的軌道電

6、子的軌道在空在空間不間不重疊重疊或或軌道的對映性軌道的對映性未發生改變的躍遷是禁阻的。未發生改變的躍遷是禁阻的。（S S0 0 T T1 1禁阻躍遷）禁阻躍遷）Franck-Condon原理原理: 在電子躍遷完成的瞬間在電子躍遷完成的瞬間,分子中分子中原子核的構型原子核的構型是來不及改變是來不及改變的。的。12v 單重態能級間的躍遷符合光譜選律單重態能級間的躍遷符合光譜選律,躍遷概率大。分子躍遷概率大。分子通過吸收輻射而直接被激發到三重態的躍遷是通過吸收輻射而直接被激發到三重態的躍遷是禁阻禁阻的的,概概率很小。率很小。13雅布隆斯基分子能級圖雅布隆斯基分子能級圖S1S0T1吸吸收收發發射射熒熒

7、光光發發射射磷磷光光系間竄越內轉換振動弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外轉換l l 2T2內轉換振動弛豫S 214 電子處于激發態是不穩定狀態電子處于激發態是不穩定狀態, ,容易返回基態容易返回基態, ,在這個過程中通過在這個過程中通過輻輻射躍遷射躍遷( (發光發光) )和和無輻射躍遷無輻射躍遷等方式失去能量等方式失去能量, ,這個過程就稱為這個過程就稱為失活失活。失活途徑失活途徑輻射躍遷熒光磷光內轉換外轉換系間竄越振動弛豫無輻射躍遷 激發態激發態停留時間短、返回速度快停留時間短、返回速度快的途徑的途徑, ,發生的發生的幾率大幾率大。失活的途徑失活的途徑15 振動弛豫振動弛豫: :同一

8、同一電子能級內以熱量交換形式由高振動能電子能級內以熱量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發生振動弛豫的時間一級至低相鄰振動能級間的躍遷。發生振動弛豫的時間一般為般為10-12 s。 激發態分子常常首先發生振動馳豫。激發態分子常常首先發生振動馳豫。 無輻射躍遷失活的途徑無輻射躍遷失活的途徑通過內轉換和振動弛豫通過內轉換和振動弛豫,高激發單重態的電子躍回第一高激發單重態的電子躍回第一激發單重態的最低振動能級。激發單重態的最低振動能級。 內轉換內轉換:多重度相同的電子能級中等能級間的無輻射能多重度相同的電子能級中等能級間的無輻射能級躍遷。級躍遷。 16無輻射躍遷失活的途徑無輻射躍遷失活的

9、途徑系間竄越系間竄越:不同多重態不同多重態,有重疊的轉動能級間的非輻射躍遷。有重疊的轉動能級間的非輻射躍遷。 改變電子自旋改變電子自旋,禁阻躍遷禁阻躍遷,通過自旋通過自旋軌道耦合進行軌道耦合進行。含有含有重原子的分子中（如重原子的分子中（如I、Br等）等）, ,系間竄躍最常見。系間竄躍最常見。 外轉換外轉換:激發分子與溶劑或其他分子之間產生相互作用而轉移激發分子與溶劑或其他分子之間產生相互作用而轉移能量的非輻射躍遷能量的非輻射躍遷; 外轉換使熒光或磷光減弱或外轉換使熒光或磷光減弱或“猝滅猝滅”。17熒光發射熒光發射: :電子由第一激發單重態的最低振動能級電子由第一激發單重態的最低振動能級基態（

10、基態（ 多為多為 S S1 1 S S0 0躍遷）躍遷）, ,發射波長為發射波長為 l l2 2的熒光的熒光; ; 1010-7-71010-9-9 s s 。 輻射躍遷失活的途徑輻射躍遷失活的途徑磷光發射磷光發射: :電子由第一激發三重態的最低振動能級電子由第一激發三重態的最低振動能級基態（基態（ 多為多為 T T1 1 S S0 0躍遷）躍遷）; ;發射波長為發射波長為 l l3 3 的磷光的磷光; ; 1010-4-4100 s 100 s 。 電子由電子由 S S0 0 進入進入 T T1 1 的可能過程的可能過程: :（ S S0 0 T T1 1禁阻躍遷）禁阻躍遷） S S0 0

11、激發激發振動弛豫振動弛豫內轉換內轉換系間竄越系間竄越振動弛豫振動弛豫T T1 1 發光速度很慢發光速度很慢, ,光照停止后光照停止后, ,可持續一段時間可持續一段時間。 磷光僅在很低的溫度或黏性介質中才能觀測到磷光僅在很低的溫度或黏性介質中才能觀測到, ,因此磷光很少應用于分析因此磷光很少應用于分析 由圖可見由圖可見, ,發射熒光的能量比分子吸收的能量小發射熒光的能量比分子吸收的能量小, ,波長長波長長; ; l l2 2 l l 2 2 l l 1 1 ; ; 18 熒光產生的過程熒光產生的過程: :（1 1）處于基態最低振動能級的熒光物質分子受到紫外線的照）處于基態最低振動能級的熒光物質分

12、子受到紫外線的照射射, ,吸收了和它所具有的特征頻率相一致的光線吸收了和它所具有的特征頻率相一致的光線, ,躍遷到第一電子激發態的各個振動躍遷到第一電子激發態的各個振動能級能級; ;（2 2）被激發到第一電子激發態的各個振動能級的分子通過）被激發到第一電子激發態的各個振動能級的分子通過無輻射躍遷降落到第一電子激發態的最低振動能級無輻射躍遷降落到第一電子激發態的最低振動能級; ;（3 3）降落到第一電子激發態的最低振動能級的分子繼續降）降落到第一電子激發態的最低振動能級的分子繼續降落到基態的各個不同振動能級落到基態的各個不同振動能級, ,同時發射出相應的光量子同時發射出相應的光量子, ,這就是熒

13、光這就是熒光: :（4 4）到達基態的各個不同振動能級的分子再通過無輻射躍遷最后回到基態的最低振）到達基態的各個不同振動能級的分子再通過無輻射躍遷最后回到基態的最低振動能級動能級19熒光光譜熒光光譜 固定激發光波長物質發射的熒光強度與發固定激發光波長物質發射的熒光強度與發射光波長關系曲線射光波長關系曲線,如右圖中曲線如右圖中曲線II。 熒光本身則是由電子在兩能級間不發生自熒光本身則是由電子在兩能級間不發生自旋反轉的輻射躍遷過程中所產生的光。旋反轉的輻射躍遷過程中所產生的光。磷光光譜磷光光譜 固定激發光波長物質發射的磷光強度與固定激發光波長物質發射的磷光強度與發射光波長關系曲線發射光波長關系曲線

14、,如右圖中曲線如右圖中曲線III。 磷光本身則是由電子在兩能級間發生自旋磷光本身則是由電子在兩能級間發生自旋反轉的輻射躍遷過程中所產生的光。反轉的輻射躍遷過程中所產生的光。熒光光譜與磷光光譜熒光光譜與磷光光譜20200260320380440500560620熒熒光光激激發發光光譜譜熒熒光光發發射射光光譜譜磷磷光光光光譜譜室室溫溫下下菲菲的的乙乙醇醇溶溶液液熒熒（磷磷）光光光光譜譜光譜圖光譜圖21激發光譜激發光譜 固定發射波長固定發射波長(一般將其固定于發射波段中感興趣的峰位一般將其固定于發射波段中感興趣的峰位),掃描出掃描出的化合物的的化合物的發射光強度發射光強度(熒光熒光/磷光磷光) 與與

15、入射光波長入射光波長的關系曲線。的關系曲線。 二、主要光譜參量二、主要光譜參量發射光譜發射光譜 固定激發波長固定激發波長(一般將其固定于激發波段中感興趣的峰位一般將其固定于激發波段中感興趣的峰位),掃描出掃描出的化合物的的化合物的發射光強度發射光強度(熒光熒光/磷光磷光) 與與入射光波長入射光波長的關系曲線。的關系曲線。吸收光譜吸收光譜 化合物的化合物的吸收光強度吸收光強度與與入射光波長入射光波長的關系曲線的關系曲線 。 22主要光譜參量主要光譜參量 吸收光譜吸收光譜反映出的是物質的基態能級與激發態能級之間所有的允許躍遷。反映出的是物質的基態能級與激發態能級之間所有的允許躍遷。 通常狀態下的物

16、質的通常狀態下的物質的表觀顏色表觀顏色大部分時候取決于其大部分時候取決于其吸收特性吸收特性。 激發光譜激發光譜則反映的是基態與所有與該熒光發射有關的能級之間的躍遷。其則反映的是基態與所有與該熒光發射有關的能級之間的躍遷。其所呈現的關系比吸收光譜要有選擇性所呈現的關系比吸收光譜要有選擇性,但有時候又不如吸收光譜來的直接。但有時候又不如吸收光譜來的直接。23激發光譜與發射光譜的關系激發光譜與發射光譜的關系 a.Stokesa.Stokes位移位移 激發光譜與發射光譜之間的波長差值。激發光譜與發射光譜之間的波長差值。熒光的熒光的波長總是大波長總是大于激發光的波長。于激發光的波長。這是由于發射熒光之前

17、的振動馳豫和內轉這是由于發射熒光之前的振動馳豫和內轉換過程損失了一定的能量。換過程損失了一定的能量。 b. .發射光譜的形狀與激發波長無關發射光譜的形狀與激發波長無關 電子躍遷到不同激發態能級電子躍遷到不同激發態能級, ,吸收不同波長的能量吸收不同波長的能量( (如能級如能級圖圖l l 2 ,l l 1),產生不同吸收帶產生不同吸收帶, ,但均回到第一激發單重態的最低但均回到第一激發單重態的最低振動能級再躍遷回到基態振動能級再躍遷回到基態,產生波長一定的熒光產生波長一定的熒光(如如l l 2 )。 c. . 鏡像規則鏡像規則 通常熒光發射光譜與它的吸收光譜（與激發光譜形狀一通常熒光發射光譜與它

18、的吸收光譜（與激發光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。樣）成鏡像對稱關系。 24產生斯托克位移的主要原因產生斯托克位移的主要原因: :1.1.躍遷到激發態高振動能級的激發態分子躍遷到激發態高振動能級的激發態分子, ,首先以更快的速率首先以更快的速率發生振動弛豫（其速率在發生振動弛豫（其速率在10101313/s/s數量級）數量級）, ,散失部分能量散失部分能量, ,達到達到零振動能級零振動能級, ,一般從零振動能級發射熒光一般從零振動能級發射熒光; ;2.2.激發態形成后激發態形成后, ,其分子的構型將很快進一步調整其分子的構型將很快進一步調整, ,以達到激以達到激發態的穩定構型發態的穩定構型, ,

19、這又損失了部分能量這又損失了部分能量; ;3.3.發射熒光的激發態多為（發射熒光的激發態多為（,*）態）態,這種激發態較基態時有這種激發態較基態時有更大的極性更大的極性,因此將在更大程度上為極性溶劑所穩定因此將在更大程度上為極性溶劑所穩定,使激發態使激發態的能量進一步降低。的能量進一步降低。斯托克位移斯托克位移25v 關于激發光的波長關于激發光的波長1 1:決定熒光物質是否能夠產生吸收并發射出熒光決定熒光物質是否能夠產生吸收并發射出熒光;能夠使熒光物質產生吸收并發射出熒光的激發光的波長并不具能夠使熒光物質產生吸收并發射出熒光的激發光的波長并不具有唯一性有唯一性;在保證激發的前提下在保證激發的前

20、提下,不同激發波長處的熒光發射光譜相同不同激發波長處的熒光發射光譜相同,但但熒光強度不同。熒光強度不同。在進行熒光測定時在進行熒光測定時,須選擇激發光波長以保證熒光強度最大。須選擇激發光波長以保證熒光強度最大。26 熒光發射是光吸收的逆過程。熒光發射光譜與吸收光譜有類似鏡熒光發射是光吸收的逆過程。熒光發射光譜與吸收光譜有類似鏡影的關系。但當激發態的構型與基態的構型相差很大時影的關系。但當激發態的構型與基態的構型相差很大時,熒光發射光熒光發射光譜將明顯不同于該化合物的吸收光譜。譜將明顯不同于該化合物的吸收光譜。鏡像規則鏡像規則27鏡像規則的解釋鏡像規則的解釋 基態上的各振動能級分布基態上的各振動

21、能級分布與第一激發態上的各振動能級與第一激發態上的各振動能級分布類似分布類似; 基態上的零振基態上的零振動能級與第一激動能級與第一激發態的零振動能發態的零振動能級之間的躍遷幾級之間的躍遷幾率最大率最大,相反躍遷相反躍遷也然。也然。 28三、三、熒光的產生與分子結構的關系熒光的產生與分子結構的關系1.1.分子產生熒光必須具備的條件分子產生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結構）具有合適的結構;（2）具有一定的熒光量子產率。）具有一定的熒光量子產率。 291.1.化合物的結構與熒光化合物的結構與熒光（1）躍遷類型）躍遷類型: * 的熒光效率高的熒光效率高,系間跨越過程的速率常系間跨越過程的速率常數

22、小數小,有利于熒光的產生有利于熒光的產生;（2）共軛效應）共軛效應:提高共軛度有利于增加熒光效率并產生紅移提高共軛度有利于增加熒光效率并產生紅移（3）剛性平面結構）剛性平面結構:可降低分子振動可降低分子振動,減少與溶劑的相互作用減少與溶劑的相互作用,故具有很強的熒光。故具有很強的熒光。（4）取代基效應）取代基效應:芳環芳環上有供電基上有供電基,使熒光增強使熒光增強。30化合物化合物 相對熒光強度相對熒光強度 熒光波長熒光波長/nm/nm C6H6（苯）（苯）10 10 270310 C6H5COOH C6H5NO230310390 C6H5CH3 C6H5OH C6H5OCH3 C6H5NH2

23、 C6H5CN1718202020270320285365285345310405280360 C6H5Cl C6H5BrC6H5I75027534529038031v 物質分子發射熒光的能力用熒光量子產率（物質分子發射熒光的能力用熒光量子產率（）表示）表示: :v 與失活過程的速率常數與失活過程的速率常數k k有關有關: : 凡是使熒光速率常數凡是使熒光速率常數k kf f增大而使其他失活過程（系間竄越、外轉增大而使其他失活過程（系間竄越、外轉換、內轉換）的速率常數減小的因素（環境因素和結構因素）都可使換、內轉換）的速率常數減小的因素（環境因素和結構因素）都可使熒光增強。熒光增強。吸收的光子

24、數發射的光子數激發態的分子數發射熒光的分子數=iceciffkkkkk2 2 熒光量子產率熒光量子產率32四、影響熒光強度的外部因素四、影響熒光強度的外部因素 1.溶劑的影響溶劑的影響 溶劑極性增加溶劑極性增加, ,有時會使熒光強度增加有時會使熒光強度增加, ,熒光波長紅移。熒光波長紅移。 若溶劑和熒光物質形成氫鍵或使熒光物質電離狀態改變若溶劑和熒光物質形成氫鍵或使熒光物質電離狀態改變, ,會使熒光強會使熒光強度、熒光波長改變度、熒光波長改變。 含重原子的溶劑（碘乙烷、四溴化碳）使熒光減弱含重原子的溶劑（碘乙烷、四溴化碳）使熒光減弱, ,磷光增強。磷光增強。 溶劑溶劑粘度粘度減小時減小時,可以

25、增加分子間碰撞機會可以增加分子間碰撞機會,使無輻射躍遷增加而熒光使無輻射躍遷增加而熒光減弱。故減弱。故熒光強度隨溶劑粘度的減小而減弱熒光強度隨溶劑粘度的減小而減弱。由于溫度對溶劑的粘度。由于溫度對溶劑的粘度有影響有影響,一般是溫度上升一般是溫度上升,溶劑粘度變小溶劑粘度變小,因此因此溫度上升溫度上升,熒光強度下降。熒光強度下降。332.溫度的影響溫度的影響 熒光強度對溫度變化敏感熒光強度對溫度變化敏感,溫度增加溫度增加,分子運動速度加快分子運動速度加快,分子間碰撞的幾率增加分子間碰撞的幾率增加,外轉換去活的幾率增加外轉換去活的幾率增加,熒光效率降低。熒光效率降低。例如熒光素鈉的乙醇溶液例如熒光

26、素鈉的乙醇溶液,在在0以下以下,溫度每降低溫度每降低10, f增加增加3,在在 80時時, f為為1。343 3 pH值的影響值的影響 含有酸性或堿性取代基的芳香化合物的熒光與含有酸性或堿性取代基的芳香化合物的熒光與pH有關。有關。pH的變化影響了熒光基團的電荷狀態的變化影響了熒光基團的電荷狀態,從而使其熒光發生變從而使其熒光發生變化。化。化合物化合物 相對熒光強度相對熒光強度 C6H5OH 18 C6H5O 0C6H5NH2 20C6H5NH3 +0354.內濾光作用和自吸現象內濾光作用和自吸現象 自吸現象自吸現象: :化合物的熒光發射光譜的短波長端與其吸收化合物的熒光發射光譜的短波長端與其

27、吸收 光譜的長波長端重疊光譜的長波長端重疊, ,產生自吸收產生自吸收; ;如蒽化合物。如蒽化合物。 內濾光作用內濾光作用: :溶液中含有能吸收激發光或熒光物質發溶液中含有能吸收激發光或熒光物質發 射的熒光射的熒光, ,如色胺酸中的重鉻酸鉀如色胺酸中的重鉻酸鉀; ;365.熒光熄滅劑熒光熄滅劑 熒光熄滅是指熒光物質分子與溶劑分子或溶質分子相互熒光熄滅是指熒光物質分子與溶劑分子或溶質分子相互作用引起熒光強度降低的現象。引起熒光熄滅的物質稱為作用引起熒光強度降低的現象。引起熒光熄滅的物質稱為熒光熄滅劑熒光熄滅劑(quenching medium)。如如鹵素離子鹵素離子、重金屬離重金屬離子子、氧分子氧

28、分子以及以及硝基化合物硝基化合物、重氮化合物重氮化合物、羰基羰基和和羧基化羧基化合物合物均為常見的熒光熄滅劑。均為常見的熒光熄滅劑。376、散射光、散射光 小部分光子和物質分子相碰撞小部分光子和物質分子相碰撞,使光子的運動方向發生改使光子的運動方向發生改變而向不同角度散射。變而向不同角度散射。瑞利光瑞利光:光子和物質發生彈性碰撞光子和物質發生彈性碰撞,不發生能量交換不發生能量交換,只是光只是光子運動方向發生改變。其波長與入射光波長相同。子運動方向發生改變。其波長與入射光波長相同。拉曼光拉曼光:光子和物質發生彈性碰撞光子和物質發生彈性碰撞,發生能量交換發生能量交換,光子把部分光子把部分能量轉移給

29、物質分子或從物質分子獲得部分能量。從而發射能量轉移給物質分子或從物質分子獲得部分能量。從而發射出比入射光稍長或稍短的光。出比入射光稍長或稍短的光。 散射光對熒光測定有干擾散射光對熒光測定有干擾,尤其是波長比入射光波長更長尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光的拉曼光,與熒光波長接近與熒光波長接近,對測定的干擾大對測定的干擾大,必須采取措施消必須采取措施消除。除。拉曼光的干擾主要來自溶劑拉曼光的干擾主要來自溶劑,當溶劑的拉曼光與被測物質當溶劑的拉曼光與被測物質的熒光光譜相重疊時的熒光光譜相重疊時,應更換溶劑或改變激發光波長應更換溶劑或改變激發光波長38a:320nm或350nm為激發光,熒光峰總是在

30、448nm。 b:將空白溶劑分別在320nm及350nm激發光照射下測定熒光,激發光波長為320nm時,拉曼光波長是360nm,360nm的拉曼光對熒光無影響;當激發光波長為350nm時,拉曼光波長是400nm,400nm的拉曼光對熒光有干擾,因而影響測定結果。 硫酸奎寧在不同波長激發下的熒光與散射光譜硫酸奎寧在不同波長激發下的熒光與散射光譜 39熒光光譜儀的原理、操作及數據處理熒光光譜儀的原理、操作及數據處理40熒光光譜儀的基本原理熒光光譜儀的基本原理特殊點特殊點: :有兩個單色器有兩個單色器, ,光源與檢測器通常成直光源與檢測器通常成直角。角。41 光源光源: : 高壓氙燈發出的光線強度大

31、高壓氙燈發出的光線強度大,而且是連續光譜而且是連續光譜,通用性較好通用性較好,但氙弧但氙弧燈熱效應大燈熱效應大,穩定性較差穩定性較差,對電壓穩定性要求較高對電壓穩定性要求較高。 高功率連續可調激光光源是一種新型熒光激發光源。激光的單色高功率連續可調激光光源是一種新型熒光激發光源。激光的單色性好、強度大。激光光源近年來應用日益普遍。性好、強度大。激光光源近年來應用日益普遍。 42v單色器單色器: : 第一單色器第一單色器選擇激發光波長選擇激發光波長1 （250nm的紫外光）的紫外光）,稱稱為激發單色器。為激發單色器。 第二單色器第二單色器選擇選擇(測量測量)發射光（熒光）波長發射光（熒光）波長2

32、 ,與激發光入與激發光入射方向垂直射方向垂直,稱為熒光單色器。稱為熒光單色器。v樣品池樣品池: : 采用低熒光材料,通常為四面透光的石英池。v檢測器檢測器: : 光電倍增管。光電倍增管。43液體液體樣品準備樣品準備1. 1. 溶液樣品盡量使用溶液樣品盡量使用透明的玻璃化溶液透明的玻璃化溶液, ,避免在這種匯聚式光路中由避免在這種匯聚式光路中由于比色皿中溶液的前后吸收不均導致的光譜失真問題。于比色皿中溶液的前后吸收不均導致的光譜失真問題。 2. 2. 為安全起見為安全起見, ,對于使用揮對于使用揮發性劇毒溶劑發性劇毒溶劑的測試的測試, ,一定要有合適的一定要有合適的防防護護。 3. 3. 易揮發

33、、易變質易揮發、易變質的溶液最好的溶液最好現配現測現配現測。4. 4. 液體樣品一般放在液體樣品一般放在帶蓋石英比色皿帶蓋石英比色皿（與紫外測試所用比色皿不同（與紫外測試所用比色皿不同, ,為側面全透明型）為側面全透明型）中進行測試。中進行測試。44測試準備測試準備 由于物質的發射特性和吸收特性是緊密相關的由于物質的發射特性和吸收特性是緊密相關的, ,所以提前做好所以提前做好吸收譜可以有效縮短熒光測試的摸索時間。吸收譜可以有效縮短熒光測試的摸索時間。 對于不知道相關特性的樣品對于不知道相關特性的樣品, ,吸收譜的測試比熒光光譜的測試吸收譜的測試比熒光光譜的測試要容易很多。要容易很多。所以所以,

34、 ,建議大家建議大家先測一下樣品的吸收譜先測一下樣品的吸收譜, ,并從中找出感興趣并從中找出感興趣的吸收峰和特性的吸收峰和特性, ,在熒光測試時以便參考。在熒光測試時以便參考。45光譜測試光譜測試1.1.開機開機 2.2. 電源電源燈源燈源2.2.熒光光譜熒光光譜 固定激發光的波長固定激發光的波長, ,選擇合適的熒光光譜波長范圍、濾光片、光路選擇合適的熒光光譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等狹縫、掃描速度等測量不同熒光波長處熒光的強度測量不同熒光波長處熒光的強度, ,得到熒光光譜得到熒光光譜, ,即即熒光強度熒光強度熒光波長圖熒光波長圖。 3.3.激發光譜激發光譜 在熒光最強的波長處在熒

35、光最強的波長處固定熒光波長固定熒光波長, ,選擇合適的激發光譜波長范圍、選擇合適的激發光譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等濾光片、光路狹縫、掃描速度等測量隨激發光波長的改變而變化測量隨激發光波長的改變而變化的熒光強度的熒光強度, ,得到熒光激發光譜。即得到熒光激發光譜。即熒光強度熒光強度- -激發光波長圖。激發光波長圖。464.4.熒光光譜熒光光譜 在熒光最強的波長處在熒光最強的波長處固定激發波長固定激發波長, ,選擇合適的熒光光譜波長范圍、選擇合適的熒光光譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進行發射譜的掃描。濾光片、光路狹縫、掃描速度等進行發射譜的掃描。5.5.重復重復3 3、4

36、4步循環掃描得到理想的光譜圖。步循環掃描得到理想的光譜圖。7.7.關機關機 光源光源電源電源6.6.保存數據保存數據光譜測試光譜測試激發波長一定要小于發射波長激發波長一定要小于發射波長。47光路狹縫和掃描速度的選擇光路狹縫和掃描速度的選擇如果光路狹縫太大如果光路狹縫太大, ,熒光信號太強熒光信號太強, ,容易超出儀器檢測范圍容易超出儀器檢測范圍, ,損損傷儀器傷儀器; ;如果狹縫開的太小如果狹縫開的太小, ,熒光信號又太弱熒光信號又太弱, ,檢測比較困難檢測比較困難, ,所所以要選擇大小合適的狹縫。以要選擇大小合適的狹縫。如果掃描太快如果掃描太快, ,容易跳峰容易跳峰, ,忽略特征性的峰信號忽

37、略特征性的峰信號; ;掃描太慢則浪掃描太慢則浪費時間。所以只要能掃描得到平滑的光譜曲線就可以了。費時間。所以只要能掃描得到平滑的光譜曲線就可以了。48熒光光譜的應用熒光光譜的應用491.1.定量依據與方法定量依據與方法(1)定量依據定量依據 熒光強度熒光強度 If正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率和熒光量子效率 : If = Ia 由朗伯由朗伯-比耳定律比耳定律: Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 濃度很低時濃度很低時,將括號項近似處理后將括號項近似處理后: If = 2.3 I0 l c =

38、Kc50（2 2）定量方法）定量方法標準曲線法標準曲線法: : 配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度,繪制標繪制標準曲線準曲線,再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度,在在標準曲線上求出濃度標準曲線上求出濃度;比較法比較法: 在線性范圍內在線性范圍內,測定標樣和試樣的熒光強度測定標樣和試樣的熒光強度,比較比較;512 、熒光光譜的應用、熒光光譜的應用熒光探針熒光探針金屬金屬-有機配合物（有機配合物（MOF）發光材料發光材料分子傳感器分子傳感器物質的檢測物質的檢測稀土摻雜發光材料稀土摻雜發光材料發光器件發光器件光譜光譜52(1)(

39、1)無機化合物的分析無機化合物的分析 與有機試劑配合物后測量;可測量約60多種元素。 鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法; 氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定; 銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定; 鉻、鈮、鈾、碲采用低溫熒光法測定; 鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定(2)(2)生物與有機化合物的分析生物與有機化合物的分析 見表 535455與蛋白質或其他大分子結構與蛋白質或其他大分子結構非共價相互作用非共價相互作用而使一種或幾而使一種或幾種種熒光性質發生改變熒光性質發生改變的小分子物質。可用于研究大分子物的小分子物質。可用于研究大分子物質的性質和行為。質的性質

40、和行為。 熒光探針熒光探針目前常用的熒光探針有熒光素類探針、無機離子熒光探針、熒光量子目前常用的熒光探針有熒光素類探針、無機離子熒光探針、熒光量子點、分子信標等。點、分子信標等。熒光探針除應用于核酸和蛋白質的定量分析外熒光探針除應用于核酸和蛋白質的定量分析外, ,在核酸染色、在核酸染色、DNADNA電泳、電泳、核酸分子雜交、定量核酸分子雜交、定量PCRPCR技術以及技術以及DNADNA測序上都有著廣泛的應用。測序上都有著廣泛的應用。 熒光探針熒光探針: :56熒光探針熒光探針過渡金屬配合物過渡金屬配合物很多能實現較強的紅外波段寬帶發射很多能實現較強的紅外波段寬帶發射, ,可以有效避開組織體的吸

41、收可以有效避開組織體的吸收, ,可以穿透組織體實現紅外可以穿透組織體實現紅外成像成像, ,克服同位素原子示蹤對人體的傷害克服同位素原子示蹤對人體的傷害; ;壽命處于壽命處于s s 量級量級, ,可以用于較大分子的形變和轉動擴散研究可以用于較大分子的形變和轉動擴散研究, ,當然當然, ,結合其特有的發射波段也能對活體環境中的許多擴散和結合其特有的發射波段也能對活體環境中的許多擴散和轉變過程進行研究。轉變過程進行研究。57稀土離子稀土離子是一類核酸探針的檢測試劑。是一類核酸探針的檢測試劑。在水溶液中僅有在水溶液中僅有Tb()和和Eu()發出熒光發出熒光,與與DNA配合后仍保留熒配合后仍保留熒光性能光性能,可特異識別核苷酸。可特異識別核苷酸。Tb()和和Eu()與一些小分子配體配合與一些小分子配體配合,由于配體本身性質、中心由于配體本身性質、中心離子離子-配體成鍵及溶劑等因素影響配體成鍵及溶劑等因素影響,使配合物的激發態壽命達到使配合物的激發態壽命達到ms 級級,并發出窄而強的熒光。并發出窄而強的熒光。Tb()和和Eu()與小分子的配合物探針通過共價鍵與靶與小分子的配合物探針通過共價鍵與靶DNA 共價共價結合后多用于實時定量熒光結合后多用于實時定量熒光PCR 反應產物的分析及雜交測試。反應產物