1、第四章園藝植物病毒的脫除、檢測(cè)及鑒定技術(shù)二、病毒在植物上的危害二、病毒在植物上的危害 病毒的危害給植物生產(chǎn)帶來(lái)的損失很大，如草莓病毒的危病毒的危害給植物生產(chǎn)帶來(lái)的損失很大，如草莓病毒的危害，使草莓產(chǎn)量嚴(yán)重降低，品質(zhì)大大退化。葡萄扇葉病毒使葡害，使草莓產(chǎn)量嚴(yán)重降低，品質(zhì)大大退化。葡萄扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)萄減產(chǎn)1018，花卉病毒的危害一般會(huì)影響花卉的觀賞價(jià)值，花卉病毒的危害一般會(huì)影響花卉的觀賞價(jià)值，其表現(xiàn)是花少而小，產(chǎn)生畸形、變色等。其表現(xiàn)是花少而小，產(chǎn)生畸形、變色等。 由于病毒對(duì)植物造成如此嚴(yán)童的危害，所以世界各國(guó)都積極開(kāi)始由于病毒對(duì)植物造成如此嚴(yán)童的危害，所以世界各國(guó)都積極開(kāi)始重視這方面的研究。

2、重視這方面的研究。 三、無(wú)病毒苗培育的意義三、無(wú)病毒苗培育的意義 1. 去除病毒危害，提高作物品質(zhì)與產(chǎn)量。去除病毒危害，提高作物品質(zhì)與產(chǎn)量。采用生物、物理、化學(xué)等途徑防治病毒病收效甚微，甚至毫無(wú)成效。而通過(guò)組織培養(yǎng)的方法可以脫除嚴(yán)重患病毒植物的病毒種類(lèi)，提高產(chǎn)量、質(zhì)量。因此，到60至70年代在花卉、蔬菜和果樹(shù)等得到廣泛的應(yīng)用。 2. 減少環(huán)境污染，有利于保護(hù)環(huán)境減少環(huán)境污染，有利于保護(hù)環(huán)境 栽培去病毒植物可減少藥劑的使用。第二節(jié)第二節(jié) 無(wú)病毒苗培育的方法無(wú)病毒苗培育的方法一、熱處理脫毒一、熱處理脫毒 二、微莖尖培養(yǎng)脫毒二、微莖尖培養(yǎng)脫毒 三、其他途徑脫毒三、其他途徑脫毒一、熱處理脫毒一、熱處理

3、脫毒 （一）發(fā)現(xiàn)：（一）發(fā)現(xiàn)： 1889年印度尼西亞爪畦人發(fā)現(xiàn)，患枯萎病的甘蔗(現(xiàn)證明為病毒病)，放在50-52的熱水中保持30min，甘蔗就可去病生長(zhǎng)良好。以后此方法被廣泛用于防治許多植物的病毒病。 熱處理又稱(chēng)溫治療法。熱處理又稱(chēng)溫治療法。（二）原理（二）原理 是當(dāng)植物組織處于高于正常溫度的環(huán)境中時(shí)，是當(dāng)植物組織處于高于正常溫度的環(huán)境中時(shí)，組織內(nèi)部的病毒受熱后部分或全部鈍化，組織內(nèi)部的病毒受熱后部分或全部鈍化，不能生不能生成或生成病毒很少，以致病毒含量不斷降低從而達(dá)到成或生成病毒很少，以致病毒含量不斷降低從而達(dá)到脫毒的目的脫毒的目的 。（三）熱處理方法（三）熱處理方法 1. 溫湯浸漬處理溫湯

4、浸漬處理 適用：適用：休眠器官、剪下的接穗或種植的材料 方法方法：50左右的溫水中浸漬10min至數(shù)小時(shí) 特點(diǎn)：特點(diǎn)：方法簡(jiǎn)便易行，但易使材料受傷。 2. 熱空氣處理熱空氣處理 適用：適用：對(duì)活躍生長(zhǎng)的莖尖效果較好 方法：方法：將生長(zhǎng)的盆栽植株移人溫?zé)嶂委熓?箱)內(nèi)，一般在3540下處理幾十分鐘至數(shù)月。處理時(shí)間因植物而異，如香石竹于38下處理兩個(gè)月，其莖尖所含病毒即可被清除。馬鈴薯在35下處理幾個(gè)月才能獲得無(wú)病毒苗。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：熱處理方法主要缺陷是并非能脫除所有病毒。例如在馬鈴薯中，應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)只能消除卷葉病毒。因此熱處理需與其他方法配合應(yīng)用，才可獲得良好的脫毒效果 。 二、微莖尖培養(yǎng)脫毒二

5、、微莖尖培養(yǎng)脫毒（一）莖尖培養(yǎng)脫毒原理（一）莖尖培養(yǎng)脫毒原理 感染病毒植株的體內(nèi)病毒的分布不均勻，病毒的數(shù)量隨植株部位感染病毒植株的體內(nèi)病毒的分布不均勻，病毒的數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域的病毒的感染程度越低，生長(zhǎng)點(diǎn)及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域的病毒的感染程度越低，生長(zhǎng)點(diǎn)(分生分生組織約組織約0.11.0mm區(qū)域區(qū)域)則幾乎不含或含病毒很少。則幾乎不含或含病毒很少。 莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代穩(wěn)定，所以是目前培莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代穩(wěn)定，所以是目前培育無(wú)病毒苗最廣泛和最重要的一個(gè)途徑。育無(wú)病毒苗最廣泛和最重要的一個(gè)途徑。 植物組織內(nèi)病毒含量隨與莖尖距離加大

6、而增加的原因植物組織內(nèi)病毒含量隨與莖尖距離加大而增加的原因 在植物體內(nèi)，病毒易于通過(guò)微管系統(tǒng)移動(dòng)，但分生組織中無(wú)此系統(tǒng)；病在植物體內(nèi)，病毒易于通過(guò)微管系統(tǒng)移動(dòng)，但分生組織中無(wú)此系統(tǒng)；病毒在細(xì)胞間移動(dòng)的另一個(gè)途徑是通過(guò)胞間連絲，但它的速度極慢，難以毒在細(xì)胞間移動(dòng)的另一個(gè)途徑是通過(guò)胞間連絲，但它的速度極慢，難以趕上活躍生長(zhǎng)的莖尖。趕上活躍生長(zhǎng)的莖尖。 活躍生長(zhǎng)的莖尖分生組織代謝活性很高，致使病毒無(wú)法復(fù)制。活躍生長(zhǎng)的莖尖分生組織代謝活性很高，致使病毒無(wú)法復(fù)制。 若植物體內(nèi)存在病毒鈍化系統(tǒng)，它在分生組織中比在任何其它區(qū)域都若植物體內(nèi)存在病毒鈍化系統(tǒng)，它在分生組織中比在任何其它區(qū)域都有更高的活性而鈍化病

7、毒，使分生組織不受浸染。有更高的活性而鈍化病毒，使分生組織不受浸染。 莖尖分生組織存在較高水平的內(nèi)源生長(zhǎng)素，可抑制病毒的增殖。莖尖分生組織存在較高水平的內(nèi)源生長(zhǎng)素，可抑制病毒的增殖。（二）培養(yǎng)基（二）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： 一般以一般以White、Morel和和MS作為基本培養(yǎng)基，作為基本培養(yǎng)基，尤其是提高鉀鹽和銨鹽的含量會(huì)有利于莖尖的生長(zhǎng)。尤其是提高鉀鹽和銨鹽的含量會(huì)有利于莖尖的生長(zhǎng)。 植物激素：植物激素： 其種類(lèi)與濃度對(duì)莖尖生長(zhǎng)和發(fā)育具有重要其種類(lèi)與濃度對(duì)莖尖生長(zhǎng)和發(fā)育具有重要的作用。適當(dāng)提高生長(zhǎng)素的作用。適當(dāng)提高生長(zhǎng)素(0.10.5 mg/L)與細(xì)胞分裂素的與細(xì)胞分裂素的濃度，避免使用

8、易促進(jìn)愈傷組織化的濃度，避免使用易促進(jìn)愈傷組織化的2，4-D，宜換用穩(wěn)定，宜換用穩(wěn)定性較好的性較好的NAA或或IBA，細(xì)胞分裂素可用，細(xì)胞分裂素可用Kt或或 BA。有時(shí)需添。有時(shí)需添加活性炭。加活性炭。 （三）微莖尖培養(yǎng)方法（三）微莖尖培養(yǎng)方法外外植植體體莖尖莖尖（shoot tip）莖的頂端分生組織莖的頂端分生組織（apical meristem）頂端分生組織及其下方13個(gè)幼葉原基構(gòu)成莖的最幼齡葉原基上方的一部分，最大直徑約100um,最大長(zhǎng)度約250um1. 外植體的預(yù)處理外植體的預(yù)處理 將帶幼葉的莖芽葉片在將帶幼葉的莖芽葉片在75酒精中浸蘸數(shù)秒鐘（葉片酒精中浸蘸數(shù)秒鐘（葉片包被嚴(yán)緊的芽，

9、如菊花、蘭花）或用包被嚴(yán)緊的芽，如菊花、蘭花）或用01次氯酸鈉表面次氯酸鈉表面消毒消毒l0min（葉片包被松散的芽，如香石竹，蒜和馬鈴薯等）。（葉片包被松散的芽，如香石竹，蒜和馬鈴薯等）。 2. 莖尖的剝離與接種莖尖的剝離與接種 在解剖鏡下，將滅菌的外植體放在一個(gè)襯有無(wú)菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)（防止莖尖變干 ），用解剖針將葉片和葉原基剝掉，當(dāng)一個(gè)閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來(lái)之后，用解剖刀片將分生組織切下來(lái)，可帶12枚幼葉，然后將其接種到培養(yǎng)基上。注意：注意：剝離與接種盡量要快，以防莖尖變褐死亡。剝離與接種盡量要快，以防莖尖變褐死亡。 3. 3. 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 溫度：溫度：2222左右左右

10、 光強(qiáng)：光強(qiáng)：20003000Lx20003000Lx 光照時(shí)間：每天光照時(shí)間：每天16h 16h 。 微莖尖需數(shù)月培養(yǎng)才能成功。微莖尖需數(shù)月培養(yǎng)才能成功。 莖尖培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)和生根培莖尖培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)和一般器官的培養(yǎng)相同。養(yǎng)和一般器官的培養(yǎng)相同。 由于在低溫和短日照下，莖尖有可能進(jìn)入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時(shí)間必須保證。 （四）影響微莖尖培養(yǎng)的因素（四）影響微莖尖培養(yǎng)的因素 1外植體大小外植體大小 外植體越大，莖尖越易成活，分化率越高，產(chǎn)生再生植株的機(jī)會(huì)越大，但脫毒效果越差； 外植體越小，莖尖越難成活，分化率越低，產(chǎn)生再生植株的機(jī)會(huì)越小，但脫毒效果越好。 葉原基的存在與否也

11、影響分生組織形成植株的能力葉原基的存在與否也影響分生組織形成植株的能力，一般認(rèn)為，葉原基能向分生組織提供生長(zhǎng)和分化所必需的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。 2培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 在莖尖培養(yǎng)中，較高的溫度和充足的光照有利于莖在莖尖培養(yǎng)中，較高的溫度和充足的光照有利于莖尖的培養(yǎng)。尖的培養(yǎng)。 光下培養(yǎng)的效果通常比暗培養(yǎng)效果好，如馬鈴薯莖尖培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)莖已長(zhǎng)到1cm高時(shí)光照強(qiáng)度便增加到4000Lx。3外植體的生理狀態(tài)外植體的生理狀態(tài) 最好取頂芽：最好取頂芽：旺盛生長(zhǎng)的枝條頂芽比側(cè)芽培養(yǎng)效果好（ 如香石竹和菊花）。 宜選取萌動(dòng)期的芽：宜選取萌動(dòng)期的芽：取芽時(shí)間很重要，否則要采用某種適當(dāng)?shù)奶幚怼⒋蚱菩菝卟拍苓M(jìn)行。三、其他

12、途徑脫毒三、其他途徑脫毒（一）愈傷組織培養(yǎng)脫毒（一）愈傷組織培養(yǎng)脫毒 通過(guò)植物的器官和組織的培養(yǎng)去分化誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，通過(guò)植物的器官和組織的培養(yǎng)去分化誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長(zhǎng)成小植株，可以得到無(wú)病毒然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長(zhǎng)成小植株，可以得到無(wú)病毒苗苗 理由：理由：病毒的復(fù)制速度趕不上細(xì)胞的增殖速度； 有些細(xì)胞通過(guò)突變獲得了抗病毒的抗性。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：植株遺傳性不穩(wěn)定，可能會(huì)產(chǎn)生變異植株 （二）莖尖微體嫁接（二）莖尖微體嫁接概念：概念：將無(wú)病毒莖尖（ 0.41.0mm ）嫁接在培養(yǎng)基上培養(yǎng)的實(shí)生砧木上，以獲得脫毒苗木的技術(shù)。適宜適宜：莖尖培養(yǎng)難以生根的植物，如桃、

13、柑橘、蘋(píng)果等無(wú)病毒莖尖來(lái)源：無(wú)病毒莖尖來(lái)源：成年無(wú)病毒植物、溫室培養(yǎng)的植物、熱處理植物和脫毒試管苗。（三）化學(xué)療法脫毒（三）化學(xué)療法脫毒 許多化學(xué)藥品(包括嘌呤、嘧啶類(lèi)似物、氨基酸、抗菌素等)對(duì)離體組織和原生質(zhì)體的培養(yǎng)具有脫毒效果。 常用的藥品有：8-氮鳥(niǎo)嘌呤、2-硫脲嘧啶、殺稻瘟抗菌素、放線菌素D、慶大霉素等。 例如，將100ug2-硫脲嘧啶加入培養(yǎng)基可除去煙草愈傷組織中的PVY (馬鈴薯病毒)。第三節(jié)第三節(jié) 無(wú)病毒植物的鑒定無(wú)病毒植物的鑒定 從上述途徑培育得到的植株，必須經(jīng)嚴(yán)格鑒定，證明確實(shí)無(wú)病毒存在，才是其正的無(wú)病毒苗，才可提供給生產(chǎn)應(yīng)用。 鑒定的方法有多種：鑒定的方法有多種：一、指示植

14、物一、指示植物(indicating Plant)(indicating Plant)法法二、抗血清二、抗血清(antiserum)(antiserum)鑒定法鑒定法 三、電子顯微鏡三、電子顯微鏡(electric microscope)(electric microscope)檢查法檢查法 一、指示植物法一、指示植物法 1. 概念：利用病毒在其他植物（指示植物或鑒別寄主）概念：利用病毒在其他植物（指示植物或鑒別寄主）上產(chǎn)生特定癥狀（枯斑和空斑）作為鑒別病毒存在上產(chǎn)生特定癥狀（枯斑和空斑）作為鑒別病毒存在與否和種類(lèi)的方法。與否和種類(lèi)的方法。 2. 局限性：它只能鑒定靠汁液傳染的病毒。局限性：它

15、只能鑒定靠汁液傳染的病毒。 3. 適用：草本與木本植物適用：草本與木本植物 4. 優(yōu)點(diǎn)：靈敏、準(zhǔn)確、可靠，操作方便優(yōu)點(diǎn)：靈敏、準(zhǔn)確、可靠，操作方便。 5. 鑒定方法：鑒定方法： 汁液涂抹法：汁液涂抹法：從被鑒定植物上取13g幼葉 研碎過(guò)濾取濾液涂抹于指示植物的葉面上保溫1525 接種后26d 可見(jiàn)癥狀出現(xiàn) 。 嫁接接種法：嫁接接種法：以指示植物作砧木，被鑒定植物作接穗，常用劈接法。 二、抗血清鑒定法二、抗血清鑒定法 1. 原理：原理： 植物病毒是由蛋白質(zhì)和核酸組成的核蛋白，是一種較好的抗原，給動(dòng)物注射后會(huì)產(chǎn)生抗體，抗體存在于血清之中稱(chēng)抗血清。不同病毒產(chǎn)生的抗血清有各自的特異性。用已知抗血清可以

16、鑒定未知病毒的種類(lèi)。 2. 鑒定方法：鑒定方法： 抗原的制備 抗血清的采收，分離把稀釋的抗血清與未知的病毒植物的汁液在小試管內(nèi)混合根據(jù)沉淀反應(yīng)來(lái)鑒定病毒種類(lèi)。3. 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 特異性高（這種抗血清是高度專(zhuān)一性的試劑），測(cè)定速度快，一般幾小時(shí)甚至幾分鐘就可以完成。所以抗血清法成為植物病毒鑒定中最有用的方法之一。三、電子顯微鏡檢查法三、電子顯微鏡檢查法 病毒有一定的形態(tài)（病毒有一定的形態(tài)（ 球狀、桿狀、線狀等）和大小球狀、桿狀、線狀等）和大小（ 0.010.3um ）。）。 采用電子顯微鏡（分辨率采用電子顯微鏡（分辨率0.0001um）可以直接觀）可以直接觀察病毒，檢查出有無(wú)病毒存在，并鑒定病毒的種類(lèi)。察病毒，檢查出有無(wú)病毒存在，并鑒定病毒的種類(lèi)。 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，能在植物粗提取液中定量測(cè)定病優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，能在植物粗提取液中定量測(cè)定病毒。毒。 第四節(jié)第四節(jié) 無(wú)病毒植物的利用無(wú)病毒植物的利用一、植物病毒的浸染與傳播一、植物病毒的浸染與傳播（一）浸染 植物自然孔口 植物細(xì)胞微傷 昆蟲(chóng)刺吸式口氣（二）傳播（二）傳播 介體傳播介體傳播：昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)、螨 接觸傳播接觸傳播：自然接觸（風(fēng)、雨）、 汁液接種（嫁接） 人為活動(dòng)（修剪） 、 寄生植物（菟絲子） 種子（豆科） 第四節(jié)第四節(jié) 無(wú)病毒植物的利用無(wú)病毒植