1、專題專題2 2 微生物的培養與應用微生物的培養與應用課題課題1 1 微生物的實驗室培養微生物的實驗室培養. . . 1.能夠描述出培養基的一般成分、種類及用途；2.能夠區別消毒和滅菌的不同之處；3.寫出培養基制作的一般的步驟；4.能夠說出在微生物分離純化實驗中可以選用 平板劃線法或系列稀釋和涂布平板法。. . . 以“殺死禽流感病毒”為背景材料，設計問題，導入新課；首先直接闡明培養基的概念，類型，基本成分，配置原則；再提出無菌技術，列表比較消毒和滅菌的區別，接著以牛肉膏蛋白胨固體培養基配制過程為例講解培養基的配制；然后講解純化大腸桿菌的實驗，以圖文結合的形式了解平板劃線法的有關實驗操作，稀釋涂

2、布平板法的操作過程；最后通過課堂檢測，完善內化課堂知識。 通過圖文結合，實驗演示，對培養基的配置有全面的了解，通過熟悉的日常生活中的有關消毒和滅菌的情況，掌握更科學的消毒和滅菌的技術。以制備牛肉膏蛋白胨固體培養基為例講解培養基的配制過程，通過設計問題，引發學生思考，學習實驗操作過程；對于平板劃線法也是教學中的一個重點和難點，在教學中老師先演示實驗的具體操作，再結合課本知識融會貫通，以此突破本節重難點內容。. . . 1.微生物有哪些營養方式（代謝類型）? 你能各舉一例?2.含C、H、O、N的大分子有機物可做異養微生物的碳源、氮源、能源 ？ 3.你能說出幾種滅菌方法?. . . 微生物研究和應用

3、的前提：如何獲得純凈培養物防止雜菌入侵，獲得純凈的培養物合適的營養和環境條件確保其他微生物無法混入. . . 1.概念： 人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。2.類型：按物理性質劃分：按化學成分劃分：按用途劃分：一、培養基. . . 有 無 凝固劑瓊脂固體培養基液體培養基分離 鑒定工業 生產（1）按物理性質劃分：. . . 單個或少數菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.意義：1.定義：鑒定菌種的重要依據固體培養基上大量繁殖子細胞群體菌落. . . 天然培養基合成培養基化學成分不恒定的天然有機物如：牛肉膏蛋白胨培養基、馬鈴薯培養基化學成分完全了解的

4、物質配制而成的培養基如：高氏1號培養基、查氏培養基。用于分類和鑒定（2）按化學成分劃分：. . . 基礎培養基鑒別培養基含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養物質將某種類微生物從混雜的微生物群體中分離出來用于鑒別不同類型微生物的培養基選擇培養基（3）按用途劃分：. . . 幾種選擇培養基加入青霉素的培養基分離酵母菌、霉菌等真菌不加氮源的無氮培養基分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養基分離自養型微生物. . . 3.基本成分碳源、氮源、水、無機鹽碳源無機碳源：有機碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養微生物異養微生物氮源無機氮源：有機氮源：NH4、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿

5、素等注：含C、H、O、N的有機物是異養型微生物的碳源、氮源、能源. . . 4. 配制原則(1)目的明確：(2)營養全面、濃度適宜、比例恰當(3)適宜的pH值：有機碳源異養型：根據微生物的種類、培養目的選擇原料自養型：不加碳源加入緩沖劑細菌偏堿，真菌偏酸（CO2碳源）生產科研微生物生長不可缺少的微量有機物如：維生素、氨基酸、堿基等 (4)特殊營養：. . . 蛋白胨:動物蛋白初步消化的產物，富含有機氮化合物，也含有一些維生素和糖類。主要提供氮源和維生素。 牛肉膏：新鮮牛肉經過剔除脂肪、消化、過濾、濃縮而成，含有多肽類、氨基酸類、核苷酸類、有機酸類、礦物質類及維生素類的水溶性物質。提供碳源、氮源

6、、能源、磷酸鹽和維生素。. . . 二、無菌技術防止外來雜菌的污染1.哪里需要無菌？2.如何控制無菌？無菌的意義：. . . （1）實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。（2）培養的器皿、接種用具和培養基等器具進行滅菌。（3）為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。（4）實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。 1.無菌的范圍. . . （1）消毒（2）滅菌概念較為溫和理化方法殺死部分有害微生物(不包括芽孢和孢子)強烈的理化因素殺死所有的微生物包括芽孢和孢子常用方法煮沸消毒法巴氏消毒法化學藥劑消毒法紫外線消毒法灼燒消毒法干熱滅菌高壓蒸汽滅菌適

7、用對象操作空間、液體、雙手等接種環、接種針、玻璃器皿，培養基等2.無菌的方法. . . 芽孢：在某些細菌生長的一定階段，細胞內形成一個圓形、橢圓形或柱形的，抗逆性強的休眠體。 孢子：真菌所產生的一種有繁殖或休眠作用的細胞，能直接發育成新個體。 . . . 接種室內空氣、接種箱、超凈工作臺用紫外線照射30min紫外線消毒實驗者的手臂、實驗臺等酒精、氯氣、石炭酸、煤酚皂溶液化學藥劑消毒牛奶等不宜高溫消毒滅菌的70 75,30min； 75,15min巴氏消毒日常食物、罐裝食品100,56min煮沸消毒法適用范圍條件方法（1）消毒. . . 1530min100kPa，121 培養基、實驗器材高壓蒸

8、汽滅菌高壓蒸汽滅菌12h干熱滅菌箱（160170 ）耐高溫需干燥的物品（玻璃器皿等）干熱滅菌干熱滅菌燒紅酒精燈火焰充分燃燒層灼燒接種的工具、試管口、瓶口灼燒滅菌灼燒滅菌滅菌時間滅菌時間所需條件所需條件適用對象適用對象滅菌方法滅菌方法灼燒灼燒滅菌滅菌干熱滅菌箱干熱滅菌箱高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽滅菌鍋（2）滅菌. . . 1. 1. 器具的滅菌器具的滅菌2. 2. 培養基的配制培養基的配制3. 3. 培養基的滅菌培養基的滅菌4. 4. 倒平板倒平板5. 5. 微生物接種微生物接種6. 6. 恒溫箱中培養恒溫箱中培養7. 7. 菌種的保存菌種的保存微生物實驗室培養的基本操作程序微生物實驗室培養的基本操

9、作程序. . . 大腸桿菌的純化培養：（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養基三.實驗操作（二）純化大腸桿菌. . . 1000ml牛肉膏蛋白胨培養基的配方H2O 定容至1000mlNacl 5g蛋白胨 10g牛肉膏 5g瓊脂20.0g1.計算：培養基用量依配方計算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙 、少量水加熱溶解 取紙蛋白胨、NaCl瓊脂、攪拌補水定容4.調pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：加棉塞、包牛皮紙、橡皮筋勒緊（一）制備培養基培養基高壓蒸汽滅菌，培養皿干熱滅菌. . . 計算稱量溶化調節pH滅菌倒平板1.將培養皿放在

10、火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養基的錐形瓶，左手撥出棉塞。12342.右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。3.用左手將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養基(約1020mL)倒入培養皿，左手立即蓋上皿蓋。4.等待平板冷卻凝固（約需5 10min）。然后，將平板倒過來放置，使皿蓋在下，皿底在上。. . . 1.培養基滅菌后，需要冷卻到50左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的溫度？答：可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。. . . 4.在倒平板的過程中，如果不小心

11、將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？答：最好不要用這個平板培養微生物。 防止空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之 間的培養基上滋生。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？答：防止皿蓋上的水珠落入培養基造成污染 避免培養基中水分過快蒸發。. . . 無菌檢查：將滅菌的培養基放入37的溫室中培養2448小時，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。5.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？. . . 單個或少數菌體1.定義：固體培養基上大量繁殖子細胞群體（肉眼可見）菌落2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。（二）純化大腸桿菌（二）純化大腸桿菌. . . 單個

12、細胞單個菌落從混雜的微生物群體中獲得只含某一種微生物的過程。 何為分離純化？如何純化？接種常見方法平板劃線法操作核心防止雜菌污染，保持培養物純度如何分散成單個細胞？稀釋涂布平板法斜面接種穿刺接種微生物群分散. . . 1.1.平板劃線法：平板劃線法：分區劃線法連續劃線法（1）概念與原理：聚集的菌群連續劃線稀釋分散單個細胞菌落生長繁殖. . . (2)“(2)“平板劃線平板劃線”實驗操作實驗操作. . . 第一區劃線第一區劃線滅菌接種環滅菌接種環第二區劃線第二區劃線滅菌接種環滅菌接種環第三區劃線第三區劃線滅菌接種環滅菌接種環滅菌接種環滅菌接種環. . . （1）為什么在操作的第一步以及每次劃線之

13、前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時,仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數目逐漸減少，直至得到單個細胞殺死接種環上原有微生物目的接種結束后每次劃線前取菌種前灼燒時期. . . （2）在灼燒接種環之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？ 答：以免接種環溫度太高，殺死菌種。（3）在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單

14、個細菌繁殖而來的菌落。. . . 3個劃線平板1個不劃線平板（重復實驗）（空白對照）（3）培養放入37恒溫箱中培養12h24h. . . 2.2.稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法菌液的梯度稀釋：涂布平板操作：(1)概念與原理：聚集的微生物單個細胞菌液梯度稀釋菌落涂布平板(2)操作：生長繁殖. . . 系列梯度稀釋操作9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水注意：移液管需要經過滅菌；試管口和移液管離火焰12cm處。9mL無菌水. . . 涂布平板涂布平板操作：操作：. . . (1)涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進

15、行無菌操作？答：應從操作的各個細節保證“無菌”。例如:酒精燈與培養皿的距離要合適 吸管頭不要接觸任何其他物體 吸管要在酒精燈火焰周圍等等. . . 各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍放入37恒溫箱中培養12h24h（2）培養. . . 1.臨時保藏： 試管固體斜面培養基上42.長期保存：菌種易被污染、變異甘油管藏1ml甘油1ml菌液20四.菌種的保存36個月，轉移培養. . . 五.成果評價 如果未接種的培養基在恒溫箱中保溫12d后無菌落生長，說明培養基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養基上出現了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求。（一）培養基的制作是否合格. . . （三）是否進行了及時細致的觀察與記錄 培養12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發現這一點，并