1、第32卷 增刊1 農 業 工 程 學 報 Vol.32 Supp.1290 2016年 1月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Jan. 2016用于生物質酶解過程的纖維素酶研究進展何敏超，許敬亮，陳小燕，孔曉英，袁振宏，張 宇，余 強，劉云云，王 聞（中國科學院廣州能源研究所，中國科學院可再生能源重點實驗室，廣州 510640）摘 要：纖維素酶解效率是木質纖維素經濟、高效生化轉化的限制瓶頸。該文討論了影響纖維素酶酶解經濟性與高效性的多個要素，如：高濾紙酶活菌株的選育、發酵、酶解機理、酶解影響因素及酶

2、解混合體系的優化等。該文研究表明，纖維二糖水解酶可能是決定發酵體系中濾紙酶活高低的關鍵單酶組分，同時，該酶可能也是預處理后生物質酶解體系中決定濾紙酶活效率的關鍵單酶組分。酶解過程中關鍵限速反應的認識及關鍵限制因素形成機制的揭示將成為纖維素酶生化轉化研究的重點，這些機理機制的建立可為構建高比活力纖維素酶提供理論依據。 關鍵詞：生物質；酶；纖維；濾紙酶活；纖維素酶；AA9裂解酶；生化轉化 doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.z1.040 中圖分類號：Q556; Q557 文獻標志碼：A 文章編號：1002-6819(2016)-Supp.1-0290-07 何敏超

3、，許敬亮，陳小燕，孔曉英，袁振宏，張 宇，余 強，劉云云，王 聞. 用于生物質酶解過程的纖維素酶研究進展J. 農業工程學報，2016，32(增刊1)：290296. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.z1.040 He Minchao, Xu Jingliang, Chen Xiaoyan, Kong Xiaoying, Yuan Zhenhong, Zhang Yu, Yu Qiang, Liu Yunyun, Wang Wen. Progress of cellulase that using for biomass

4、 hydrolysis processJ. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2016, 32(Supp.1): 290296. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.z1.040 0 引 言石油、煤炭、天然氣等不可再生資源是當前最主要的能源物質與化工原料，也是日益枯竭的不可再生資源1-2。因此，積極尋找可再

5、生的替代能源與化工原料，已成為迫切需要解決的問題。將數量巨大的纖維原料降解轉化為液體燃料及高值化學品具有重大的意義3-4。但是，一些限制因素阻礙了木質纖維素生化轉化的經濟性與高效性。其中，纖維素酶應用成本過高是制約纖維乙醇及高值化學品商業化的瓶頸因素5。纖維乙醇是大宗低價產品，這決定了該領域的纖維素酶價格必須最大限度的低廉。纖維素酶酶解的經濟性與高效性不僅決定于菌的發酵性能及生產成本，也取決于纖維素的酶解體系。因此，本文圍繞纖維素酶的生產與酶解，討論了影響纖維素酶用酶成本的多個要素，并針對目前研究中的問題，預測了該領域的研究方向。 收稿日期：2015-05-09 修訂日期：2015-10-18

6、基金項目：國家高技術研究發展（863）計劃（2012AA101802和2013AA065803），國家自然科學基金（21306196），廣東省科技攻關項目-工業高新技術領域科技計劃項目（2013B010403021）廣州市科技攻關項目（2013J4300026）作者簡介：何敏超，男，陜西合陽人，中國科學院廣州能源研究所助理研究員，碩士，主要從事纖維素酶工程方面的研究。廣州 中國科學院廣州能源研究所，中國科學院可再生能源重點實驗室，510640。 Email：hemc 通信作者：袁振宏，男，研究員，博士生導師，從事生物質生化轉化技術開發和管理。廣州 中國科學院廣州能源研究所，中國科學院可再生能源

7、重點實驗室，510640。Email：yuanzh1 高濾紙酶活菌株的篩選、選育及工程菌構建高活力纖維素酶菌株的發酵性能對于最終的酶解成本具有重要的決定作用。研究人員一般通過自然篩選、誘變及工程菌構建來獲得高濾紙酶活的菌株。 1.1 產纖維素酶微生物的種類纖維素酶高產菌株主要分布于少數的幾個種屬，如木霉屬、曲霉屬、青霉屬，其它多個種屬的產纖維素酶菌株也有報道3,6。不過，其濾紙酶活與上述幾個種屬存在明顯的差距。自然界篩選的菌株是誘變選育及工程構建的基礎，因此，積極篩選高活力纖維素酶菌株依然具有重要的應用價值。1.2 高濾紙酶菌株的篩選自然界中，能夠產纖維素酶的微生物種類繁多，不過，能夠高水平產

8、酶的微生物種類極少7。可超高水平產濾紙酶活（FPA，filter paper activity）的菌株則更為稀有。從自然界篩選高活力纖維素酶的菌株，具有較大的盲目性、偶然性與隨機性。從自然界篩選高活力菌株，正確的篩選方法很關鍵。不過，正確的篩選方法只是增大了高活力菌株不被漏選的機率。更重要的則是對高活力菌株在自然界分布規律的認識。采集的樣品從根本上決定了該批次的篩選是否可以獲得高活力菌株。揭示高活力菌株在自然界的分布規律具有較大的難度。不過，Ettema C H及Sun B等指出，正是由于土壤的異質性與多變性，使得分布其中的微生物具有可預測性及可指示性8-9。因而，以少數幾種土壤學性質構建一個

9、簡便、高效的指示乃至預測體系來表征高活力菌株在自然界的分布規律是可行的。增刊1 何敏超等：用于生物質酶解過程的纖維素酶研究進展291迄今為止，從自然界篩選的濾紙酶活菌株，其液態發酵酶活范圍為：0.025.00 FPIU/mL10。絕大多數自然篩選菌株，其酶活很難高于5.00 FPIU/mL。Trichoderma reesei QM6a的濾紙酶活為0.505.00 FPIU/mL，斜臥青霉Penicillium decumbens JU-A10的誘變出發菌株P. decumbens 114-2從自然界獲得時，其酶活為0.35 FPIU/mL11。Menon V從自然界篩選到超高濾紙酶活菌株，其

10、FPA高達200.00 FPIU/g12，不過，未見該菌的商業化報道。1.3 高濾紙酶菌株的選育中國纖維乙醇領域應用最廣泛的纖維素酶依然是來自于里氏木霉Trichodema reesei Rutgers C-30與斜臥青霉Penicillium decumbens JU-A10。里氏木霉T.reesei RUC-30的液態發酵酶活在12.2057.00 FPIU/mL10,13，Penicillium decumbens JU-A10的發酵酶活在18.90 FPIU/mL14，FPA產率為160.00 FPIU/L·h。而Belghith H 15利用一株誘變的青霉進行發酵，其酶活力

11、高達23.00 FPIU/mL。這些誘變菌都借助了紫外線、N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（NTG）的誘變，且經歷了漫長的優勢積累過程。當前，常用的高效的誘變方法是紫外線、硫酸二乙酯、NTG和亞硝基甲基脲（NMU）16。其中，NTG與NMU因為具有優異的誘變效果而被譽為超誘變劑。利用多種誘變方法在較短的時間（12 a）獲得突破性的進展具有較大的難度。不過，采用正確的誘變技術在較短的時間里獲得階段性的成果則是有可能的。T.reesei RUC-30與Penicillium decumbens JU-A10已成為高濾紙酶活菌株選育史上的里程碑。其中，Penicillium decumbens JU

12、-A10這項科技成果獲得國家科技進步二等獎。遺憾的是，T.reesei RUC-30仍不符合纖維素乙醇的用酶要求。因此，超越這座技術高山，依然是一項既迫切又艱巨的任務。抗代謝阻礙特性的菌株是獲得高活力濾紙酶活誘變菌株的重要途徑。當生物質轉化率為75%時，纖維素酶的用酶量為1015 FPIU/g葡聚糖或者2030 mg蛋白/g葡聚糖17。2014年，李靜波18利用7.5 FPIU/g葡聚糖的酶解量時，纖維素的酶解率高達82%。也有以每加侖多少美元表征酶的應用成本。2006年，纖維素酶應用成本降低到2030美分/加侖乙醇。然而，纖維素酶的用酶成本還需進一步降低至34美分/加侖乙醇19。降低纖維乙醇

13、制造成本是一個系統的工作。不同因素所占的比重不同。如預處理的成本是0.3美元/加侖纖維乙醇20，而纖維素酶的用酶成本是0.150.30美元/加侖纖維乙醇21。多個因素相互影響，因此，降低纖維乙醇生產成本需要多個環節的相互協調，以更有效地降低纖維乙醇的制造成本。1.4 高濾紙酶工程菌的構建高濾紙酶活菌株的誘變選育往往需要跨越十幾年乃至幾十年的漫長歲月。因此，誘變選育技術已經越來越多地被基因工程、合成生物學、系統生物學等日新月異的技術所替代。一般而言，將纖維素酶酶系中的某個單酶基因成功表達后，其酶活是出發菌株的幾倍乃至數百倍。但是，該重組菌濾紙酶活的提高幅度往往不大22。因此，需要將各個單酶基因分

14、別進行高效表達后再進行復配優化以有效地提升濾紙酶活的酶解效率。2 高濾紙酶活菌株的發酵菌株最終的發酵酶活首先取決于菌株自身的特性，此外，發酵方式、發酵工藝、培養基成分也能夠顯著地影響最終的酶活。如：利用RUT C-30進行液態發酵，其濾紙酶活范圍為0.7857.00 FPIU/mL10，最高酶活是最低酶活的73.08倍。2.1 高濾紙酶活菌株的發酵方式不同種類的菌，其最佳的發酵方式因微生物的種類而異。里氏木霉的液態批處理補加模式明顯優于分批發酵方式。RUT C-30在液態批處理發酵方式下，其酶活為4.9518.00 FPIU/mL10,23。在液態分批補料發酵方式下，其濾紙酶活、酶活產率、每克

15、干物質濾紙酶活分別為：3010,2457 FPIU/mL，201 FPIU/L·h和226 FPIU/g發酵碳源。因此，里氏木霉RUT C-30最佳的發酵方式是液態分批補料發酵，而不是固態發酵。黑曲霉的最佳發酵方式則是固態發酵。具體的原因則需進一步的研究。此外，Fang X等25在采用誘變菌株Acremonium cellulolyticus strain C-1進行液態批處理發酵時，其濾紙酶活、酶活產率、每克干物質濾紙酶活分別為：18.00 FPIU/mL、150.00 FPIU/L·h和360.00 FPIU/g發酵碳源。而在使用液態分批補料發酵條件下，該菌的濾紙酶活、

16、酶活產率、每克干物質濾紙酶活分別為：34.60 FPIU/mL、240.30 FPIU/L·h和346.00 FPIU/g發酵碳源。濾紙酶活及酶活產率增幅分別為92.22%與60.20%。2.2 高濾紙酶活菌株發酵原料的預處理發酵原料的預處理方法對于最終的發酵酶活也具有重要的影響。Xin F等26利用飽和蒸汽處理后的原料進行發酵，其酶活是1%、3%氫氧化鈉處理方法酶活的3倍。而Madamwar D等27利用Aspergillus niger菌株進行固態發酵，甘蔗渣、玉米芯與鋸末預處理后的酶活是未處理酶活的3倍左右。該研究中，不同的發酵原料皆以5M NaOH處理的效果最好。Beatri

17、z M P P 使用P. echinulatum 9A02SI進行搖瓶發酵，預處理后的濾紙酶活是未處理酶活的6倍28。因此，選擇一種適宜的預處理方法對發酵原料進行預處理，可以數倍地提高濾紙酶活。2.3 在發酵體系中決定濾紙酶活高低的纖維素單酶成分在纖維素酶酶解木質纖維素的體系中添加-葡萄糖苷酶可以顯著提升纖維素酶的酶解率29。因此，-葡萄糖苷酶被廣泛地認為是纖維素酶酶解時最關鍵的纖維素單酶30。此外，該酶也被認為是里氏木霉發酵體系中制約濾紙酶活高低的限制酶。292農業工程學報（） 2016年在Madamwar D等研究結果27的表1中，分別以外切纖維素酶（

18、CBH）、內切纖維素酶（EG）及-葡萄糖苷酶（BGL）與FPA進行回歸分析時發現，3種酶的決定系數在液態和固態條件下分別是：0.8505、0.6953、0.9416和0.9205、0.9182、0.9708；其回歸方程在液態與固態條件下分別是：y=0.8807x1.0707、y=0.4739x3.2611、y=0.7103x1.3327及=0.7237x1.5135、y=0.5942x5.3486、y=0.7199x1.0722。在固態及液態發酵條件下，BGL的決定系數都最大。這在一定程度上說明了BGL與FPA的關系最為密切。不過，在液態發酵及相同的酶活增量下，CBH對于FPA的貢獻要大于BG

19、L與EG。而在固態發酵及相同的酶活增量下，CBH對于FPA的貢獻要小于BGL。因此，較難得出究竟是哪種單酶才是決定發酵體系中FPA高低的關鍵酶。在對CBH、EG、BGL及FPA之間的關系進行大范圍地分析與歸納時，單酶對于FPU的相對重要性存在爭議。在對大量文獻中各個單酶的超高酶活進行歸納與概括時，可以看到：EG、BGL、FPA及CBH的超高酶活分別為2 358 IU/mL31，1 400 IU/mL32，57 IU/mL24及23 IU/mL33。CBH的超高酶活遠小于其它3種酶的超高酶活。因此，作者認為CBH才是現階段決定濾紙酶活高低的關鍵酶。Cochet N34也指出，FPA酶活高低與BG

20、L酶活無關，而是與CBH有關。作者對篩選分離到的數百株纖維素酶菌進行多個時間點的酶活檢測，以濾紙或羧甲基纖維素鈉為底物反應后進行沸水浴，可觀察到刻度試管中反應體系顏色深度的明顯增加。在以微晶纖維素為底物反應后進行沸水浴，肉眼幾乎觀察不到顏色深度的增加。這或許在一定程度上可以解釋為什么CBH是限制FPA酶活高低的關鍵單酶因子。CBH成為制約FPA酶活高低的原因可能在于其對微晶纖維素酶解的效能較低。Cruys-Bagger N，Fox JM和Kurasin M等指出：CBH在沿著纖維鏈前進時，常常會因某些障礙而停止其前移的進程35-37。可見，CBH是限制菌株濾紙酶活高低的關鍵酶組分。FPA是纖維

21、素酶在生物質生化轉化領域最主要的應用指標，因此，CBH可能是生物質生物化學轉化過程中最關鍵的限制性單酶因子。3 纖維素酶的酶解機理及生物質原料的酶解影響因素纖維素酶解機理與纖維原料預處理后酶解機制的認識不僅有利于降低纖維素酶的用酶成本，而且對于纖維素酶高產菌株的篩選、選育、構建及纖維素酶蛋白質工程優化都具有積極的指導意義。 3.1 纖維素酶的酶解機理當前，普遍接受的酶解機理是CBH、EG與BGL協同作用降解微晶纖維素。已有研究人員對多個纖維素酶的協同作用開展了深入的研究。Igarashi采用原子力顯微鏡（atomicforce microscope，AFM）技術來研究CBHI與CBHII之間的

22、協同作用，發現同時加入2種酶所產生的纖維二糖總量要高于2種酶分子各自產糖量的簡單加合38。Wang等利用AFM技術研究CBHI、CBHII和EGI三種酶不同的加入順序，其協同程度因加入順序而異39。現在，CBHI酶解結晶纖維素的過程被假設為6步，具體為36,40-41：a）CBHI通過CBM吸附于微晶纖維素表面，b）CBHI在纖維表面擴散、通過催化中心發現并識別纖維素鏈末端，而后形成酶-微晶纖維素復合物，c）纖維素鏈穿線于活性位點通道并形成生產型的酶-底物復合物，d）糖苷鍵的水解，e）釋放纖維二糖，f）下一個纖維二糖單位的穿入并再次形成生產型復合物。步驟d與f不斷循環直到復合物的解聚或者遇到阻

23、礙物。借助于蛋白純化、基因突變、Hs-AFM等技術手段，已經就酶解機理與酶解過程展開了分子水平上的研究42。如：活性通道與起始反應有關的關鍵氨基酸43、纖維素結合通道對于纖維素鏈末端的起始反應44、預穩態35以及該酶解起始反應與可持續性反應的限速因子36。深入研究酶解過程中的限速反應及該限速反應的形成機制，可以為高比活力CBH蛋白質工程優化指明方向，也可為酶解體系優化，降低纖維素酶用酶成本提供理論依據。 3.2 木質纖維素酶解效率的影響因素生物質酶解效率不僅僅取決于酶的可及性與高效性，也與生物質的結構特征密不可分。生物質的結構特征可分為化學的與物理的。化學特征指的是纖維素、半纖維素、木質素及結

24、合于半纖維素之上的乙酰基團。物理特征指的是表面積、可及性、結晶度、生物基質中木質素的分布、聚合度、孔容積與粒徑。一種結構特性的變化會導致其它結構特性的變化。此外，生物質的異質性與酶的多樣性使得充分理解酶與底物的相互作用顯得比較困難。因此，在確定生物質預處理后限速反應的關鍵影響因子時存在較大的難度45。限速反應的關鍵影響因素可能是幾個生物質結構特征的綜合46。3.2.1 微晶纖維素酶解過程中的關鍵纖維素酶組分Wang等利用Trichoderma pseudokoningii S-38的纖維素酶來酶解經過除蠟去脂處理的棉纖維47。研究者觀察到CBHs的酶活在第2天及第4天時分別下降為起始酶活的50

25、%和15%。在相同的酶解體系中，EG在10d之后才降為起始酶活的50%，此后該酶以緩慢的速率持續降低。FPA與BGL的酶活降低趨勢與EG相似，不過，FPA在后期酶活降低的速度比EG和BGL該文中可以看到，只有CBH的相對酶活總是低于FPA的相對酶活。因此，Wang認為，FPA活力的降低主要歸因于CBHs酶活力的降低。由于FPA代表著纖維素酶的糖化力，因此，CBHs酶活力的降低才是纖維素酶解速率降低的主要因素。不過，該研究采用的是棉纖維，因此，預處理后生物質酶解過程中的關鍵纖維素酶組分依然需要采用生物質來檢測。3.2.2 纖維素結晶度、晶型對于纖維素酶解的影響生物質預處理后，纖維素結晶體的聚集狀

26、態（晶型）會發生變化。纖維素晶型的變化可能是生物質可酶解性提升的主要因素。增刊1 何敏超等：用于生物質酶解過程的纖維素酶研究進展2932006年，Igarashi采用來源于里氏木霉的Cel7A（CBH I）酶解不同晶型的纖維素，該酶對晶型Ia的酶解活性是晶型I的2倍48。采用水熱處理將Ia轉化為I后，Cel7A對其酶解活力與天然纖維素的I就是說，吸附態Cel7A的酶解活力決定于微晶纖維素的晶型。表面強度與特異活性清楚地表明，Ia更高的降解度主要是由于Ia具有更高的酶特異活性而不是由于更大的表面積。更深層次的原因可能是由于Ia與I對于Cel7A 的CBD 或CD存在著空間位阻的差異。2007年，

27、Igarashi在利用來源于里氏木霉的Cel7A進行酶解時，盡管吸附于纖維素I 上的纖維素酶量是纖維素IIII酶量的2倍多，而纖維素IIII酶解后纖維二糖的產量是纖維素I的5倍多，并且纖維素IIII上的Cel7A特異活性3倍多地高于纖維素I49。采用水熱處理將纖維素IIII轉化為I后，纖維二糖的產量顯著下降。這表明，纖維素IIII提高的酶解率與纖維素晶型結構有關。纖維素的起始結晶度在酶解反應中發揮著主要的限速作用。不過，很難得出結晶度是酶解速率的關鍵決定因素。隨著結晶度的增加，結晶度與起始酶解率的相關性持續下降。在較高的結晶度下，纖維素樣品的酶解活性更低，酶解可及性更小。纖維素的結晶度與可及性

28、緊密相關50。廣泛認可的是，相較于無定型纖維素，高度結晶化的纖維素，其可及性更低。因此，結晶度與酶解效率負相關45。不過，Kim的結論與之相反51。去木質素后，纖維素結晶度從43%增加到60%，然而，增加的結晶度并沒有降低酶解第3天的糖產量。大量地去除木質素后可以得到高的降解度。而該降解度與乙酰基團以及結晶度無關。因此，結晶度可以顯著的影響起始的酶解速率，對于最終糖產量的作用較小。3.2.3 木質素對于纖維素酶解的影響木質素被認為是酶蛋白攻擊纖維素的主要空間阻礙物，因為木質素與纖維素微纖絲緊密相連而降低木質纖維素酶的可及性。通過去除木質素可以提高生物質的可降解性。去除木質素后，可以促進生物質的

29、溶脹、促使木質纖維素結構的斷裂，增加內部的接觸面與孔容積，降低木質素對于纖維素酶的不可逆吸附，增大纖維素的酶解可及度45。Kumar的研究結果表明，在纖維素酶較低的蛋白添加量（5 FPA/g cellulose）下，木質素成分能夠顯著地影響纖維素的溶脹程度與可及度，在此情況下，僅有16%的纖維素被酶解。該底物進一步去除木質素后，纖維素則幾乎完全酶解52。在較低的纖維素酶添加量下，木質素降低糖產量主要是因為限制酶的可及性與非生產型結合。不過，當木質素未限制纖維素的膨脹與和酶的可及性時，纖維素酶在木質素上的吸附作用對于酶解的影響作用降低。在纖維素的可及度提高后，即使在高濃度的木質素下，依然能夠得到

30、良好的酶解效率。 3.3 添加非纖維素酶的多酶體系的優化添加非纖維素酶組分的酶蛋白，如非水解酶蛋白AA9（auxiliary activity family 9）、木聚糖酶等，可以顯著地促進纖維素的酶解率，從而大幅度地降低用酶成本。 3.3.1 非水解蛋白對于纖維原料酶解的促進作用AA9現在被認為是具有木質纖維素酶活力的酶蛋53白。AA9之前被命名為蛋白GH61。AA9蛋白可以7倍之巨地降低玉米秸稈預處理后纖維素酶的用酶成本54。由此可見，積極探索新的非水解蛋白具有重要的意義。研究人員已圍繞AA9蛋白的多樣性、反應機理、結構與功能的關系及該蛋白的基因表達展開了研究。該酶的酶解機理不同于纖維素酶

31、及半纖維素酶的水解活性，而是一種裂解活性。AA9酶基因幾乎存在于所有的產纖維素酶真菌，并與纖維素酶、半纖維素酶及其它輔酶共處于同一個調節系統。此外，擴張蛋白（Expansins）及膨脹素（Swollenin）也能夠增強纖維素酶的酶解55。其機理可能是擴張蛋白能夠打斷氫鍵而降低了纖維素的結晶度并最終增加了纖維素的可及性。3.3.2 纖維素酶與木聚糖酶之間的酶系優化木聚糖在纖維素酶作用于纖維素時形成了一定的空間位阻效應56，而木寡糖對于纖維素酶具有一定程度的抑制作用57-59EGII, CBHI和CBHII并最終顯著地地降低葡萄糖的產率57,59。60Hu J等以木聚糖酶的補加方式及部分替代方式來

32、研究該酶對于纖維素酶酶解效果的影響。在補加方式中，35 mg的纖維素酶+60 mg的木聚糖酶獲得最高的纖維素及木聚糖水解率，分別為87.1%與100%，2種酶的協同系數為1.02。在部分替代方式中，5 mg的纖維素酶+30 mg的木聚糖酶獲得最佳的纖維素及木聚糖水解率，分別為82.3%與98.6%。此時，木聚糖酶替代纖維素酶的蛋白量高達86%，2種酶的協同系數為1.62。由此可見，采取適當的添加方式與適宜的木聚糖酶添加量，可以大幅度地降低纖維素酶的用量。Li J等18以氫氧化鈉、硫酸、雙氧水及蒸汽爆破的方法對甘蔗渣進行預處理，然后以纖維素酶與木聚糖酶進行混合酶解。在保持纖維素酶與木聚糖酶酶蛋白

33、總量不變的情況下酶解氫氧化鈉預處理原料，4份纖維素酶+1份木聚糖酶所產的葡萄糖量遠高于全纖維素酶的葡萄糖產量，即木聚糖酶可以替代20%的纖維素酶。該研究還指出，木聚糖酶與纖維素酶的協同程度與木聚糖含量、酶解時間有關。而且，預處理方法可以顯著影響2種酶的協同作用。4 總 結1）外切纖維素酶（circumscribed cellulose, CBH）可能是發酵體系中決定濾紙酶活（filter paper activity, FPA）高低的關鍵因子，同時，也可能是酶解預處理后木質纖維素體系中決定FPA效率的關鍵因子。纖維乙醇領域中，FPA是纖維素酶最重要的應用指標，因此，CBH可能是決定生物質生化轉

34、化領域纖維素酶解效率經濟性與高效性最關鍵的限制酶。CBH之所以成為限制FPA高低的關鍵因子，仍需在分子水平上對于酶解機理進行深入的研究。294農業工程學報（） 2016年Progress in Energy and Combustion Science, 2012, 38(4): 522550.13 Mclean D D, Abear K, Podruzny M F. Fed-batch productionof cellulase using Thichoderma reesei Rutgers C-30J. The canadian journal o

35、f chemical engineering, 1986, 64(8): 588597.14 方詡，秦玉琪，李雪芝，等. 纖維素酶與木質纖維素生物降解轉化的研究進展J. 生物工程學報，2010，26(7)：864969.Fang Xu, Qin Yuqi, Li Xuezhi, et al. Progress on cellulase and enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomassJ. Chinese Journal of Biotechnology, 2010, 26(7): 864869. (in Chinese with Engli

36、sh abstract)15 Belghith H, Ellouz-Chaabouni S, Gargouri A. Biostoning ofdenims by Penicillium occitanis (Pol6) cellulasesJ. Journal of Biotechnology, 2001, 89(2/3): 257262. 16 楊汝德. 現代工業微生物學教程M. 北京：高等教育出版社，2006：257259.17 Blanch H W. Bioprocessing for biofuelsJ. Current opinionin biotechnology, 2012,

37、23(3): 390395.18 Li J, Zhou P, Liu H, et al. Ethanol production fromxylan-removed sugarcane bagasse using low loading of commercial cellulaseJ. Bioresource technology, 2014,163(7): 390394.19 Stephanopoulos G. Challenges in engineering microbes forbiofuels productionJ. Science, 2007, 315(5813): 80180

38、4. 20 Balat M, Balat H, Öz C. Progress in bioethanol processingJ.Progress in Energy and Combustion Science, 2008, 34(5): 551573.21 Chapple C, Ladisch M, Meilan R. Loosening lignins grip onbiofuel productionJ. Nature Biotechnology, 2007, 25(7): 746748. 22 何敏超，許敬亮，袁振宏，等. 纖維素酶基因表達研究進展J. 林產化學與工業，20

39、14，34(5)：169174.He Minchao, Xu Jingliang, Yuan Zhenhong, et al. Research progress in the expression of cellulaseJ. Chemistry and Industry of Forest Products, 2014, 34(5): 169174. (in Chinese with English abstract)23 Mandels M, Weber J, Parizek R. Enhanced cellulaseproduction by a mutant of Thichoder

40、ma virideJ. Applied Microbiology, 1971, 21(1): 152154.24 Hendy N A, Wilke C R, Blanch H W. Enhanced cellulaseproduction in fed-batch culture of Trichoderma reesei C30J. Enzyme and microbiological Technology, 1984, 6(2): 7377.25 Fang X, Yano S, Inoue H, et al. Strain improvement ofAcremonium cellulol

41、yticus for cellulose production by mutationJ. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2009, 107(3): 256261.26 Xin F. Geng A. Horticultural waste as the substrate forcellulase and hemicellulase production by Trichoderma reesei under solid-state fermentationJ. Applied biochemistry and biotechnology,

42、 2010, 162(1): 295306.27 Madamwar D, Patel S, Parikh H. Solid State Fermentation forCellulases and -Glucosidase Production by Aspergillus2）當前，中國的研究人員在纖維素酶的基因表達、表達載體的改造及優良宿主菌的構建方面已經取得一定的進展，但尚未獲得商業化的成果。國外公司如諾維信等生產的混合纖維素酶依然不能夠滿足生物質生化轉化領域的用酶要求。3）需要借助Hf-AFM技術來進一步研究分子水平的木質纖維素酶解機理、酶解過程中的限速反應以及該限速反應的形成機制。揭示

43、限速反應的形成機制和限速反應的關鍵因素，可以為高比活力纖維素酶的蛋白質工程優化提供理論支撐。4）利用多種手段來揭示自然界木質纖維素腐解的限速反應也具有重要的理論意義。參 考 文 獻1 孫永明，袁振宏，孫振鈞. 中國生物質能源與生物質利用現狀與展望J. 可再生能源，2006，162(2)：7882.Sun Yongmin, Yuan Zhenhong, Sun Zhenjun. The status and future of bioenergy and biomass utilization in ChinaJ. Renewable energy, 2006, 126(2): 7882. (i

44、n Chinese with English abstract)2 Wilson D B. Cellulases and biofuelsJ. Current opinion inbiotechnology, 2009, 20(3): 295299.3 Gusakov A V. Alternatives to Trichoderma reesei in biofuelproductionJ. Trends in biotechnology, 2011, 29(9): 419425.4 曲音波. 纖維素乙醇產業化J. 化學進展，2007，19(7/8)：10981108.Qu Yinbo. In

45、dustrialization of Cellulosic EthanolJ. Progress in Chemistry, 2007, 19(7/8): 10981108. (in Chinese with English abstract)5 Rubin E M. Genomics of cellulosic biofuelsJ. Nature, 2008,454(7206): 841845. 6 曲音波. 木質纖維素降解酶與生物煉制M. 北京：化學工7業出版社，2011：5061.Wang M, Li Z, Fang X, et al. Cellulolytic Enzyme Produ

46、ction and Enzymatic Hydrolysis for Second-Generation Bioethanol ProductionJ. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, 2012, 131(128): 124.Ettema C H, Wardle D A. Spatial soil ecologyJ. Trends in Ecology and Evolution, 2002, 17(4): 177183.Sun B, Wang X, Wang F, et al. Assessing the relative

47、 effects of geographic location and soil type on microbial communities associated with straw decompositionJ. Applied and environmental microbiology, 2013, 79(11): 33273335. Montenecourt B S. Trichoderma reesei cellulasesJ. Trends in biotechnology, 1983, 1(5): 156161.8 91011 曲音波. 木質纖維素降解酶系的基礎和技術研究進展J

48、. 山東大學學報：理學版，2011，46(10)：160170.Qu Yinbo. Progress in basic and technological research of enzyme system for lignocellulosics biodegradationJ. Journal of Shandong University: NaturalScience, 2011, 46(10): 160170. (in Chinese with English abstract)12 Menon V, Rao M. Trends in bioconversion of lignocel

49、lulose:Biofuels, platform chemicals & biorefinery conceptJ.增刊1 何敏超等：用于生物質酶解過程的纖維素酶研究進展 nigerJ. Journal of fermentation and bioengineering, 1989, 67(6): 424426.28 Pereira B P P, Thabata M A, Priscila S D, et al. Cellulaseon-site production from sugar cane bagasse using penicillium echinulatumJ. B

50、ioenergy Research, 2013, 6(3): 10521062. 29 Harnpicharnchai P, Champreda V, Sornlake W, et al. Athermotolerant beta-glucosidase isolated from an endophytic fungi, Periconia sp., with a possible use for biomass conversion to sugarsJ. Protein expression and purification, 2009, 67(2): 6169.30 Singhania

51、 R R, Patel A K, Sukumaran R K, et al. Role andsignificance of beta-glucosidases in the hydrolysis of cellulose for bioethanol productionJ. Bioresource technology, 2013,127(1): 500507.31 Akbarzadeh A, Siadat S O R, Motallebi M, et al.Characterization and high level expression of acidic endoglucanase

52、 in Pichia pastorisJ. Applied Biochemistry Biotechnolgy, 2014, 172 (4): 22532265.32 Singhania R R, Sukumaran R K, Rajasree K P, et al.Properties of a major -glucosidase-BGL1 from Aspergillus niger NII-08121 expressed differentially in response to carbon sourcesJ. Process Biochemistry, 2011, 46(7): 1

53、5211524.33 Juhász T, Szengyel Z, Réczey K, et al. Characterization ofcellulases and hemicellulases produced by Trichoderma reesei on various carbon sourcesJ. Process Biochemistry, 2005, 40(11): 35193525.34 Cochet N. Cellulases of Trichoderma reesei: influence ofculture conditions upon the

54、enzymatic profileJ. Enzyme and Microbiol Technology, 1991, 13(2): 104409.35 Cruys-Bagger N, Elmerdahl J, Praestgaard E, et al.Pre-steady-state kinetics for hydrolysis of insoluble cellulose by cellobiohydrolase Cel7AJ. The Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(22): 1845118458.36 Fox J M, Levine

55、 S E, Clark D S, et al. Initial-andprocessive-cut products reveal cellobiohydrolase rate limitations and the role of companion enzymesJ. Biochemistry, 2012, 51(1): 442452.37 Kurasin M, Valjamae P. Processivity of cellobiohydrolases islimited by the substrateJ. The Journal of Biological Chemistry, 20

56、11, 286(1): 169177.38 Igarashi K, Uchihashi T, Koivula A, et al. Traffic jamsreduce hydrolytic efficiency of cellulase on cellulose surfaceJ. Science, 2011, 333(6047): 12791282.39 Wang J, Quirk A, Lipkowski J, et al. Direct in situobservation of synergism between cellulolytic enzymes during the biod

57、egradation of crystalline cellulose fibersJ. Langmuir, 2013, 29(48): 1499715005.40 Jalak J, Kurasin M, Teugjas H, et al. Endo-exo synergism incellulose hydrolysis revisitedJ. The Journal of bio-logical chemistry, 2012, 287(34): 2880228815.41 Payne C M, Knott B C, Mayes H B, et al. FungalcellulasesJ. Chemical Reviews, 2015, 115(3): 13081448. 42 孟凡輝，蔣緒愷，劉琳，等. 纖維素酶解速度的可視化表征與限制因素分析J. 生物化學與生物物理進展，2015，42(3)：201210.295Meng Fanhui, Jiang Xukai, Liu Lin, et al. The Visual Representation for