1、項目名稱： 納米材料在骨、牙再生修復中的生物學起止年限：一、關鍵科學問題及研究內容（一）關鍵科學問題對植入式生物材料納米結構與機體反應的調控機理與作用機制進行深入研究和認識，將有助于解決納米生物醫(yī)用材料發(fā)展面臨的重大科學問題,發(fā)展具有我國自主知識產權的納米生物醫(yī)用材料，提高硬組織重大疾病診療水平奠定基礎，滿足我國社會經濟和人民健康事業(yè)發(fā)展的重大需求。圍繞上述國家重大需求，針對硬組織再生修復需要解決的重大科學問題，本項目擬設立4個課題，課題之間形成有機聯(lián)系，通過聯(lián)動與協(xié)作，重點解決以下共性關鍵科學問題：(1) 具有高生物相容性納米材料及其界面的設計與制備原理；(2) 材料表面納米結構與細胞、組織

2、之間的相互作用機理；(3) 納米結構對材料/組織界面生物力學匹配性、植入體長期力學穩(wěn)定性、植入體壽命的影響機制；(4) 納米生物醫(yī)用材料、材料/組織界面表征新手段、新方法（二）結合科學問題的內涵將開展的主要研究內容鈦合金種植體材料表面納米拓撲結構的結構梯度和成分梯度都會影響種植體材料與細胞的相互作用，因此本研究將定量研究不同表面納米功能梯度的新型鈦合金種植體材料對骨整合相關蛋白質組變化，對成骨細胞增殖分化、破骨細胞前體轉化以及成纖維細胞信號通路系列基因表達的影響，探索材料表面納米功能梯度結構設計對骨整合界面結合特性、細胞選擇過程及相關信號因子的影響規(guī)律，探討材料表面拓撲結構對成骨的控制作用，為

3、表面納米功能梯度的新型鈦合金牙種植體材料的設計、制備和調控提供科學理論依據(jù)。利用高分子（如聚酰胺PA）優(yōu)異的生物相容性及與頜骨松質骨極其接近的彈性模量以及其吸濕后微小的體積膨脹等特點，設計功能梯度涂層來調整PA涂層與鈦基體間熱膨脹系數(shù)，采用塑料火焰噴塑技術在蝕刻處理后的純鈦種植體表面形成一層類牙周膜功能的成分過渡的TiO2/TiO2-PA/PA高分子涂層，探討其應力緩沖和傳導特性，揭示其在結構和功能方面與天然牙周膜間的關聯(lián)及相似性，探索其模仿天然牙周膜行使功能的基礎及其與周圍組織間生物力學相容的機制，并利用蛋白質組學技術，從蛋白質分子水平，研究材料及表面仿生設計。牙齒硬組織仿生再生修復過程中再

4、生層與牙體組織界面結合強度直接影響修復的長期效果與穩(wěn)定。本項目將從納米尺度/蛋白質組水平探索納米材料在牙齒硬組織生物礦化過程中分子作用機制，合理設計和制造更加適合口腔環(huán)境臨床操作的牙釉質、牙本質原位再生修復的納米材料配方，建立基于納米材料的牙釉質、牙本質再生修復的新工藝及新理論，實現(xiàn)材料與牙齒硬組織中膠原蛋白和無機鹽形成多位點化學結合，解決界面結合的力學匹配性，賦予再生修復層長期力學穩(wěn)定性，延長再生修復層的壽命。通過對納米結構微環(huán)境特征對成骨相關細胞（主要是BMSCs）功能和分化調控的分子機制進行深入研究，建立材料特性與BMSCs定向分化之間的關聯(lián)，將利于獲得對頜骨組織再生重建機制的定量認識。

5、本研究針對口腔頜骨修復要求，擬開展微環(huán)境特征基因表達變化規(guī)律與成骨分化相關指標相互關系的研究，以檢測BMSCs成骨分化過程全基因組差異表達為基礎，分析成骨分化信號通路，研究BMSCs在各種微環(huán)境下的成骨誘導分化，探索納米結構特征對BMSCs成骨分化調控的機制，將更好地促進頜骨缺損組織修復并完成其功能重建，并配合牙種植體修復實現(xiàn)第三代口腔功能修復材料從學術研究到臨床治療應用的轉變。二、預期目標（一）總體目標本項目重點探討仿生自組裝及植入式口腔生物材料表面納米結構對宿主反應的調控機理，闡明納米材料與口腔牙、骨硬組織之間相互作用的生物學過程，為實現(xiàn)頜骨和牙齒再生修復過程中材料/組織界面的快速生物愈合

6、和長期生物力學相容提供新的思路和理論依據(jù)。闡明鈦種植體表面納米拓撲結構對細胞生長和相關信號通路的調控機制，實現(xiàn)種植體-骨組織界面有效結合的再生設計，促進種植體界面的快速骨整合；揭示鈦種植體表面低彈性模量納米復合涂層模仿天然牙周膜行使功能的基礎，實現(xiàn)種植體的長期穩(wěn)定性；明確類牙釉質、類牙本質再生層與牙體組織的界面結合機制及相關物理、化學、力學及生物性能；建立基于納米材料的牙釉質、牙本質再生修復的新工藝及新理論；闡明納米尺度材料微環(huán)境特征調控成骨相關細胞生物學行為的分子機制，在細胞/修復材料復合物植入體介導的頜骨組織再生機制理論認識方面取得突破。通過項目研究和國際合作與交流，產生重要創(chuàng)新性理論和實

7、用成果，培養(yǎng)一批青年學科骨干人才，并吸引留學博士、博士后回國工作。（二）五年預期目標(1) 構建功能梯度的新型鈦合金種植體，系統(tǒng)研究材料表面納米化技術序列處理所形成的納米梯度結構，及該梯度結構與組織有效結合機制和技術，從納米尺度/蛋白質組/基因水平，探索種植體表面拓撲結構對細胞生長和相關信號通路的控制機制，獲得具有多孔梯度結構新型鈦合金牙種植體材料成分設計和納米結構控制方法。(2) 構建鈦種植體表面獲得與牙周骨組織匹配的低彈性模量功能梯度高分子涂層，探討其應力緩沖和傳導特性，揭示其在結構和功能方面與天然牙周膜間的關聯(lián)及相似性，探索其模仿天然牙周膜行使功能的基礎及其與周圍組織間生物力學相容的機制

8、。獲得具有適宜彈性模量的牙種植體成分設計和納米結構控制方法。(3) 實現(xiàn)基于納米材料自組裝技術的牙釉質、牙本質原位再生；闡明類牙釉質結構、類牙本質結構的生長和組裝機制，揭示基于生物礦化原理納米羥磷灰石晶體可控有序生長、自組裝的規(guī)律；合理設計和制造更加適合口腔環(huán)境臨床操作的牙釉質、牙本質原位再生修復的納米材料配方，提出并驗證牙釉質、牙本質原位再生修復的臨床可行應用方案。(4) 通過仿生技術、納米技術、多相復合、多級結構構建、表面功能化和微圖案化等多項技術復合，獲得具有仿生納米結構的新型功能化頜骨修復材料；建立頜骨修復材料制備工藝參數(shù)納米結構細胞行為的定量關聯(lián)，揭示具有仿生結構支架材料與成骨相關細

9、胞相互作用實質；闡明納米結構微環(huán)境特征調控成骨相關細胞生物學行為的分子機制，在細胞/修復材料以及頜骨修復材料與牙種植體復合植入過程中頜骨組織再生重建機制方面取得突破；(5) 通過本項目研究，將開發(fā)出3-4種新型口腔納米生物醫(yī)用材料；在國內外申請發(fā)明專利15-20項；發(fā)表SCI論文30-50篇，培養(yǎng)博士、碩士研究生50人以上；承辦或主持召開國際學術會議2-3次；通過與國外研究機構開展合作與人員交流，培養(yǎng)青年學科骨干人才16人以上。三、研究方案（一）總體研究思路開發(fā)功能梯度的新型鈦合金材料，其彈性模量與不同部位的種植體-組織界面生物力學相適宜，系統(tǒng)研究材料表面納米化技術序列處理所形成的納米多孔梯度

10、結構，及該梯度結構與組織有效結合技術，通過細胞和動物實驗探索種植體表面納米形貌與組織界面結合特性、對細胞選擇過程及相關信號因子的影響規(guī)律，探索出種植體表面拓撲結構對細胞生長和相關信號通路的控制機制，實現(xiàn)種植體-骨組織界面有效結合的再生設計，獲得牙種植體表面納米化設計和納米結構控制方法。制備純鈦種植體表面TiO2/TiO2-PA/PA功能梯度涂層，考察噴塑工藝條件、原料組分比例、涂層厚度等對涂層形貌、彈性模量及附著強度的影響。并通過化學沉積法在表面定向生長HA晶體，提高PA涂層表面生物活性，考察沉積液濃度、沉積時間、沉積溫度、溶液pH值等因素對HA晶體形貌、生成量、晶體生長方向、結晶度以及在PA

11、涂層中沉積深度的影響，探討HA晶體生長機制。并通過摻雜鍶、鎂、鋅等微量元素替代HA中部分鈣離子，以提高PA涂層的表面生物活性，加速種植體與頜骨間的骨整合。通過體外細胞與動物體內實驗，對表面有納米功能梯度涂層的種植體生物學行為進行系列研究，觀察種植材料對成骨細胞、骨髓基質干細胞增殖分化能力的影響，并用定量組織學、生物力學與Micro-CT等分析手段研究種植體植入正常與骨質疏松動物模型后的骨整合能力與機械穩(wěn)定性。運用量化計算和分子設計的方法，通過模擬牙釉質、牙本質生物礦化機制，研究納米羥磷灰石晶體成核、生長及自組裝的規(guī)律。探討釉原蛋白、釉蛋白、釉叢蛋白等對牙釉質礦化的影響；探討牙本質涎蛋白、牙本質

12、磷蛋白等非膠原蛋白對牙本質礦化的影響；考察多肽及非多肽分子對納米羥磷灰石晶體生長及自組裝的控制；闡明牙釉質和牙本質的生物礦化機制；重點分析類牙釉質、類牙本質再生層與牙體組織的界面結合機制及相關物理、化學、力學及生物性能；合理設計和制造更加適合口腔環(huán)境臨床操作的牙釉質、牙本質原位再生修復的納米材料配方，提出并驗證牙釉質、牙本質原位再生修復的臨床可行應用方案，優(yōu)化并建立基于納米材料的牙釉質、牙本質再生修復的新工藝及新理論。以脂肪族聚酯和聚酰胺為主要合成高分子，以膠原和明膠為主要天然高分子，以納米HA等為主要無機成分，以靜電紡絲為主要納米纖維成型技術，結合表面改性、多相成分復合、多級結構建構、生長因

13、子控釋技術的研究和復合，獲得在多個納米結構特征（如本體和表面化學組成、形貌、拓撲學結構）存在顯著差異的系列仿生納米結構人工細胞外基質。應用基因工程（基因芯片和iRNA）技術，結合分子生物學手段，基于對整合素受體基因表達以及Wnt/-catenin、MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）和TGF-/BMPs等成骨分化信號通路的研究結果，闡明微環(huán)境特征調控成骨相關細胞生物學行為的分子機制，對比研究體內外誘導和促進骨組織再生及整體血管化情況，評價頜骨修復和功能重建的效果，認識細胞/修復材料復合物植入體介導的骨組織再生機制。（二）技術路線與可行性1. 牙科種植體表面納米化促進骨整合的機理研究 技術路線：(1)

14、 研究表面納米功能梯度的新型鈦合金牙種植體材料制備技術：1) 新型鈦合金種植體基材制備：選用高強度低模量多功能鈦合金，通過合金熔煉、高溫鍛造、中溫精鍛和中溫軋制工藝制備牙種植體所需的棒材，研究中溫變形的組織演化過程及其對生物力學性能的影響，優(yōu)化材料的性能，為后續(xù)表面納米化處理提供高韌性棒材。2) 新型鈦合金納米結構表面構建：綜合運用塑性變形法、化學處理、水熱處理、微弧氧化等方法構建新型鈦合金納米結構表面，表征不同工藝條件下獲得的納米材料的顯微組織結構特征包括表面成分及形貌、物相結構、元素化學態(tài)等以及物理化學性能。揭示表面納米化處理工藝對鈦合金表面組織結構、物理化學性能、磷灰石誘導性能等的影響規(guī)

15、律，闡明在不同處理方式下，鈦合金表面納米化的過程及其機制，優(yōu)選合適的表面納米化處理工藝。(2) 研究表面納米功能梯度的新型鈦合金牙種植體-骨組織界面結合機制:1) 表面納米功能梯度的新型鈦合金牙種植體材料對破骨細胞（osteoclast cell, OC）、成骨細胞（osteoblast cell, OB）生物學行為，以及對破骨細胞-成骨細胞間信號轉導影響的研究：應用實時定量RT-PCR、基因芯片等分子生物學技術對與OC、OB細胞分化密切相關的基因、骨形成、骨吸收功能相關基因、及OC-OB信號轉導因子的表達進行檢測，評價不同表面納米功能梯度的牙種植體材料在OC、OB分化、成熟各階段的影響。從整

16、合素信號傳導通路水平闡明不同表面納米功能梯度牙種植體材料對OC、OB細胞生物行為的影響，探索不同表面納米功能梯度牙種植體材料對OC-OB間信號轉導的影響。2) 表面納米功能梯度的新型鈦合金牙種植體材料對骨髓間充質干細胞（BMSCs）生物學行為影響的研究：BMSCs的分離培養(yǎng)、鑒定，在表面納米功能梯度的新型鈦合金牙種植體材料表面生長形態(tài)的觀察，以及在細胞黏附行為及細胞增殖情況的檢測，然后以成骨分化信號通路、破骨細胞前體轉化信號傳導通路，以及成纖維細胞信號通路為研究對象，利用基因芯片、siRNA等基因工程技術檢測骨整合過程中全基因組差異表達，結合形態(tài)學觀察，成骨、破骨、成纖維相關指標檢測，定量研究

17、不同功能梯度的新型鈦合金材料對BMSCs的粘附、增殖和成骨、破骨、以及成纖維向分化的影響。(3) 研究功能梯度的新型鈦合金材料的體內生物學行為：構建比格犬頜骨缺牙模型，將優(yōu)選的不同多孔梯度結構種植體植入犬缺失牙部位，通過骨組織形態(tài)學計量學分析、植體-骨整合情況觀察、生物力學測試、骨動力學參數(shù)分析、骨整合相關細胞信號通路基因表達分析，在不同時間點觀察牙種植體骨結合情況，從不同角度觀察分析評價不同的種植體表面功能梯度結構的再生設計對骨整合的影響，進一步闡明功能梯度的新型鈦合金材料調控骨整合相關細胞生物學行為的分子機制。可行性分析：根據(jù)文獻報道，通過應用納米技術實現(xiàn)種植體表面改性對促進骨整合及維持種

18、植體骨組織界面長期穩(wěn)定具有肯定作用。本項目是在參考大量相關文獻，對國內外研究狀況進行全面分析以及在本課題組前期工作的基礎上提出的，具有相應理論基礎并可行。在新型鈦合金種植體基材制備方面，Ti2448合金是中科院金屬所研制的一種高強度多功能鈦合金，具有特殊的非線性彈性變形行為和高度局域化的塑性變形行為，在高強度條件下實現(xiàn)了金屬材料的超低彈性模量、超彈性、高阻尼和低泊松比等功能性性能的統(tǒng)一，可為開展新型鈦合金種植體提供良好的基礎材料。在金屬材料表面通過塑性變形法、水熱法、微弧氧化、化學處理-微弧氧化復合技術等序列處理方法，構建納米化表面等方面具有非常好的基礎，目前已經獲得階段性成果。這些結果支持當

19、前的研究思路與技術路線。在材料生物學性能研究方面，本課題組所在科室十年來在口腔種植學專業(yè)領域所作的研究及工作已得到國內外同行的認可，曾獲得多項國家科研項目支持進行了相關研究，取得了具有重要意義的成果，具有完成本課題的工作基礎，在實驗基礎上可行。在人才隊伍方面，承擔本項目研究工作的中堅力量和學術骨干都是我國口腔醫(yī)學及生物材料學領域的學術帶頭人和我們團隊的技術骨干，多年來從事口腔種植學工作，十年來已完成了8千余例各種條件下的牙種植修復，十年存活率達96.7%，達到國際口腔種植存活率標準，具有完成該項研究的技術能力、設備條件、病人來源及實驗技術。2. 牙科種植體表面低模量納米材料涂層基礎研究技術路線

20、:制備純鈦種植體表面TiO2/TiO2-PA/PA功能梯度涂層，考察噴塑工藝條件、原料組分比例、涂層厚度等對涂層形貌、彈性模量及附著強度的影響。并通過化學沉積法在表面定向生長HA晶體，提高PA涂層表面生物活性，考察沉積液濃度、沉積時間、沉積溫度、溶液pH值等因素對HA晶體形貌、生成量、晶體生長方向、結晶度以及在PA涂層中沉積深度的影響，探討HA晶體生長機制。并通過摻雜鍶、鎂、鋅等微量元素替代HA中部分鈣離子，以提高PA涂層的表面生物活性，加速種植體與頜骨間的骨整合。通過體外細胞與動物體內實驗，對表面有納米功能梯度涂層的種植體生物學行為進行系列研究，觀察種植材料對成骨細胞、骨髓基質干細胞增殖分化

21、能力的影響，并用定量組織學、生物力學與Micro-CT等分析手段研究種植體植入正常與骨質疏松動物模型后的骨整合能力與機械穩(wěn)定性。(1) 鈦基體表面粗糙化處理：擬采用酸蝕加堿熱處理的方式對鈦基體表面進行粗糙化處理：采用一定濃度的HCl和H2SO4混合液先對鈦基體進行浸泡酸蝕，然后將樣品臵于濃NaOH溶液堿化處理一定時間后，于600處理一段時間，隨爐冷卻。SEM觀察樣品表面形貌，用SEM附帶的EDX能譜儀分析表面元素成分，用XRD分析表面物相成分，用表面輪廓儀表征試樣表面粗糙度。(2) 鈦基體表面TiO2/TiO2-PA/PA梯度涂層的制備及表征：采用納米TiO2/PA共混粉料及純PA粉料為噴塑原

22、料，采用火焰噴塑技術將其依次噴涂于經表面粗化處理的純鈦基體表面。調整粉料中TiO2/PA比例，越接近基體表面TiO2含量越高，隨著涂層厚度逐漸增加，TiO2含量相應減少，直至最表層為純PA粉料，最終在鈦基體表面形成TiO2/TiO2-PA/PA功能梯度涂層。觀察涂層表面及斷面形貌，測試涂層力學強度及界面結合強度，分析Ti元素在斷面上的分布情況。(3) PA梯度涂層表面生物活化處理：將涂覆PA涂層的試樣浸入含Ca2+的溶劑中，在其表面溶蝕出一含Ca2+多孔層，然后將其浸泡于含PO43-溶液中，調整pH值及溫度，通過化學沉積法在表面定向生長HA晶體。觀察溶劑溶蝕后涂層表面及斷面形貌，分析試樣溶蝕不

23、同時間后Ca2+在涂層中的分布情況；觀察溶蝕處理后的涂層在不同pH值及溫度的PO43-溶液中浸泡不同時間后沉積層生長情況及沉積層形貌，分析沉積層中元素分布，確定沉積層物相及結晶情況，觀察晶體形貌尺寸，并確定晶體類型及晶體生長方向，探討晶體生長機制。(4) 表面HA晶體層的摻雜改性：為進一步提高PA高分子涂層表面的生物活性，促進其與周圍頜骨間的骨整合，在用化學沉積法定向生長HA晶體的過程中，添加適量鍶、鎂、鋅等元素以替代HA晶格中部分鈣離子，制備微量元素摻雜改性HA晶體層，通過體外生物學評價及動物體內植入實驗研究摻雜改性后的HA晶體層相對于未摻雜HA其生物活性的改善情況及促進骨整合的特性。(5)

24、 體外生物學評價及動物體內實驗：通過體外細胞與動物體內實驗，對表面有納米功能梯度涂層的種植體生物學行為進行系列研究，觀察種植材料對成骨細胞、骨髓基質干細胞增殖分化能力的影響，并用定量組織學、生物力學與Micro-CT等分析手段研究種植體植入正常與骨質疏松動物模型后的骨整合能力與機械穩(wěn)定性。 可行性分析：(1) 對于“如何在鈦種植體表面形成一層界面結合牢固的類牙周膜結構PA高分子涂層”這一關鍵問題，擬通過鈦基體表面蝕刻粗化處理，在表面形成TiO2層，以增加PA涂層與基底間的化學鍵合點與機械嵌合點，提高涂層附著力。在我們前期的研究中，曾對鈦金屬表面做過防腐處理，對鈦金屬的特性有較深入的了解。目前對

25、鈦金屬表面蝕刻粗化處理的方法較多，而且較易操作實行。在本項目中我們將以在鈦基體表面生成銳鈦礦TiO2層為目標，對不同的蝕刻方法進行對比研究，從而優(yōu)化出最佳蝕刻粗化方案。因此，解決此關鍵問題在技術上是可行的。(2) 對于“如何消除或降低PA涂層與鈦基體間的熱膨脹系數(shù)差異，以盡可能消除涂層內部殘余熱應力，提高涂層結合強度”這一關鍵問題， 擬通過設計功能梯度涂層來調整層間熱膨脹系數(shù)。對火焰噴塑技術而言，通過調整電壓，提高原料噴射速度，使塑化狀態(tài)的原料能夠滲入基體一定深度，提高涂層結合力是完全可行的。另外，改變噴塑原料的組分比例并不會對噴塑技術提出更高更苛刻的要求，因此在經過蝕刻的鈦基體上噴涂功能梯度

26、涂層在技術上不是難題。(3) 對于“如何提高PA涂層表面生物活性，加速種植體與頜骨間骨整合，促進種植體早期固定”這一問題，首先，PA吸濕后有約3vol%的膨脹率，植入頜骨并吸水膨脹后可縮小甚至消除界面縫隙，對種植體的即刻穩(wěn)定非常有利；同時，根據(jù)PA特殊的鏈結構，對其表面處理在其上生長一層羥基磷灰石，提高表面生物活性，促使其與周圍頜骨組織快速形成骨整合，利于種植體早期穩(wěn)固固定。前期，我們已通過溶液沉積法在PA上生長出磷灰石晶體。因此，在技術上解決此問題也是可行的。3牙齒硬組織納米材料自組裝再生修復的機理研究:技術路線:(1) 牙釉質、牙本質蛋白質介導生物礦化機制的研究：1) 納米羥磷灰石晶體的生

27、長與自組裝：納米羥磷灰石晶體主要通過化學沉淀法制備， 首先分別配臵含有鈣離子、磷酸根、氟離子溶液， 在含有與牙釉質、牙本質礦化相關的蛋白質如釉原蛋白、釉蛋白、釉叢蛋白、I型膠原及牙本質涎蛋白、牙本質磷蛋白等非膠原蛋白存在下，通過控制各反應物的濃度、反應時間、添加順序以及反應介質等條件控制晶體的生長和自組裝的性質；分別用透射電鏡、掃描電鏡、掃描探針顯微鏡、紅外、X射線粉末衍射以及激光粒度分析儀等對合成的各種形狀納米羥磷灰石晶體進行表征和分析，揭示納米羥磷灰石晶體成核、生長及自組裝的規(guī)律。2) 分子設計：運用量子化學和分子動力學方法計算模擬設計基于釉原蛋白、釉蛋白、釉叢蛋白、牙本質涎蛋白、牙本質磷

28、蛋白等與牙釉質、牙本質礦化相關的蛋白質的多肽片段或非多肽分子，并用多肽合成儀等合成這些模型分子，考察這些分子對納米羥磷灰石晶體的生長與自組裝性質的影響， 理論和實驗相結合探尋設計安全、高效、經濟、適合口腔生理條件下的控制納米羥磷灰石晶體的快速生長并能自組裝形成牙釉質、牙本質類似結構的分子。3) 牙釉質、牙本質的生物礦化機制:綜合上述的研究結果總結提出牙釉質、牙本質蛋白質介導生物礦化的新模型。(2) 牙釉質、牙本質原位再生修復的研究：1) 牙釉質、牙本質在模擬生理條件下原位再生修復: 采用離體牙為主要實驗材料，在模擬口腔生理條件下，綜合上述牙釉質、牙本質生物礦化的研究結果重點考察新設計的多肽及非

29、多肽分子對牙釉質、牙本質再生修復的作用機制；2) 牙釉質、牙本質再生修復層性能評價：分別用透射電鏡、掃描電鏡、掃描探針顯微鏡、紅外、X射線粉末衍射等對牙釉質、牙本質再生修復層進行表征和分析，評價牙釉質、牙本質再生修復層的物理化學性能。運用納米力學測試系統(tǒng)TriboIndenter對樣品表面微區(qū)進行壓痕（施加正向垂直載荷力）、劃痕（施加側向載荷力）評價牙釉質、牙本質再生修復層的硬度、抗磨損性等力學性能； 運用超聲、萬能力學試驗機評價牙釉質、牙本質再生修復層與牙釉質、牙本質的結合強度。運用細胞實驗評價牙釉質、牙本質再生修復層的生物安全性。3) 建立并優(yōu)化牙釉質、牙本質再生修復的新工藝及新理論：綜合

30、上述的研究結果總結提出牙釉質、牙本質再生修復的新工藝及新理論。(3) 牙釉質、牙本質原位再生修復的臨床操作方案：1) 牙釉質、牙本質原位再生修復的臨床應用方式：設計臨床可用的器械和裝臵重點考察上述配方不同臨床應用方式如溶液、糊劑、貼膜等與牙釉質、牙本質的作用機制，使用SEM、TEM、XRD、AFM從分子與納米尺度對再生修復層進行研究，探索有利于臨床應用的工藝路線。2) 動物實驗：動物實驗將主要選擇大動物如豬，觀察并評價體內環(huán)境下上述配方及臨床應用方式對牙釉質、牙本質原位再生修復的效果。3) 建立并優(yōu)化牙釉質、牙本質原位再生修復的臨床可行應用方案: 綜合上述研究結果提出牙釉質、牙本質原位再生修復

31、的臨床可行的應用方案。 可行性分析：根據(jù)文獻報道，通過模仿牙釉質礦化的機制，運用牙釉質礦化相關的蛋白質及類似物可以在生理條件下控制納米羥磷灰石晶體的生長與自組裝，實現(xiàn)類牙釉質結構的合成和制備。本項目將從仿牙釉質生物礦化機制出發(fā)實現(xiàn)牙釉質的原位再生修復。本課題組已在牙釉質微結構仿生合成上進行過多年的研究，發(fā)表了系列高水平的論文，引起了國內外同行的關注。前期工作受到了國家科技部973計劃和國家自然科學基金的聯(lián)合資助，證明在生理條件下可以運用小分子實現(xiàn)牙釉質的化學再生。本課題組也是國際上較早開展利用蛋白質或者小分子介導人工模擬生物礦化過程實現(xiàn)牙本質再礦化修復方面的研究，前期的工作已經證明仿牙本質磷蛋

32、白序列的含14個氨基酸殘基的多肽片段可以有效誘導羥基磷灰石晶體的形成。我們與美國Gower 和Boyan小組合作發(fā)現(xiàn)可以采用高分子誘導羥基磷灰石在膠原蛋白上形成珍珠狀有序排列的仿骨結構。鑒于牙本質與骨組織的類似性，這也間接地證明了牙本質可控再礦化的可行性。 雖然牙本質和牙釉質的結構和形成機制有很大差異，但兩者都是在蛋白質介導下的生物礦化，將兩者放在一起研究探討，可以互相借鑒，起到事半功倍的效果。本項目是在參考大量相關文獻，對國內外研究狀況進行全面分析以及在本課題組前期工作的基礎上提出的；另外，課題組主要成員為青年教師和研究生，既有材料、化學、醫(yī)學也有生物學研究的背景，學術思想活躍，科研投入時間

33、充足，并且具有良好的團隊合作精神。依托單位在生物材料合成和制備、細胞生物學、分子生物學及口腔醫(yī)學等方面的儀器設施先進齊全，可為課題的實施提供保障，因此，實現(xiàn)本項目的預期研究目標有保證。4.頜骨缺損修復材料納米化構建與再生重建機制研究 技術路線：(1) 仿生納米結構人工細胞外基質的制備1) 納米纖維支架的設計與制備：以水或具有不同揮發(fā)性和電導率的有機液體為溶劑，將天然、合成高分子和/或表面接枝改性后的無機納米粒按不同比例混合，靜電紡絲制備單組分或多組分復合納米纖維。利用溶劑揮發(fā)性和電導率的差異獲得具有不同表面拓撲結構的納米纖維；改變溶液濃度、流速、接收距離、電壓等參數(shù)調控纖維直徑；改變接收裝臵，

34、制備具有不同三維拓撲結構的納米纖維支架，并通過牽伸調控纖維排列間距和支架孔隙大小；多組分復合纖維的微相分離結構、表面特性、力學性能和親/疏水性能等由上述工藝參數(shù)綜合調控；2) 納米纖維的表面修飾：采用物理吸附、化學交聯(lián)法或低溫等離子體表面處理，將適量生物活性物質固定于納米纖維表面；結合表面處理，采用SBF進行納米纖維的表面礦化改性；研究纖維組成對表面改性效果的影響，及表面改性所引起的纖維形貌、表面組成、表面親疏水性和表面礦化層的變化等；3) 梯度功能化骨修復材料的設計與制備：采用不同特性納米纖維膜鋪層、模擬體液梯度生物礦化、納米纖維網絡與傳統(tǒng)支架成型方法結合等多種手段，進行梯度功能化骨修復材料

35、的設計與制備；4) 生長因子控制釋放體系制備：采用乳液法或靜電噴射法，制備載目標生長因子（如骨形態(tài)發(fā)生蛋白）微納米球，考察其理化性能和生長因子包封情況，研究生長因子微納米球及其負載于支架材料上后的體外模擬緩釋行為；(2) 成骨相關細胞在不同仿生納米結構人工細胞外基質微環(huán)境下的體外生物學研究1) BMSCs細胞黏附、增殖、分化程度的檢測：細胞-材料復合物在有、無成骨誘導劑條件下培養(yǎng)一定時間后，采用黏著斑蛋白抗體結合方法、共聚焦顯微鏡觀察黏著斑形成；采用抗體免疫熒光檢測、顯微鏡觀察細胞骨架蛋白的表達變化；檢測細胞與基底的切向粘附力；分析細胞增殖規(guī)律。檢測成骨特異性指標以及礦化結節(jié)形成能力；利用熒光

36、定量PCR技術定量分析堿性磷酸酶及成骨分化不同階段轉錄因子的表達變化規(guī)律；2) 成骨分化全基因組表達變化分析：提取不同培養(yǎng)階段細胞的總RNA，反轉錄合成cDNA，利用大鼠全基因組表達芯片檢測細胞在納米纖維支架上黏附及分化階段的各個結構基因的轉錄水平變化，并結合RT-qPCR對結果進行驗證；3) BMSC成骨分化信號通路研究：自行設計特異性的成骨分化信號通路（TGF-/BMPs、Wnt 和MAPK 等）傳導因子（BMPs、-catenin、ERK等）的RNA干擾序列，分別轉染細胞后與納米纖維支架復合培養(yǎng)，探索BMSCs成骨分化信號通路的調控機理。(3) 成骨相關細胞/修復材料復合物植入頜骨內的生

37、物學特性研究1) 頜骨缺損模型的建立：以比格犬或新西蘭大白兔為實驗動物，無菌條件下建立直徑約10mm下頜骨缺損模型；2) 形態(tài)學觀察：將細胞/材料復合物植入上述頜骨缺損模型中，肉眼觀察比較各組植入物之間隨時間的形狀變化、感染、血管化、新生骨量及新生骨與正常骨的連接情況；3) X光和CT檢查：利用X-ray和micro-CT技術檢測各實驗組在不同階段的骨再生情況，比較各組之間的成骨量及骨修復效率；4) 組織學觀察：HE染色觀察各實驗組在不同階段的材料降解吸收和炎性細胞浸潤情況，及新生骨結構及與其周圍正常組織之間的關系。 可行性分析：已有研究表明，納米纖維支架表現(xiàn)出良好的促進成骨相關細胞粘附、增殖

38、和分化的特性，在特定條件下可促進間充質干細胞向特定的終末細胞分化。間充質干細胞可感應人工細胞外基質的多種物理特性，引起一系列結構基因和轉錄因子的差異表達，導致終末分化的不同。本課題應用成熟的靜電紡絲技術，結合表面改性、多相成分復合、多級結構建構、生長因子控釋等技術，獲得在多個納米結構特征（如本體和表面化學組成、形貌、拓撲學結構）存在顯著差異的系列仿生納米纖維人工細胞外基質，用于細胞分化調控研究，理論上可行。課題組在靜電紡絲技術制備納米纖維方面已做了大量工作，已研制出本課題研究所需的各種組成及拓撲學結構的納米纖維。在表面改性、多相成分復合、多級結構建構、生長因子控釋等技術方面也有很好的研究基礎。

39、這些前期研究為本課題獲得在多個納米結構特征（如本體和表面化學組成、形貌、拓撲學結構）存在顯著差異的系列仿生納米纖維骨修復支架提供了保障。不同組成、結構及表面性質的人工細胞外基質直接影響細胞的黏著程度及黏著斑的形成，在分子水平則主要表現(xiàn)為整合素受體基因的表達種類及程度各異；而多潛能BMSCs向成骨細胞分化的過程已被證實與Wnt/-catenin、MAPK和TGF-/BMPs等多個信號通路相關。因此，以整合素受體基因表達作為黏著斑形成指標，以Wnt/-catenin、MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）和TGF-/BMPs等成骨分化信號通路為研究對象，利用基因芯片、siRNA等基因工程技術檢測成骨分化過

40、程中全基因組差異表達，結合形態(tài)學（黏著斑）觀察和成骨相關指標（ALP、BMP-2 、CTSK和Runx-2）檢測，定量研究不同納米結構特征微環(huán)境對成骨相關細胞生物學行為的影響，闡明仿生納米結構人工細胞外基質微環(huán)境特征調控成骨相關細胞生物學行為的分子機制，理論上可行。本課題組已經熟練掌握基因芯片、siRNA等技術，為上述工作開展奠定了基礎。（三）創(chuàng)新點(1) 構建功能梯度的新型鈦合金種植體，系統(tǒng)研究材料表面納米化技術序列處理所形成的納米梯度結構，及該梯度結構與組織有效結合技術，從納米尺度/蛋白質組/基因水平，探索種植體表面拓撲結構對細胞生長和相關信號通路的控制機制，獲得具有多孔梯度結構新型鈦合金

41、牙種植體材料成分設計和納米結構控制方法,是研究思路與研究方法的創(chuàng)新。(2) 構建鈦種植體表面獲得與牙周骨組織匹配的低彈性模量功能梯度高分子復合涂層，探討其應力緩沖和傳導特性，揭示其在結構和功能方面與天然牙周膜間的關聯(lián)及相似性，探索其模仿天然牙周膜行使功能的基礎及其與周圍組織間生物力學相容的機制，并利用蛋白質組學技術，從蛋白質分子水平，研究材料及表面仿生設計，是研究思路上的創(chuàng)新。(3) 運用量化計算和分子設計的方法，通過模擬生物礦化，探尋新的多肽及非多肽小分子，控制納米羥磷灰石晶體的生長與自組裝，實現(xiàn)生理條件牙釉質、牙本質原位再礦化，這是一條新的研究和臨床修復思路。牙釉質、牙本質原位再礦化臨床方

42、案的實現(xiàn)將對口腔保健及再生醫(yī)學治療齲病具有重要的科學和實踐意義。(4) 以Wnt/-catenin、MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）和TGF-/BMPs等成骨分化信號通路為研究對象，定量研究不同納米結構特征微環(huán)境對成骨相關細胞的黏附、自我更新和成骨向分化的影響，闡明仿生納米結構人工細胞外基質微環(huán)境特征調控成骨相關細胞生物學行為的分子機制，是研究思路上的創(chuàng)新。(5) 將基因芯片、iRNA技術等新近興起的前沿生物學技術應用于上述研究，檢測成骨分化過程中全基因組差異表達，結合形態(tài)學（黏著斑）觀察和成骨相關指標（ALP、BMP-2 、CTSK和Runx-2）檢測，準確地檢測和分析仿生納米結構人工細胞外基

43、質微環(huán)境特征對BMSCs成骨分化的調控機制，是研究方法上的創(chuàng)新。(四)課題設臵及相互關系根據(jù)項目及各課題實施的需要，本項目擬申請國家納米研究重大科學研究計劃專項研究經費3000萬元人民幣，課題設臵和經費比例如下。1、課題設臵課題一、牙科種植體表面納米化促進骨整合的機理研究 課題負責人：林野主要技術骨干：周玉、魏大慶、李述軍、衛(wèi)彥承擔單位：北京大學，哈爾濱工業(yè)大學，中國科學院金屬研究所 經費比例：28.33% 主要研究內容：(1) 研究新型鈦合金牙種植體表面納米梯度功能化制備技術：選用高強度低模量多功能鈦合金，通過合金熔煉、高溫鍛造、中溫精鍛和中溫軋制工藝制備牙種植體所需的高韌性棒材。通過表面機

44、械研磨處理技術、化學處理、水熱處理、微弧氧化及后續(xù)納米結構調控等序列處理方法，形成納米多孔梯度分布的材料表面，考察表面納米化序列處理技術對表面功能梯度結構、表面形貌、晶體結構、化學組成、表面潤濕性、蛋白吸附、離子釋放等性能的影響，獲得具有多孔梯度結構新型鈦合金牙種植體材料成分設計和納米結構控制方法。 (2) 研究表面納米功能梯度新型鈦合金牙種植體-骨組織界面的結合機制:利用蛋白質組學技術、基因芯片、siRNA等工程技術，在納米尺度/蛋白質分子/基因水平，定量研究不同表面納米功能梯度的新型鈦合金牙種植體材料對骨整合相關ECM（細胞外基質）-整合素-CSK（細胞骨架）蛋白質組變化，成骨/破骨細胞信

45、號轉導、成骨分化、破骨細胞前體轉化以及成纖維細胞信號通路系列基因表達的影響，探索材料表面納米功能梯度結構設計對骨整合界面結合特性、細胞選擇過程及相關信號因子的影響規(guī)律，探討無機相拓撲形貌對成骨的控制作用，設計一種新型鈦合金種植體材料。(3) 研究表面納米功能梯度新型鈦合金牙種植體的體內生物學行為：構建比格犬頜骨缺牙模型，將優(yōu)選的不同多孔梯度結構種植體植入犬缺失牙部位，通過扭力測試、FSEM和EDX觀察分析種植體-骨組織界面情況，通過形態(tài)學觀察、活體熒光標記新骨形成、X光、CT檢查和骨組織形態(tài)計量學的測量，以及植入部位-catenin、MAPK和TGF-/BMPs、RANKL、OPG、PI3K/

46、Akt等蛋白表達分析等手段，從不同角度觀察分析評價不同的種植體表面功能梯度結構的再生設計對骨整合的影響，進一步闡明功能梯度的新型鈦合金材料調控骨整合相關細胞生物學行為的分子機制。預期目標：(1) 選用高強度低模量多功能鈦合金，通過合金熔煉、高溫鍛造、中溫精鍛和中溫軋制工藝制備牙種植體所需高韌性棒材。(2) 獲得具有表面納米功能梯度牙種植體的成分設計和納米結構控制方法，實現(xiàn)種植體-骨組織界面有效結合。(3) 探索出種植體表面納米拓撲結構對骨整合相關細胞生長和相關信號通路的控制機制。(4) 發(fā)表SCI收錄學術論文10篇以上，申請專利2-3項，培養(yǎng)學科交叉型博士、碩士、博士后人才10-15名。課題二

47、、牙科種植體表面低模量納米材料涂層基礎研究課題負責人：胡靜主要技術骨干：張利、關少軒、李繼華、鄒琴承擔單位：四川大學，中國科學院金屬研究所經費比例：26.67%主要研究內容：(1) 鈦基體表面粗糙化處理：研究鈦基體表面的酸堿粗化熱處理技術，在表面形成一層TiO2粗糙層，利用塑料火焰噴塑技術，在處理后的鈦基體表面涂覆一層類牙周膜結構聚酰胺（PA）高分子涂層，考察其結合強度及力學性能。(2) 鈦基體表面TiO2/TiO2-PA/PA梯度涂層的制備及表征：研究PA涂層與鈦基體間的熱膨脹系數(shù)差異，通過引入組分梯度過渡的功能梯度TiO2/TiO2-PA/PA涂層，以盡可能消除涂層內部殘余熱應力，提高涂層

48、結合強度。(3) PA梯度涂層表面生物活化處理：通過用含鈣離子溶液對PA涂層表面進行溶蝕處理，在其上形成一定厚度的含鈣離子多孔層，并將其浸入含磷酸根溶液中，通過調節(jié)pH值、沉積時間及沉積溫度等條件，采用化學共沉淀法在PA涂層表面原位定向沉積生長羥基磷灰石晶體，以提高PA表面生物活性。（4）表面HA晶體層的摻雜改性：為進一步提高PA高分子涂層表面的生物活性，促進其與周圍頜骨間的骨整合，在用化學沉積法定向生長HA晶體的過程中，添加適量鍶、鎂、鋅等元素以替代HA晶格中部分鈣離子，制備微量元素摻雜改性HA晶體層，通過體外生物學評價及動物體內植入實驗研究摻雜改性后的HA晶體層促進骨整合的特性。（5）體外

49、生物學評價及動物體內實驗：通過體外細胞與動物體內實驗，對表面有納米功能梯度涂層的種植體生物學行為進行系列研究，觀察種植材料對成骨細胞、骨髓基質干細胞增殖分化能力的影響，并用定量組織學、生物力學與Micro-CT等分析手段研究種植體植入正常與骨質疏松動物模型后的骨整合能力與機械穩(wěn)定性。預期目標：(1) 探索出鈦基體表面最佳粗化處理工藝及表面銳鈦礦型TiO2層的形成機制，確立噴塑原料組分的梯度變化與涂層結合強度及彈性模量間的對應關系，明確梯度涂層中納米TiO2粒子含量的梯度變化對涂層結合強度的影響。(2) 揭示PA高分子涂層表面羥基磷灰石晶體可控定向生長的機制，明確其與牙槽骨間發(fā)生骨整合的內在機理

50、。(3) 闡明具有功能梯度PA高分子涂層的鈦種植體傳導和緩沖應力的效果及特性，揭示所制備低模量功能梯度PA高分子涂層在結構和功能方面與天然牙周膜間的關聯(lián)及相似性。(4) 探明具有類牙周膜結構鈦種植體植入不同時間后的力學傳導特性，揭示低模量納米復合高分子涂層對解決鈦種植體生物力學相容性問題的可行性及有效性。(5) 申請發(fā)明專利3-5項（力爭國際專利1項），在SCI刊物發(fā)表論文15篇以上，培養(yǎng)博、碩士研究生5-8名，承辦或主持召開國際學術會議1-2次；通過與國外研究機構開展合作與人員交流，培養(yǎng)青年學科骨干人才3人以上，吸引留學回國博士、博士后2人以上，研究成果具有國際領先水平。課題三、牙齒硬組織納

51、米材料自組裝再生修復的機理研究課題負責人：陳海峰主要技術骨干：胡秀蓮、華紅、韓冰、李剛承擔單位：北京大學，北京化工大學經費比例：28.33%主要研究內容：(1) 牙釉質、牙本質蛋白質介導生物礦化機制的研究：研究納米羥磷灰石晶體成核、生長及自組裝的規(guī)律，探討釉原蛋白、釉蛋白、釉叢蛋白等對牙釉質礦化的影響；探討牙本質涎蛋白、牙本質磷蛋白等非膠原蛋白對牙本質礦化的影響；運用量化計算和分子設計的方法，通過模擬牙釉質、牙本質生物礦化機制，從理論和實驗上探尋新的多肽及非多肽小分子，控制納米羥磷灰石晶體成核、生長與自組裝過程，探索納米材料在生理條件下誘導并促進牙釉質、牙本質原位再生的作用機制；闡明牙釉質和牙

52、本質蛋白質介導的生物礦化機制；(2) 牙釉質、牙本質原位再生修復的研究：研究牙釉質、牙本質在模擬生理條件下再礦化修復的方法。考察多肽及非多肽分子對牙釉質、牙本質再礦化的作用機制；分析牙釉質、牙本質再生礦化層的物理、化學、力學及生物性能；闡明牙釉質、牙本質再礦化修復的機理；優(yōu)化并建立牙釉質、牙本質再礦化修復的新工藝及新理論；重點分析類牙釉質、類牙本質再生層與牙體組織的界面結合機制及相關物理、化學、力學及生物性能；運用仿生技術和分子設計方法，將海洋生物多態(tài)性粘接蛋白二羥苯丙氨酸（DOPA）基團以及與正常硬組織礦化相關蛋白的有效片段引入仿生粘接劑的制備，從而實現(xiàn)與人體硬組織中的膠原蛋白和無機鹽形成多

53、位點化學結合而達到穩(wěn)固粘接。通過分子結構設計和優(yōu)化，解決類牙釉質、類牙本質再生層與牙體組織界面結合的力學匹配性，賦予再生修復層長期力學穩(wěn)定性，延長再生修復層的壽命。(3) 牙釉質、牙本質原位再生修復的臨床操作方案的研究：建立并優(yōu)化基于納米材料的牙釉質、牙本質再生修復的新工藝及新理論。研究牙釉質、牙本質原位再礦化修復的多種臨床應用方式。探討適合口腔環(huán)境臨床操作的牙釉質、牙本質再礦化修復的配方和臨床應用方式之間的相關性；建立并優(yōu)化牙釉質、牙本質再礦化修復的臨床可行應用方案。預期目標：(1) 本課題的總體目標在于實現(xiàn)基于納米材料自組裝技術的牙釉質、牙本質原位再生；從納米尺度/蛋白質組水平探索納米材料

54、在牙齒硬組織生物礦化過程中分子作用機制，合理設計和制造更加適合口腔環(huán)境臨床操作的牙釉質、牙本質原位再生修復的納米材料配方，建立基于納米材料的牙釉質、牙本質再生修復的新工藝及新理論 ；(2) 闡明類牙釉質結構、類牙本質結構的生長和組裝機制，揭示基于生物礦化原理納米羥磷灰石晶體可控有序生長、自組裝的規(guī)律；(3) 合理設計和制造更加適合口腔環(huán)境下臨床操作的牙釉質、牙本質原位再生修復的納米材料配方和臨床應用方式，提出并驗證牙釉質、牙本質原位再生修復的臨床可行應用方案。(4) 發(fā)表SCI收錄學術論文15篇以上，申請專利4-6項，培養(yǎng)學科交叉型碩士、博士、博士后人才10-15名。課題四、頜骨缺損修復材料納米化構建與再生重建機制研究課題負責人：王征主要技