1、上海交通大學碩士學位論文 納米金合成、表面修飾及生物應用Synthesis of gold nanoparticles surface modification and bioapplications 專 業：分析化學 班 級：B0911092 學 號：1091109051 學 生：高杰 導 師：任吉存 教授 上海交通大學化學化工學院 2011 年 12 月 上海交通大學學位評定委員會辦公室上海交通大學碩士學位論文 第一章 緒論 上海交通大學 學位論文原創性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學位論文，是本人在導師的指導下，獨立進行研 究工作所取得的成果。除文中已經注明引用的內容外，本論文不包含任何其

2、他 個人或集體已經發表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人 和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律結果由本 人承擔。 學位論文作者簽名： 日期： 2011 年 12 月 20 日 1上海交通大學碩士學位論文 第一章 緒論 上海交通大學 學位論文版權使用授權書 本學位論文作者完全了解學校有關保留、使用學位論文的規定，同意學校 保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和 借閱。本人授權上海交通大學可以將本學位論文的全部或部分內容編入有關數 據庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存和匯編本學位論文。 保密，在 年解密后適用本授

3、權書。 本學位論文屬于 不保密。 （請在以上方框內打“”）學位論文作者簽名： 指導教師簽名：日期： 2011 年 12 月 20 日 日期：2011 年 12 月 20 日 2上海交通大學碩士學位論文 第一章 緒論 納米金合成、表面修飾及生物應用 摘 要 近來年，金納米粒子因其獨特的物理化學性質而受到越來越廣泛的關注，并逐漸被當作光學探針和生物相容性材料來使用。但它也存在容易發生團聚的缺陷，尤其是在高鹽或者核酸、蛋白質等生物分子存在的條件下。所以，如何提高納米金粒子在水溶液及生物連結過程中的穩定性是它在生物醫學領域應用過程中的關鍵問題。在本研究課題中，我們首先合成了不同長徑比的金納米棒和納米球

4、，并用紫外-可見吸收光譜儀、透射電鏡和熒光相關光譜對其進行了表征。結果表明合成的納米粒子粒徑均勻，分散性好。 然后，我們以 17 納米金球研究模型，系統的研究了某些巰基化合物對納米金的穩定性影響。在研究中，用谷胱甘肽、巰基丙酸、半胱氨酸、胱胺、二氫硫辛酸和巰基聚乙二醇六種含巰基配體對納米金進行了表面修飾。我們以紫外-可見分光光度計，熒光相關光譜，粒度儀和 Zeta 電位儀為表征手段，系統地研究了巰基化合物修飾納米金球在不同 pH 值及鹽濃度溶液中的穩定性。結果發現，用巰基聚乙二醇修飾的納米金的穩定性明顯高于用其它五種配體修飾的金。巰基聚乙二醇修飾的納米金甚至在 1 M NaCl 溶液中具有很好

5、的穩定性。由于巰基聚乙二醇在結構上不存在羧基、氨基等官能團，限制了它在后序生物領域的應用。因此，我們設計了一種用巰基丙酸和巰基聚乙二醇的混合物同時對金納米球進行修飾的方法，該方法不僅大大提高了金納米在溶液中的穩定性，同時使其表面擁有了羧基官能團。我們用雙配體修飾的金納米球以 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和 N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽為連接試劑成功標記表皮生長因子受體高表達的人子宮頸癌細胞（SiHa 細胞）并用暗場成像技術對標記的細胞進行成像。相比目前常用的以金納米作為分子探針標記細胞的其它方法相比，我們的方法操作簡單成本低廉，在未來的生物測定與癌癥診斷研究方向具有廣闊的應用

6、前景。上海交通大學碩士學位論文 第一章 緒論關鍵詞：金納米顆粒，含巰基配體，生物連接，暗場成像上海交通大學碩士學位論文 第一章 緒論 Synthesis of gold nanoparticles surface modification and bioapplications ABSTRACTCurrently gold nanoparticles GNPs are attractive alternative optical probes and goodbiocompatible materials due to their special physical and chemical p

7、roperties. HoweverGNPs have a tendency to aggregate particularly in the presence of high salts and certainbiological molecules such as nucleic acids and proteins. How to improve the stability ofGNPs and their bioconjugates in aqueous solution is a critical issue in the bioapplications. Inthis study

8、we firstly prepared four kind of gold nanorods with different ratios of long andshort radius then characterized them using UV-Vis spectroscopy TEM and FluorescenceCorrelation Spectroscopy FCS. Furthermore we used 17 nm GNPs as a model andmodified them with six thiol compounds including glutathione m

9、ercaptopropionic acidMPA cysteine cystamine dihydrolipoic acid DHLA and thiol-ended polyethylene glycolPEG-SH via Au-S bond. We systematically investigated the effects of thiol ligands pH andsalt concentrations of solutions on colloidal stability to GNPs using UV-Vis absorptionspectroscopy fluoresce

10、nce correlation spectroscopy FCS and Zeta potential instrument. Wefound that GNPs modified with PEG-SH were the most stable in aqueous solution comparedto other thiol compounds. Based on the results above we developed a simple and efficient上海交通大學碩士學位論文 第一章 緒論approach for modification of GNPs using a

11、 mixture of PEG-SH and MPA as ligands. Thesebi-ligands modified GNPs were facilely conjugated to antibody using EDC 1-ethyl-3-3-dimethylaminopropyl carbodiimide and N-hydroxysulfo-succinimide Sulfo-NHS aslinkage reagents. We conjugated GNPs to epidermal growth factor receptor EGFRantibodies and succ

12、essfully used the antibody-GNPs conjugates as targeting probes forimaging of cancer cells using the illumination of dark field. Compared to current methods formodification and conjugation of GNPs our method described here showed simple low-costand have potential applications in bioassays and cancer

13、diagnostics and studies.Keywords: Gold nanoparticles Thiol-ligands Bioconjugation Dark field imaging上海交通大學碩士學位論文 第一章 緒論 目錄第一章 緒論 . 1 1.1 金納米顆粒 . 1 1.2 金納米球的合成 . 1 1.3 金納米棒的合成 . 3 1.4 金納米的表征 . 7 1.5 金納米粒子的修飾 . 10 1.6 金納米粒子的光學特性及應用 . 11 1.6.1 金納米粒子的光學特性 . 11 1.6.2 金納米粒子的應用 . 13 1.7 本論文的選題思路 . 17參考文獻 .

14、 18第二章 金納米的合成及修飾 . 25 2.1 引言 . 25 2.2 實驗部分 . 26 2.2.1 試劑與儀器 . 26 2.2.2 實驗方法 . 27 2.3 結果與討論 . 30 2.3.1 金納米棒的表征 . 30 2.3.2 金納米球的表征 . 32 2.3.3 修飾后的金納米球在不同環境的穩定性考察 . 35 2.4 本章小結 . 41參考文獻 . 42第三章 金納米的生物應用 . 44 3.1 引言 . 44 3.2 實驗部分 . 45 3.2.1 試劑與儀器 . 45 3.2.2 實驗方法 . 46 3.3 結果及討論 . 47 3.3.1 MPA 與 SH-PEG 雙配

15、體修飾后的金連接抗體前后的穩定性比較 . 47 3.3.2 雙配體的比例篩選 . 49 3.3.3 暗場成像 . 50上海交通大學碩士學位論文 第一章 緒論 3.4 本章小結 . 52參考文獻 . 53致謝 . 55攻讀碩士期間學術論文發表情況 . 56 上海交通大學碩士學位論文 第一章 緒論 第一章 緒論1.1 金納米顆粒 近年來，貴金屬納米顆粒以其獨特的性質尺寸依賴的電學性質、光學特性、 磁性和化學性質，吸引了不同領域的關注，科學家們不僅對其光量子限域效應、磁 量子限域效應及其它納米材料特有屬性進行研究，也越來越廣泛地將其應用到感光、 催化、生物標識、光子學、光電子學、信息存儲、表面增強拉

16、曼散射等諸多領域 1-18。 金屬納米顆粒尤其是金納米顆粒的尺寸、形狀和結構控制以及相應的物理性質 一直是材料科學以及相關領域的前沿熱點。近幾年來，對于金納米材料的研究取得 了長足進步，科學家們不但研究出制備不同尺寸的球形粒子、不同長短徑比的棒狀 粒子的方法，還可以用非常簡便的方法對其形貌加以控制，制備出了許多不同形貌 的一維材料，并發現它們具備的一些特殊的實驗現象和物理性質。許多科研小組在 這方面已取得了重大成果，并且成功將其應用到生物、醫學、信息存儲等領域。 19-271.2 金納米球的合成 納米尺寸的金顆粒具有很多獨特的性質無細胞毒性、良好的生物相容性、 易于合成及表面修飾、強烈的光吸收

17、與散射、超高的光熱轉換效率及光化學穩定性 等28-33，從而逐漸成為科學領域的一個熱門話題，在物理、化學、生物、醫學 以及催化等諸多領域得到廣泛地應用。 金屬納米粒子的主要制備方法有物理法和化學法，其中物理法主要有真空蒸鍍 法、軟著陸法、電分散法和激光消融法等，化學法主要有氧化還原法、34-36電 化學法、37晶種法、38-40微乳液法、41-42相轉移法、43-47模板法48 1 上海交通大學碩士學位論文 第一章 緒論 和光化學法。49-51接下來主要介紹文獻報道的合成金納米粒子常用的方法。 氧化還原法： 該法通常是在含有高價金離子的溶液中加入還原劑，金離子被還原而聚集成納 米粒子。所用的還

18、原劑包括經典的檸檬酸三鈉、硼氫化鈉、磷、十六烷基苯胺、聚 乙二醇、聚苯胺等。其中以檸檬酸鈉還原法最為經典，就是以檸檬酸三鈉為還原劑， 在熱的水溶液中將AuCl4-還原，其制備方法簡單，所得到的顆粒性質穩定34。 Yonezawa35-36等隨后又相繼以巰基丙酸鈉及氟化烷醇類化合物為穩定劑，將它 們各自與硼氫化鈉同時加入氯金酸溶液中，制得了巰基丙酸鹽和碳氟化合物穩定的 金納米顆粒。他們還合成了具有 4 條鏈的充當穩定劑的二硫化物配體， 采用這種 配體能更好地控制所制備的納米微粒的粒徑，進一步擴展了硼氫化鈉還原法的應用 范圍。 微乳液法： 該法是將表面活性劑溶解在有機溶劑中，當表面活性劑的濃度超過

19、臨界膠束濃 度（CMC）后形成親水極性頭向內、疏水有機鏈向外的液體顆粒結構，其內核可增 溶水分子或親水物質。微乳液一般由 4 種組分組成，即表面活性劑、助表面活性劑（一般為脂肪醇）、有機溶劑（一般為烷烴或環烷烴）和水。它是一種熱力學穩定體 系，可以合成大小均勻、粒徑在 10nm20nm 的液體顆粒。Chiang41報道了在由水、 異新烷、陰離子表面活性劑氣溶膠和非離子表面活性劑山梨醇脂肪酸酯形成的微乳 液中，用肼還原氯金酸，形成穩定的、各向異性的金納米粒子。Esumi42報道了 在 2-乙烯基吡啶調聚物存在的條件下，在水中用硼氫化鈉還原氯金酸制得金納米粒 子。這種方法本身相對復雜，但獲得的金納

20、米顆粒粒徑小，穩定性高，且易于與反 應體系分離。 晶種生長法： 晶種生長法是通過晶種合成以及晶咱成長分布反應制備金納米顆粒，該法優點 在于比一步法得到的顆粒粒徑分布窄。 Natan38-39等以檸檬酸鈉還原氯金酸制得粒徑為 50±5nm 的納米顆粒。在以 此為晶種，加入適量的氯金酸和羥胺，利用金納米顆粒表面的自催化反應使晶種逐 漸生長。反應過程中，可以通過控制反應條件最終制備出粒徑在 50110nm 之間的 2 上海交通大學碩士學位論文 第一章 緒論 金納米球。Jana40等人利用檸檬酸鈉還原法制備 3.5nm 的晶種，用十六烷基三甲 基溴化銨（CTAB）作為穩定劑，抗壞血酸為還原劑

21、，制備出粒徑均一性很好的金 納米顆粒，通過調節金核和金鹽的比例，還可以實現對其粒徑大小的控制。1.3 金納米棒的合成 金納米棒具有橫向和縱向表面等離子共振（Longitudinal Surface Plasmon Resonance LSPR）峰，其獨特的物理化學性質及光學性質，在生物和醫學領域被 廣泛應用。金納米棒有多種合成方法，包括模板法、52電化學方法、53-54光 化學方法55以及晶種生長方法56-68等。其中又以晶種生長法最為簡單和常用。 晶種生長法： 晶種生長法因其合成過程簡便、高產量、長短徑比可控及表面易于修飾等優點而成 為合成膠體金納米棒最流行的方法。其基本原理是在反應溶液中加入一定量的金納 米顆粒晶種，在表面活性劑分子的作用下，晶種顆粒定向生長為一定徑直比的金或 銀納米棒。這種方法可以追溯到 1989 年 Wiesner 和 Wokaun69等報道的以磷還原 氯金酸得到的晶核為種子溶液，以過氧化氫為引發劑合成非等軸的金納米棒。當今 晶種生長法的概念源自 2001 年 Jana56-57的報道，他們以檸檬酸