1、補體檢測及應用四川大學華西醫院臨床免疫實驗室劉瑾第一節 補體的性質與活化途徑補體是一組存在于人和脊柱動物血清及組織液中,具有酶樣活性,不耐熱,功能上連續反應的糖蛋白,是抗體溶解細胞必要的補充條件。一、補體的性質補體的固有成分；C1-C9、C1q、C1r C1s共11中蛋白分子調節和控制補體系統活化的成分；C1抑制物，膜協同因子蛋白等補體受體：補體C3的受體，CR1-5等補體系統組成補體系統功能參與機體的抗感染防御反應，介導細胞溶解，調理吞噬，免疫黏附以及參與炎癥反應引起的機體的免疫損傷，是體內具有生物學功能的免疫效應系統和放大系統二 、主要兩種補體的活化途徑（一）經典途徑：是以IgG或IgM類

2、抗體結合抗原后的免疫復合物為主要的激活劑，補體的11種成分全部參與的途經。分為識別、活化和膜攻破三個階段。（二） 替代途徑（旁路途經） 激活劑是微生物的菌體多糖、內毒素、蛋白水解酶、IgG4和IgA聚合物等，參與的成分C3、C5-C9、B因子、D因子、P因子。兩種補體激活途徑的比較激活物 抗原抗體復合物 脂多糖、酵母多糖參與成分 C1-C9 C3、C5-C9 B、D、P因子始動分子 C1q C3b所需離子 Ca+2、Mg +2 Mg +2C3 轉化酶 C4b2a C3bBbC5轉化酶 C4b2a3b （C3b）nBb 或 （C3b）nBbP 經典途徑 替代途徑第二節 補體總活性測定一、血清補體

3、總活性測定（CH50試驗）（一）實驗原理： 特異性抗體與紅細胞結合后可激活補體，導致紅細胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分滲入，引起紅細胞腫脹而發生溶血，溶血程度與補體的活性有關。溶血反應程度與補體的劑量依賴呈S型曲線。（二）試驗方法1.2%-5%綿羊紅細胞（SRBC）的配置2.溶血素：抗綿羊紅細胞抗體，是以SRBC免疫家兔所得的兔抗血清。試驗前要進行溶血素的稀釋和滴定。3.稀釋緩沖液:PH7.2-7.4磷酸鹽緩沖液 Ca+2、Mg +2 不同稀釋度溶血素的配置最終稀釋度 稀釋液(ml) 稀釋度 溶血素（ml）1:1000 1.8 1:100 0.21:2000 0.2 1:1000 0.21:3

4、000 0.4 1:1000 0.21:4000 0.2 1:2000 0.21:5000 0.8 1:1000 0.21:6000 0.2 1:3000 0.21:8000 0.2 1:4000 0.21:10000 0.2 1:5000 0.2溶血素的滴定1 1：1000 0.1 0.2 0.2 0.1 全溶血2 1：2000 0.1 0.2 0.2 0.1 全溶血3 1：3000 0.1 0.2 0.2 0.1 37 全溶血4 1：4000 0.1 0.2 0.2 0.1 30分鐘 全溶血5 1：5000 0.1 0.2 0.2 0.1 大部分溶血6 1：6000 0.1 0.2 0.2

5、 0.1 微溶血7 1：8000 0.1 0.2 0.2 0.1 不溶血8 1：10000 0.1 0.2 0.2 0.1 不溶血9 對照 _ _ 0.2 0.1 不溶血管號 溶血素 試管內加入的試劑量（ml） 稀釋度 溶血素 1:60 補體 緩沖液 2%SRBC 結果以最高稀釋度的溶血素仍能產生完全溶血為最大有效反應管(1：4000)即為1個單位，一般試驗使用2個單位(1：2000)試劑用量溶血程度2%SRBC0.5mlDH2O2.0ml100%1.8%Nacl2.0ml2%SRBC0.5ml50%4. 50%溶血標準管配制5.血清總補體50%溶血活性測定(ml)1 0.10 1.400.5

6、 0.52 0.15 1.350.50.53 0.20 1.300.50.54 0.25 1.250.50.55 0.30 1.200.50.56 0.35 1.150.50.57 0.40 1.100.50.58 0.45 1.050.50.59 0.50 1.000.50.510 0,00 1.500.50.5試管號試管號 1：20稀釋血清稀釋血清 巴比妥緩沖巴比妥緩沖 2u溶血素溶血素 2%SRBC按以下公式求50%溶血的總補體值 1CH50（U/ml）= 稀釋倍數 血清用量總補體活性參考范圍:50-100 U /ml(三)方法評價CH50測定經典途徑總補體溶血活性反應的是補體9種成分綜

7、合水平緩沖液PH 、離子強度、Ca+2、Mg +2濃度各個環節嚴加控制。第三節 單個補體成分的測定主要檢測的單個補體成分：C3、C4、C1q、B因子和C1脂酶抑制物方法：免疫溶血法 測定補體的溶血活性 免疫化學法 測定補體的含量一、免疫溶血法 定義：抗原與特異性抗體結合后激活補體的經典途徑，導致紅細胞溶解。當缺乏某種補體成分時，加入指示系統，不能使補體連續激活，不發生溶血；再加入待測血清，使原來缺乏的成分得到補償，補體成分齊全，級聯反應恢復，產生溶血，溶血程度與以待測補體成分活性有關，以50%溶血為終點。 （1）指示系統：兔抗血清致敏SRBC （2）實驗反應系統的補體：選用或制備缺乏某單一補體

8、成分動物或人血清的試劑 （3）待測血清：待測血清標本中的補體測定成分C4B 因子補體來源豚鼠血清正常人血清處理方法氨水加熱去除成分C4B 因子指示系統致敏紅細胞兔紅細胞結果不溶血不溶血加入待測血清補充成分C4B 因子 結果 溶血 溶血 溶血途徑 經典途徑 旁路途徑二、免疫化學法單向免疫擴散法火箭免疫電泳透射比濁法散射比濁法第四節 補體結合試驗一、試驗原理補體結合試驗三個系統：反應系統：已知抗原或抗體與待測抗體或抗原補體系統：豚鼠血清指示系統：SRBC與溶血素結合成為致敏綿羊紅細胞 圖19-3二、試驗方法（一）試劑的制備1.抗原適當純化2.抗原和抗體的滴定:選擇抗原與抗體均呈強陽性反應（100%

9、不溶血）的最高稀釋度作為抗原和抗體的效價，即一個單位由方陣滴定表可見1:64的抗原和1:32的抗體為一個單位,正式試驗抗原用2-4個單位,抗體用4個單位抗原與抗體效價的方陣滴定抗 原 抗 體 抗體對照1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:5121:4 4 4 4 4 4 4 3 2 01:8 4 4 4 4 4 3 2 1 01:16 4 4 4 4 3 3 2 01:32 4 4 4 4 3 2 0 01:64 4 4 4 4 2 1 0 0 01:128 4 2 1 0 0 0 0 0 01:256 3 1 0 0 0 0 0 0 01:512 0 0

10、0 0 0 0 0 0 0 抗原對照 0 0 0 0 0 0 0 0 0注:1、2、3、4分別表示補體結合反應強度 ; 0表示全溶血,補體結合試驗陰性3.補體的滴定管 號 1234561：60補體(ml) 0.040.060.080.100.120.14緩沖液(ml) 0.260.240.220.200.180.16抗原(2U/ml) 0.10.10.10.10.10.1 37水浴30min1%SRBC (ml) 0.20.20.20.20.20.2 37水浴30min結 果 不溶血 不溶血微溶血 微溶血 全溶血 全溶血能產生完全溶血的最少量的補體為1個實用單位，正式試驗選用2個單位 。由表1

11、9-9的結果為1：60的補體0.12ml可產生完全溶血為1個實用單位，按比例公式：20.12/60=0.2/XX=1/50（二）血清標本及時分離血清，盡快檢測或-20保存試驗前滅活補體（三）正式試驗反應物(ml)待測血清 陽性對照 陰性對照 抗原或抗體 補體對照 紅細胞 測定 對照 測定 對照 測定 對照 對照管 2U 1U 0.5U 對照管稀釋血清0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 - - - - -抗原或抗體0.1 - 0.1 - 0.1 - 0.1 0.1 0.1 0.1 -緩沖液- 0.1 -0.1 - 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.4補體 2U0.2 0.2 0.20.2 0.2 0.2 0.2 0.2 - - -補體 1U - - - - - - - 0.2 - -補體 0.5U- - - - - - - - - 0.2 - 混勻，37水浴1h或41618hSRBCs 0.2 0.2 0.20.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2