1、專題五DNA和蛋白質技術課題一DNA的粗提取與鑒定一、提取DNA的溶解性原理包括哪些方面0.14NaCl濃度(ihol/L)C在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度有何特點要使DNA溶解,需要使用什么濃度要使DNA析出,又需要使用什么濃度在L時溶解度最??；較高濃度可使DNA溶解；L可使DNA析出.在溶解細胞中的DNA時,人們通常選用2moi/LNaQ溶液；將DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中緩慢注入蒸鐳水,以稀釋NaCl溶液.酒精是一種常用有機溶劑,但DNA卻不能溶于酒精特別是95%冷卻酒精,但細胞中蛋白質可溶于酒精.2 .從理

2、論上分析,預冷的乙醇溶液具有以下優點.一是抑制核酸水解酶活性,預防DNA降解；二是降低分子運動,易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性,減少斷裂.3 .采用DNA不溶于酒精的原理,可以到達什么目的將DNA和蛋白質進一步別離.,4提取DNA還可以利用DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性原理.利用該原理時,應選用怎樣的酶和怎樣的溫度值蛋白酶,由于酶具有專一性,蛋白酶只水解蛋白質而不會對DNA產生影響.溫度值為6080C.,由于該溫度值蛋白質變性沉淀,而DNA不會變性.補充：DNA的變性是指DNA分子在高溫下解螺旋,其溫度在800以上,如在PCR技術中DNA變性溫度在95C°O5

3、 .洗滌劑在提取DNA中有何作用洗滌劑將細胞膜上的蛋白質,從1而瓦解細胞膜.6 .當鑒定提取出的物質是否是DNA時,需要使用什么指示劑進行鑒定在沸水浴條件下,DNA遇二苯胺呈現藍色.原理總結：通過利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA,可以從細胞中提取和提純DNA；再利用酒精進一步將DNA與蛋白質分離開來,到達提純的目的；最后利用二苯胺試劑鑒定提取的物質是否是DNA.二、實驗材料的選取不同生物的組織中DNA含量不同.在選取材料時,應本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原那么.本實驗用雞血細胞做實驗材料有兩個原因.一是由于雞血細胞核的DNA含量豐富,材料易得；二是雞血細胞極易吸水脹破,而用動

4、物肝臟細胞作實驗材料常常需要勻漿和離心,對設備要求較高,操作繁瑣,歷時較長.雞血細胞破碎以后釋放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,所以在提取過程中為了減少DNA的損失,最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細胞液.三、破碎細胞,獲取含DNA的濾液1、假設選用雞血和洋蔥作實驗材料,那么怎樣獲取含DNA的濾液在雞血細胞液中參加一定量蒸偏水并用玻棒攪拌,過濾后收集濾液；切碎洋蔥,參加一定量洗滌劑和食鹽,攪拌研磨,過濾后收集濾液.2 .為什么參加蒸鐳水能使雞血細胞破裂答：蒸做水對于雞血細胞來說是一種低滲液體,水分可以大量進入血細胞內,使血細胞脹裂,再加上攪拌的機械作用,就加速了雞血細胞的破裂細胞膜和核膜的破裂

5、,從而釋放出DNA.3 .在以上實驗中,參加蒸做水、洗滌劑和食鹽的作用分別是什么過濾時應中選用濾紙、尼龍布.血細胞在蒸鐳水中大量吸水而張裂；洗滌劑瓦解細胞膜；食鹽溶解DNA物質；選用尼龍布進行過濾.4 .在處理植物組織時需要進行研磨,其目的是什么研磨不充分產生什么結果破碎細胞壁,使核物質容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分會使DNA的提取量減少,影響實驗結果,導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等.具體做法.10mL雞血+20mL蒸做水一同方向攪拌一3層尼龍布過濾一濾液三、去除濾液中的雜質1.為什么反復地溶解與析出DNA,能夠去除雜質用高鹽濃度的溶液溶解DNA,能除去在高鹽中不能溶解的

6、雜質；用低鹽濃度使DNA析出,能除去溶解在低鹽溶液中的雜質.因此,通過反復溶解與析出DNA,就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質.最初獲得的DNA濾液含有蛋白質、脂質等雜質,需要進一步提純DNA.方案一的原理是DNA在不同濃度Na.溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質,不分解DNA；方案三的原理是蛋白質和DNA的變性溫度不同.方案二與方案三的原理有什么不同答：方案二是利用蛋白酶分解雜質蛋白,從而使提取的DNA與蛋白質分開；方案三利用的是DNA和蛋白質,對高溫耐受性的不同,從而使蛋白質變性,與DNA別離.四、析出與鑒定1 .在濾液中仍然含有一些雜質,怎樣除去這些雜質呢得到的DNA呈

7、何顏色濾液與等體積的冷卻酒精混合均勻,靜置23分鐘,析出的白色絲狀物就是DNA.DNA呈白色.2 .怎樣鑒定析出的白色絲狀物就是DNA呢具體做法.試管2支,編號甲乙一各加等量5mLNaQ溶液一甲中放入少量白色絲狀物,使之溶解一各加4mL二苯胺,混合均勻一沸水浴5min一觀察顏色變化五、實驗操作制備雞血細胞液加檸檬酸鈉.靜置或離心破碎細胞,釋放DNA加蒸偏水,同一方向快速通方向攪拌1一過濾,除去細胞壁、細胞膜等.溶解核內DNA參加NaCl至2mol/L,同一方向緩慢攪拌DNA析出加蒸微水至L,過濾,在溶解到2mol/L溶液中I一除去細胞質中的大局部物質.DNA初步純化與等體積95%冷卻酒精混合,

8、析出白色絲狀物A1一除去核蛋白、RNA、多糖等.DNA鑒定二苯胺,沸水浴,呈現藍色考前須知：在雞血中參加檸檬酸鈉預防凝固；雞血靜置或離心以提升細胞懸液濃度；使用塑料燒杯；使用尼龍布過濾；玻棒沿同一方向攪拌；玻棒攪拌要緩慢細胞破裂快速攪拌；玻棒不要碰到燒杯壁；二苯胺試劑要現用現配等.課題二多聚酶鏈式反響擴增DNA片段根底知識PCR技術擴增DNA的過程,與細胞內DNA復制過程類似:1.細,胞內DNA復制條件分析:條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復制的模板原料四種脫氧核苦酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶DNA聚合酶翻開DNA雙螺旋催化合成DNA子鏈b曰目匕里ATP為解螺旋和合成子鏈供能引物RNA為

9、DNA聚合酶提供合成的3,端起點2.細胞內DNA復制過程的解析：解旋：解旋酶、ATP,DNA兩條鏈翻開,形成兩條DNA單鏈.引物結合：在DNA單鏈3,端與DNA反向配對結合.DNA聚合酶結合：DNA聚合酶與模板鏈結合,標志著單鏈合成開始.子鏈合成：DNA聚合酶從引物3,端開始,將配對的脫氧核昔酸連接起來.后續加工：DNA聚合酶I將引物切去,并合成空缺處的DNA單鏈,再由DNA連接酶將不連續的DNA子鏈連接起來(半不連續合成.先導鏈,滯后鏈)3 .DNA分子復制的人工限制實驗操作步驟照FCR反響體系配方配制反響液；將PCR反響體系50HL用微量移液器轉移到微量離心管()中；將微量離心管放到PCR

10、儀中；設置PCR儀的工作參數.DNA在PCR儀中大量擴增.4 .實驗考前須知(1)預防外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸做水等使用前高壓滅菌.(2)緩沖液和酶分裝成小份,-20C.低溫保存.(3)每添加一種反響成分,更換一個移液器的槍頭.(4)混勻后離心處理,使反響液集中在離心管底部.總結、點評DNA的復制需要酶、原料、能量、蛋白質的物化理性質：形狀、大小、電荷性質和多少、溶解度、吸附性質、親和力等千差萬別,由此提取和別離各種蛋白質.1 .凝膠色譜法(分配色譜法)：(1)原理：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙,路程短,流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內部,路程長,流動慢.(2)凝膠

11、材料：多孔性,多糖類化合物,如葡聚糖、瓊脂糖.(3)別離過程：混合物上柱一洗脫一大分子流動快、小分子流動慢一收集大分子一收集小分子洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液,促使蛋白質分子的差速流動.(4)作用：別離蛋白質,測定生物大分子分子量,蛋白質的脫鹽等.2 .緩沖溶液(1)原理：由弱酸和相應的強堿弱酸鹽組成(如H2c.3-NaHCCh,NaH2Po4/Na2HPO«等),調節酸和鹽的用量,可配制不同pH的緩沖液.(2)緩沖液作用：抵抗外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩定.3 .凝膠電泳法：(1)原理：不同蛋白質的帶電性質、電量、形狀和大小不同,在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不

12、同,導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同.(2)別離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等.(3)別離過程：在一定pH下,使蛋白質基團帶上正電或負電；參加帶負電荷多的SDS,形成“蛋白質-SDS復合物,使蛋白質遷移速率僅取決于分子大小.二、實險步驟紅細胞的洗滌洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白,采集的血樣要及時采用低速短時間離心別離紅細胞,然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿,將下層暗紅色的紅細胞液體倒入燒杯,再參加五倍,體積的生理鹽水,緩慢攪拌lOmin,低速短時間離心,如此重復洗滌三次,直至上清液,中沒有黃色,說明紅細胞已洗滌干凈.血紅蛋白的釋放在蒸金水和甲苯作用下,紅細胞破裂釋放

13、出血紅蛋白.注：參加蒸做水后紅細胞液體積與原血液體積要相同.參加甲苯的目的是溶解細胞膜,有利于血紅蛋白的釋放和別離.2.粗別離別離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合溶液離心后,試管中的溶液分為4層.第一層為無色透明的甲苯層,第2層為白色薄層固體,是脂溶性物質的沉淀層,第3層是紅色透明液體,這是血紅蛋白的水溶液,第4層是其他雜質的暗紅色沉淀物.將試管中的液體用濾紙過濾,除去之溶性沉淀層,于分液漏斗中靜置片刻后,分出下層的紅色透明液體.2透析取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中,將透析袋放入盛有300mL的物質的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中,透析12h.透析可以去除樣品中分子量較小的雜質,或用于

14、更換樣品的緩沖液.調.節緩沖液面：翻開色譜柱下端的流出口,使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝1膠面平齊,關閉出口.參加蛋白質樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環繞移動加到色譜柱的頂端.加樣后,I翻開下端出口,使樣品滲入凝膠床內,等樣品完全滲入凝膠層后,1關閉出口.調節緩沖液面：參加20mmO1/L的磷酸緩沖液到適當高度洗脫：連接緩沖液洗脫瓶,翻開下端出口,進行洗脫.收集分裝蛋白質：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時,用試管收集.4.純度鑒定-SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳選做三、考前須知電泳技術電泳技術就是在電場的作用下,利用待別離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異,使帶電分子產生

15、不同的遷移速度,從而達到對樣品進行別離、鑒定或提純的目的.2 .紅細胞的洗滌如果分層不明顯,可能是洗滌次數少、未能除去血漿蛋白的原因.此外,離心速度過高和時間過長,會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀,也得不到純潔的紅細胞,影響后續血紅蛋白的提取純度.3 .如何檢測凝膠色譜柱的裝填是否成功由于凝膠是一種半透明的介質,因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的曰光燈,檢查凝膠是否裝填得均勻.此外,還可以參加大分子的有色物質,觀察色帶移動的情況.如果色帶均勻、狹窄、平整,說明凝膠色譜柱的性能良好.如果色譜柱出現紋路或是氣泡,輕輕敲打柱體以消除氣泡,消除不了時要重新裝柱.4 .為什么凝膠的裝填要緊密、均勻如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻,就會在色譜柱內形成無效的空隙,使本該進入凝膠內部的樣品分子從這些空隙中通過,攪亂洗脫液的流動次序,影響別離的效果.5 .沸水浴處理參加洗脫液的濕凝膠的目的不但節約時間,還能除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內的空氣.6 .G-75代表凝膠的交聯程度,膨脹程度及別離范圍,75表示凝膠得水值,即每克凝膠膨脹時吸水.7 .裝填完后,立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密8 ,參加檸檬酸鈉有何目的為什么要低速、短時離心為什么要緩慢攪拌預防血液凝固；預防白r細胞沉淀；預防紅細胞破裂釋放出血紅蛋白.9 .與