1、生物大分子的生物大分子的識別、分離和檢測識別、分離和檢測生物大分子生物大分子生物大分子生物大分子: : 指分子量大于10,000，有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)，具有生物活性的物質(zhì)；如多肽、蛋白質(zhì)、酶等。特性：特性： 具有特定的生化結(jié)構(gòu)（組成，序列和構(gòu)象） 分子量大，分子極性強(qiáng) 對溫度、pH值、剪切力、有機(jī)溶劑等非常敏感生物大分子的識別生物大分子的識別 “看清看清”生物大分子生物大分子“是誰是誰”； “看清看清”生物大分子生物大分子“是什么樣子是什么樣子”。 質(zhì)譜測定分析質(zhì)譜測定分析 一種識別生物大分子的方法一種識別生物大分子的方法 質(zhì)譜測定分析法是通過測定樣品中物質(zhì)的質(zhì)量來識別物質(zhì)譜測定分析法是通過測定樣品

2、中物質(zhì)的質(zhì)量來識別物質(zhì)的類別。質(zhì)的類別。 傳統(tǒng)的質(zhì)譜分析方法是：傳統(tǒng)的質(zhì)譜分析方法是： 首先將成團(tuán)的蛋白質(zhì)分子拆分成各自獨(dú)立的單個分子，首先將成團(tuán)的蛋白質(zhì)分子拆分成各自獨(dú)立的單個分子，將其電離并使之懸浮在真空中，然后讓它們在電場作用下運(yùn)將其電離并使之懸浮在真空中，然后讓它們在電場作用下運(yùn)動。動。 這種方法的缺點(diǎn)在于生物大分子比較脆弱，在拆分和電這種方法的缺點(diǎn)在于生物大分子比較脆弱，在拆分和電離成團(tuán)的生物大分子過程中它們的結(jié)構(gòu)和成分很容易被破壞。離成團(tuán)的生物大分子過程中它們的結(jié)構(gòu)和成分很容易被破壞。美國科學(xué)家約翰美國科學(xué)家約翰芬恩，獲芬恩，獲20022002年年諾貝爾化學(xué)獎諾貝爾化學(xué)獎日本科學(xué)家

3、田中日本科學(xué)家田中耕一，獲耕一，獲20022002年年諾貝爾化學(xué)獎諾貝爾化學(xué)獎對成團(tuán)的生物大對成團(tuán)的生物大分子施加強(qiáng)電場分子施加強(qiáng)電場用軟激光轟擊成用軟激光轟擊成團(tuán)的生物大分子團(tuán)的生物大分子使生物大分子相互完整地分離，同時也被電離使生物大分子相互完整地分離，同時也被電離。芬恩的電噴霧質(zhì)譜技術(shù)（芬恩的電噴霧質(zhì)譜技術(shù)（ESIESI）原理圖）原理圖田中耕一的軟激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)田中耕一的軟激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)（RLD）原理圖）原理圖質(zhì)譜測定方法解決了質(zhì)譜測定方法解決了“看清看清”生物大分子生物大分子“是誰是誰”的問題的問題電噴霧電噴霧質(zhì)譜質(zhì)譜法法electron spray mass spectrom

4、etry ESMSelectron spray mass spectrometry ESMS 樣品溶液經(jīng)很細(xì)的進(jìn)樣管進(jìn)入電噴霧室，在強(qiáng)電場的樣品溶液經(jīng)很細(xì)的進(jìn)樣管進(jìn)入電噴霧室，在強(qiáng)電場的作用下，樣品溶液在出口處因電荷的分離和靜電引力而破作用下，樣品溶液在出口處因電荷的分離和靜電引力而破碎成許多細(xì)小的帶有電荷的液滴，當(dāng)液滴蒸發(fā)到某一程度，碎成許多細(xì)小的帶有電荷的液滴，當(dāng)液滴蒸發(fā)到某一程度，液滴表面的庫侖斥力使液滴爆炸。產(chǎn)生的小帶電液滴繼續(xù)液滴表面的庫侖斥力使液滴爆炸。產(chǎn)生的小帶電液滴繼續(xù)此過程。隨著液滴的水分子逐漸蒸發(fā)，就可獲得自由徘徊此過程。隨著液滴的水分子逐漸蒸發(fā)，就可獲得自由徘徊的質(zhì)子化和

5、去質(zhì)子化的蛋白分子。的質(zhì)子化和去質(zhì)子化的蛋白分子。 電噴霧液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀電噴霧液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 樣品的分子離子和裂片離子經(jīng)一系列分離器和靜電透樣品的分子離子和裂片離子經(jīng)一系列分離器和靜電透鏡進(jìn)入質(zhì)量分析器進(jìn)行質(zhì)譜分析。鏡進(jìn)入質(zhì)量分析器進(jìn)行質(zhì)譜分析。 這種電噴霧質(zhì)譜法具有很高靈敏度，且電離的分子可這種電噴霧質(zhì)譜法具有很高靈敏度，且電離的分子可以帶有多電荷，這種多電荷離子的產(chǎn)生大大擴(kuò)展了普通質(zhì)以帶有多電荷，這種多電荷離子的產(chǎn)生大大擴(kuò)展了普通質(zhì)譜儀能分析的質(zhì)量范圍，使質(zhì)譜儀可以分析分子量為幾十譜儀能分析的質(zhì)量范圍，使質(zhì)譜儀可以分析分子量為幾十萬質(zhì)量單位的蛋白質(zhì)分子。精確度達(dá)到萬質(zhì)量單位的蛋白質(zhì)

6、分子。精確度達(dá)到99.99%99.99%。 激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry（MALDI-TOF MS ） MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS的原理是：當(dāng)用一定強(qiáng)度的激光照射樣品的原理是：當(dāng)用一定強(qiáng)度的激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)吸附，基質(zhì)- -樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣

7、品分子電離，電離的樣品在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的的樣品在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同而被檢測，即測定離子的質(zhì)量電荷之比（飛行時間不同而被檢測，即測定離子的質(zhì)量電荷之比（M/ZM/Z）與離子的飛行時間成正比來檢測離子。與離子的飛行時間成正比來檢測離子。 MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS的中心技術(shù)就是依據(jù)樣品的質(zhì)荷比（的中心技術(shù)就是依據(jù)樣品的質(zhì)荷比（m/zm/z）的不同來進(jìn)行檢測，并測得樣品分子的分子量。的不同來進(jìn)行檢測，并測得樣品分子的分子量。 MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS具有靈敏度高、具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、分

8、辨率高、圖譜簡明、準(zhǔn)確度高、分辨率高、圖譜簡明、質(zhì)量范圍廣及速度快等特點(diǎn)，在操質(zhì)量范圍廣及速度快等特點(diǎn)，在操作上制樣簡便、可微量化、大規(guī)模、作上制樣簡便、可微量化、大規(guī)模、并行化和高度自動化處理待檢生物并行化和高度自動化處理待檢生物樣品，而且在測定生物大分子和合樣品，而且在測定生物大分子和合成高聚物應(yīng)用方面有特殊的優(yōu)越性。成高聚物應(yīng)用方面有特殊的優(yōu)越性。近年來已成為檢測和鑒定多肽、蛋近年來已成為檢測和鑒定多肽、蛋白質(zhì)、多糖、核苷酸、糖蛋白、高白質(zhì)、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多種合成聚合物的強(qiáng)有力聚物以及多種合成聚合物的強(qiáng)有力工具。工具。 激光解吸附電離質(zhì)譜儀激光解吸附電離質(zhì)譜儀 在核磁共

9、振技術(shù)出現(xiàn)以前，在核磁共振技術(shù)出現(xiàn)以前，X X射線晶體分析技術(shù)是惟一射線晶體分析技術(shù)是惟一可以研究蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法。該法是根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)晶對可以研究蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法。該法是根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)晶對X X射線的衍射作用實(shí)現(xiàn)的。但該法不能對溶液進(jìn)行分析。射線的衍射作用實(shí)現(xiàn)的。但該法不能對溶液進(jìn)行分析。 核磁共振技術(shù)彌補(bǔ)了核磁共振技術(shù)彌補(bǔ)了X X射線晶體分析技術(shù)的不足，能夠射線晶體分析技術(shù)的不足，能夠?qū)θ芤褐械牡鞍踪|(zhì)進(jìn)行分析，即在蛋白質(zhì)最自然的生存環(huán)境對溶液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，即在蛋白質(zhì)最自然的生存環(huán)境下對它們進(jìn)行研究，進(jìn)而得到下對它們進(jìn)行研究，進(jìn)而得到“活活”蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。核磁共振 一

10、種揭示生物大分子真面目的方法 在結(jié)晶狀態(tài)下蛋白質(zhì)分子是緊緊地積壓在一起的，而在在結(jié)晶狀態(tài)下蛋白質(zhì)分子是緊緊地積壓在一起的，而在溶液中它們則處在最自然的生理狀態(tài)下。溶液中它們則處在最自然的生理狀態(tài)下。 朊病毒蛋白質(zhì)分子朊病毒蛋白質(zhì)分子中肽鏈有一半（中肽鏈有一半（23-12023-120）在水溶液中是呈現(xiàn)無規(guī)在水溶液中是呈現(xiàn)無規(guī)則的、松散的、靈活多則的、松散的、靈活多變的狀態(tài)。變的狀態(tài)。應(yīng)用核磁共振技術(shù)測定的應(yīng)用核磁共振技術(shù)測定的朊病毒蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)圖朊病毒蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)圖 核磁共振法獨(dú)到之處是測定溶液中的蛋白質(zhì)，是在最接近分子自然核磁共振法獨(dú)到之處是測定溶液中的蛋白質(zhì)，是在最接近分子自然生理狀態(tài)

11、的條件下進(jìn)行測定。生理狀態(tài)的條件下進(jìn)行測定。 維特里希設(shè)計了一套將核磁共振信號與生物大分子維特里希設(shè)計了一套將核磁共振信號與生物大分子中的質(zhì)子相對應(yīng)的系統(tǒng)分析方法。中的質(zhì)子相對應(yīng)的系統(tǒng)分析方法。他他進(jìn)一步說明這些質(zhì)進(jìn)一步說明這些質(zhì)子間的距離如何確定，再結(jié)合距離幾何學(xué)的數(shù)學(xué)方法就子間的距離如何確定，再結(jié)合距離幾何學(xué)的數(shù)學(xué)方法就可獲得大分子清晰的三維結(jié)構(gòu)圖。可獲得大分子清晰的三維結(jié)構(gòu)圖。 瑞士科學(xué)家瑞士科學(xué)家?guī)鞝柼貛鞝柼鼐S特里維特里希，獲希，獲2002年諾年諾貝爾化學(xué)獎貝爾化學(xué)獎 如果確定了一座建筑物的所有工程數(shù)據(jù)，就可以快速而如果確定了一座建筑物的所有工程數(shù)據(jù)，就可以快速而準(zhǔn)確地繪出該建筑物的三

12、維結(jié)構(gòu)圖。準(zhǔn)確地繪出該建筑物的三維結(jié)構(gòu)圖。 核磁共振技術(shù)方法解決了核磁共振技術(shù)方法解決了“看清看清”生物大分子生物大分子“是什是什么樣子么樣子”的問題。的問題。生物大分子的分離與檢測生物大分子的分離與檢測 生物大分子通常來自天然產(chǎn)物或發(fā)酵液中，并以混生物大分子通常來自天然產(chǎn)物或發(fā)酵液中，并以混合物、低濃度的狀態(tài)存在。合物、低濃度的狀態(tài)存在。 除了分子量大，還具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜（具三級或四級結(jié)除了分子量大，還具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜（具三級或四級結(jié)構(gòu)），具有生物活性，一旦條件不適合就喪失活性，因構(gòu)），具有生物活性，一旦條件不適合就喪失活性，因此在分離技術(shù)上與一般的小分子有機(jī)物的分離有差別。此在分離技術(shù)上與一般的小

13、分子有機(jī)物的分離有差別。質(zhì)譜質(zhì)譜色譜色譜色譜法色譜法 由液相色譜、氣相色譜和毛細(xì)管電泳等所組成的色譜學(xué)由液相色譜、氣相色譜和毛細(xì)管電泳等所組成的色譜學(xué)是現(xiàn)代分離、分析的主要組成部分。是現(xiàn)代分離、分析的主要組成部分。 液相色譜與毛細(xì)管電泳技術(shù)是目前已知的兩種最有效的分液相色譜與毛細(xì)管電泳技術(shù)是目前已知的兩種最有效的分離生物大分子的方法。離生物大分子的方法。 毛細(xì)管電泳處理量小，在分離過程中會破壞生物大分子的毛細(xì)管電泳處理量小，在分離過程中會破壞生物大分子的構(gòu)象、降低其生物活性。構(gòu)象、降低其生物活性。 液相色譜一般在室溫下進(jìn)行，所用流動相為液體，固定相液相色譜一般在室溫下進(jìn)行，所用流動相為液體，固

14、定相的表面經(jīng)過各種化學(xué)修飾，能為生物大分子的分離提供的表面經(jīng)過各種化學(xué)修飾，能為生物大分子的分離提供“軟接軟接觸觸”的溫和相互作用，因此成為分離生物大分子強(qiáng)有力的手段。的溫和相互作用，因此成為分離生物大分子強(qiáng)有力的手段。膜色譜技術(shù)膜色譜技術(shù) 膜色譜技術(shù)是液相色譜與膜分離相結(jié)合的一種新技術(shù)，融膜色譜技術(shù)是液相色譜與膜分離相結(jié)合的一種新技術(shù)，融合了二者之長，具有快速、高效、高選擇性、易于放大等特點(diǎn)，合了二者之長，具有快速、高效、高選擇性、易于放大等特點(diǎn)，能滿足生物大分子高效分離與純化的需要。能滿足生物大分子高效分離與純化的需要。 膜色譜采用具有一定孔徑的膜作為介質(zhì)膜色譜采用具有一定孔徑的膜作為介質(zhì)

15、, ,連接配基連接配基, ,利用膜利用膜配基與生物大分子之間的相互作用進(jìn)行分離純化。配基與生物大分子之間的相互作用進(jìn)行分離純化。 當(dāng)料液以一定流速流過膜的時，目標(biāo)分子與膜介質(zhì)表面或當(dāng)料液以一定流速流過膜的時，目標(biāo)分子與膜介質(zhì)表面或膜孔內(nèi)基團(tuán)特異性結(jié)合，而雜質(zhì)則透過膜孔流出，待處理結(jié)束膜孔內(nèi)基團(tuán)特異性結(jié)合，而雜質(zhì)則透過膜孔流出，待處理結(jié)束后再通過洗脫液將目標(biāo)分子洗脫下來，其純化倍數(shù)可達(dá)數(shù)百乃后再通過洗脫液將目標(biāo)分子洗脫下來，其純化倍數(shù)可達(dá)數(shù)百乃至上千倍。至上千倍。膜色譜特點(diǎn)為膜色譜特點(diǎn)為: :優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： (1)(1)生物大分子在膜介質(zhì)中以對流傳質(zhì)為主，分離速度生物大分子在膜介質(zhì)中以對流傳質(zhì)為主，分離速度快，特別適用于生物大分子的快速分離快，特別適用于生物大分子的快速分離 (2)(2)柱壓低柱壓低 (3)(3)易于放大，只要簡單的增加柱長就可以達(dá)到目標(biāo)易于放大，只要簡單的增加柱長就可以達(dá)到目標(biāo) (4)(4)可直接處理復(fù)雜的生物樣品，幾乎不需要與處理可直接處理復(fù)雜的生物樣品，幾乎不需要與處理 (5)(5)膜基質(zhì)生物兼容性好膜基質(zhì)生物兼容性好缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： (1)(1)柱效低柱效低 (2)(2)耐壓性差耐壓性差現(xiàn)代分離制備技術(shù)課程論文備選題現(xiàn)代分離制備技術(shù)課程論文備選題1 1. .物