團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)`水生態(tài)監(jiān)測環(huán)境DNA熒光定量PCR法Waterecologicalmonitoring-environmentalDNAquantitativereal-timePCRmeth四川省生態(tài)環(huán)境政策法制研究會發(fā)布I 2 2 3 6 7 8 9 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定站、中國科學(xué)院成都生物研究所、四川省環(huán)境政策研究與規(guī)劃院、四川省生態(tài)環(huán)境科常明慶、劉思瑤、王志浩、杜壯、于苗、張1水生態(tài)監(jiān)測環(huán)境DNA熒光定量PCR法GB/T19495.5轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶HJ710.8生物多樣性觀測技術(shù)導(dǎo)則淡水底棲大型無脊椎動物HJ1295水生態(tài)監(jiān)測技術(shù)指南河HJ1296水生態(tài)監(jiān)測技術(shù)指南湖SN/T4278國境口岸醫(yī)學(xué)媒介昆蟲DNA條3.1在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中加人熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，并通過標(biāo)準(zhǔn)3.23.33.42在實(shí)驗(yàn)過程中，與受試樣品平行進(jìn)行的，用確定不含DNA的樣品代替受試樣品進(jìn)行的對照反應(yīng)，用3.54.6擴(kuò)增引物和探針。36環(huán)境DNA熒光定量PCR檢測方法圖1環(huán)境DNA熒光定量PCR技術(shù)流程圖4水+++++），a)陽性對照：已知物種組成的混合群落。6.3.2.1濾膜樣品（水樣或混合浮游動物組織樣品）：利用研磨珠和裂解液將濾膜振蕩破碎，速度不56.3.2.4混合大型底棲無脊椎動物組雜質(zhì)，宜采用離心柱法或磁珠法等常規(guī)分子生物6.4標(biāo)準(zhǔn)曲線制備將含有目標(biāo)物種或生物類群的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子DNA溶液進(jìn)行梯度稀釋。為便于后續(xù)計(jì)算，宜先稀釋至關(guān)系制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線即以DNA拷貝數(shù)的對數(shù)作為橫坐標(biāo)，Ct值作為縱坐標(biāo)作圖，并獲得標(biāo)準(zhǔn)曲定量PCR預(yù)混液。每個(gè)DNA樣品3個(gè)重復(fù)。體系配制應(yīng)按照單次實(shí)驗(yàn)DNA模板 -6定量PCR反應(yīng)程序見表3。不同定量PCR平臺對除退火延伸外步驟中的溫度和時(shí)間要求不同，宜應(yīng)調(diào)整。不同引物退火溫度不同，推薦退火延伸溫度60℃~65℃,退火延伸時(shí)間1min。在退火延伸步注：推薦退火延伸推薦60℃~65℃。設(shè)置PCR反應(yīng)熒光信號收集條件,應(yīng)與探針標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)一致。具體設(shè)置方法可參照儀器使用說a)陽性對照，為目標(biāo)物種或生物類群基因組DNA，或含有上述片段的質(zhì)粒標(biāo)6.6結(jié)果分析與計(jì)算擴(kuò)增平行重復(fù)測試結(jié)果判定方法按照GB/T19495.5的相關(guān)規(guī)7廢棄物的分類、收集、存放和集中處理宜按照GB19489在處理之前宜采用高壓滅菌、消毒或焚燒等方式滅活，對含核8氣溫(℃):水溫(℃):電導(dǎo)率(μS/cm采樣工具：□抓斗□抓泥器□鉆探裝置□其混合大型底棲無脊采樣工具：□抓斗式采泥器□彼得森采樣器9B.1.1制定合理的采樣操作程序，在確定的采樣時(shí)間、采樣點(diǎn)、采樣層次，用符合質(zhì)量要求的統(tǒng)一設(shè)B.1.3合理安排各類生物樣品采集順序，盡量避免生物類群在采集前受到B.1.5及時(shí)在現(xiàn)場處理樣品。受生物活動影響，隨b)采樣和前處理過程宜采用一次性無菌裝置或耗材。對于重復(fù)使用裝置和耗材，宜選用漂白劑d)只從外部接觸采樣瓶，不得接觸采樣瓶及瓶蓋內(nèi)g)過濾水樣前，每個(gè)樣品的過濾器接觸面宜使用漂白劑消毒不少于1分鐘，并用蒸餾填寫環(huán)境采樣記錄表，見附錄A。詳細(xì)記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、經(jīng)緯度、水C.1.1DNA提取實(shí)驗(yàn)室和PCR實(shí)驗(yàn)室須在物理C.1.3每個(gè)實(shí)驗(yàn)室宜配備專用的實(shí)驗(yàn)工作服，并C.2.3確保所有的實(shí)驗(yàn)耗材和試劑在保質(zhì)期內(nèi)C.2.4實(shí)驗(yàn)耗材（如槍頭、離心管和PCR管等）須進(jìn)行高C.2.6實(shí)驗(yàn)操作前，移液槍宜選用75%的酒精消毒或紫外線消毒30C.2.7實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)人員全程C.2.8實(shí)驗(yàn)過程中，移液槍不得接觸任何盛放樣品或試劑的容器C.2.9同一耗材（例如1.5mL離心管、移液槍頭等）C.2.11懷疑或確定產(chǎn)生交叉污染的樣品、試劑或耗材，不得繼續(xù)C.