1、色層分析法之原理與應(yīng)用黃平志黃平志色層分析法之定義與原理n色層分析( chromatography)簡稱層析。n係一種分離技術(shù)。n操作過程：利用含混合物之移動相(mobile phase)流經(jīng)固定相(stationary phase) 。n分離機制：n混合物中各成分在固定相和移動相之間的分配係數(shù)不同(即親和力不同) 。 n各成分移動速率不同，而達到分離之目的。n化合物與靜相親和力較強，則沖提較慢(即滯留時間長) n化合物與移動相的親和力較強，則沖提較快(即滯留時間短)。色層分析法之發(fā)展n20世紀初，Tswett發(fā)現(xiàn)當溶有植物萃取液之石油醚倒於內(nèi)含碳酸鈣顆粒之玻璃管柱，再參與石油醚使其自然流下時

2、，植物色素被分離而於管柱內(nèi)呈現(xiàn)不同顏色之色帶。n氣相層析儀。nHPLC。n離子層析、超臨界流體層析S eparation of com pounds , andFlowABCD層析分離表示圖層析之原理層析之原理nt : Retention timen滯留時間層析之分類層析之分類n依兩相之物理性質(zhì)分類：n氣相層析法(GC)：以氣體為移動相n氣固層析法(GSC) 氣液層析法(GLC)n液相層析法(LC)：以液體為移動相n液固層析法(LSC) 液液層析法(LLC)n超臨界流體層析法(SFC)層析之分類層析之分類依固定相之運用型式分類：管柱層析法(Column Chromatography)平面層析法

3、(Planar Chromatography) 於平面介質(zhì)上進行分離濾紙層析法(Paper Chromatography)薄層層析法(Thin Layer Chromatography)層析之分類層析之分類依分離原理分類吸附式層析法 分配式層析法 離子交換式層析法 大小排除層析法Affinity 層析法層析圖及相關(guān)名詞介紹層析圖及相關(guān)名詞介紹 n基線：於正常操條件下，僅有流動相通過檢出器時之訊號曲線。n層析峰：由管柱流出之成分於通過檢出器時之產(chǎn)生之訊號對時間曲線。n峰高：由峰最大值至峰底之距離。n層帶寬度：峰寬 半頂峰寬n峰面積：峰與峰底間之面積WhWh/2層析圖及相關(guān)名詞介紹層析圖及相關(guān)名詞

4、介紹 n無感時間( dead time, tM )：不被固定相所滯留之成分由進入系統(tǒng)至檢出器呈現(xiàn)其最大訊號之時間，代表流動相經(jīng)系統(tǒng)到檢出器所需之時間。n滯留時間( retention time, tR )： ：成分由進入系統(tǒng)至檢出器呈現(xiàn)其最大訊號之時間。n調(diào)整滯留時間(tR )： 減去無感時間之滯留時間。WhWh/2層析圖及相關(guān)名詞介紹層析圖及相關(guān)名詞介紹 n無感體積(VM)： 不被固定相所滯留之物質(zhì)由進入系統(tǒng)至檢出器呈現(xiàn)其最大訊號時需之流動相體積。n滯留體積n調(diào)整滯留體積n相對滯留值(relative retention value)或分離因子(selectivity factor)：在一樣

5、操作條件下，成分與參考成分調(diào)整滯留時間之比。WhWh/2影響分離效果之因子影響分離效果之因子n分配係數(shù)(partition coefficient) n容量因子(capacity factor)n選擇因子(separation factor)n柱效率及理論板數(shù)n解析度(resolution)分配係數(shù)(partition coefficient)及容量因子(capacity factor) n分配係數(shù)：平衡時，成分在固定相及移動相中的濃度比(溶質(zhì)在不互溶或僅稍互溶之二溶劑間的分配關(guān)係)n K = CL/CMn容量因子：平衡時，成分在固定相及移動相中的質(zhì)量比n k = CL VL/CM VM =

6、KVL/VM = (tR- tM)/tM = tR/tMn選擇因子或分離因子( )( )YYR YMXXRXMKkttKktt柱效率及理論板數(shù) 平板理論N:理論平板數(shù) number of theoretical platesN=16(tR/W)2H: height equivalent of a theoretical plates理論平板等效高度(平板厚度)H=LW2/16tR2L: column length管柱長度L=NH N=L/H解析度Resolution 2141RRBASABBBttRWWkNkRs=Z/(WA/2+WB/2)如何添加解析度 2141RRBASABBBttRWWk

7、Nkn添加理論板數(shù)(N)：即添加管柱長度或減小理論板高n添加選擇因子(分離因子)1.0 1.001 1.01 1.1 1.5 2.0(-1)/ 0 0.001 0.01 0.091 0.38 0.50 改變固定相，柱溫(GC)，流動相(HPLC)改變?nèi)萘恳蜃樱簁 0.5 1.0 3.0 5.0 8.0 10.0 30 50k/(1+ k) 0.33 0.50 0.75 0.83 0.89 0.91 0.97 0.98影響層析峰寬之要素n渦流擴散(eddy diffusion)n縱向擴散(longitudinal diffusion)n非平衡質(zhì)量傳送(nonequilibrium mass tr

8、ansfer)n控制因子：流動速率、填充物粒徑、擴散速率、固定相厚度van Deemter equation 導出流動相流動速率與之關(guān)係式H = A + B/u + CuA：渦流擴散項(多徑項)，由粒徑、幾何形狀及固定相填充緊密度有關(guān)A=2dpB：縱向擴散項(分子擴散)C：質(zhì)傳阻力項Partition PackingPacked ColumnsCarrier GasLiquid PhaseSolid SupportVery porous with very high surface areavan Deemter equationWall Coated Open Tubular (WCOT)L

9、iquid PhaseCapillary Columnsvan Deemter equation 層析法之定性分析層析法之定性分析n依據(jù)滯留時間定性n與己知物對照 n雙管柱對照n利用化學性質(zhì)定性n利用選擇性檢出器雙檢出器系統(tǒng)定性n與其他儀器結(jié)合定性：GC-MS, FT-IR 層析法之定量分析層析法之定量分析n一定分析條件下，待測成分於檢出器產(chǎn)生之訊號與其量成正比：a.峰高 b.峰面積 c.積分儀之應(yīng)用n校正因子：各成分於檢出器產(chǎn)生之訊號不同，即靈敏度不同n絕對校正因子：fi = mi/Ai mi = fi x Ain相對校正因子：fi = mi/Ai, fs = ms/Asn fi = (mi

10、/Ai/) (ms/As) = miAs/msAin定量方法：n歸一法(normalization method)：適用於各成分均能流出並被檢測之狀況n 操作條件應(yīng)維持不變 應(yīng)適用於線性範圍內(nèi) n 樣品注入量較不需嚴格控管n外標準法：n內(nèi)標準法：n標準添加法氣相層析法n以氣體作為移動相之層析法，移動相與分析物質(zhì)不起作用n氣相層析法之特點n高選擇性。n高效能。n高靈敏度n分析速度快。氣相層析儀管柱樣品注人器偵檢器資料擷取及儀器控制用電腦典型之氣相層析儀構(gòu)造載流氣體氫氣空氣兩段式調(diào)壓閥氣相層析儀n氣體供應(yīng)系統(tǒng)n樣品注入系統(tǒng)n管柱 n管柱恆溫控制器(烘箱)n偵檢器 n數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)氣體及管線 氣體鋼瓶

11、Helium氣相層析儀除氧除水開關(guān)閥兩段式調(diào)壓閥開關(guān)閥載流及偵檢器支持氣體之品質(zhì)需求Carrier and Detector Support GasesnChosen with the consideration of the type of detector usednInertnDrynPureUsing Compressed GasSafelyObtain safety information from your companys safety department orfrom your local gas supplier.氣相層析儀流量控制流量控制閥中裝有限流器 鋼瓶壓力亦需適當調(diào)

12、整 載流氣體必須是高純度，且需在氣體鋼瓶和氣相層析儀間加裝純化裝置，以去除氣體中的微量水氣和氧氣樣品注入系統(tǒng)手動注射自動注射吹氣捕捉分流/不分流注入口 Split/Splitless InletSplit Mode for Major Component AnalysesSplitless Mode for Trace Component Analyses Pulsed Split Allows for larger injection volume Pulsed Splitless Allows for larger injection volume SEAL(INLET)(SEPTUM)S

13、PLIT VENTTOTAL FLOWCOLUMNSEPTUM= CARRIER GASLINER50 mL/min2 mL/min0.6 mL/min48 mL/min47.4 mL/minPURGE VENTPURGE VALVESplit Flow Diagram: Pre-Injection吹氣捕捉裝置層析管柱之種類Column TypesLENGTH (meters)I.D. (mm).5-102-45-100.5305-100.1-.25PACKEDSERIES 530NARROW BORE填充管柱Packed毛細管柱Open (Capillary)Wall CoatedOpen

14、Tube管柱-填充管柱n玻璃管柱n長 1.5至 3 mn內(nèi)徑 2至 4 mmn內(nèi)部填充外表被覆一層液相的小固體顆粒( 60至100篩目的矽藻土或碳化物)管柱-毛細管柱n開口式玻璃毛細管柱n長 15至 100 mn內(nèi)徑 0.2至 0.75 mmn管柱裡面塗敷一層液相，現(xiàn)在大部分的毛細管柱是運用熔矽材質(zhì)，而玻璃管柱也仍被用來分析揮發(fā)性有機物n毛細管柱的分離效果比填充管柱好10% of ApplicationsCarrier GasAdsorbentPacked ColumnsAdsorbent Packing (GSC)Capillary - Porous Layer Open Tubular (

15、PLOT)Porous with large surface areaCarrier GasGas Solid Chromatography (GSC)Partition PackingPacked ColumnsCarrier GasLiquid PhaseSolid SupportVery porous with very high surface areaGas Liquid Chromatography (GLC)Wall Coated Open Tubular (WCOT)Liquid PhaseCapillary Columns(90% Of Applications)Like d

16、issolves likeorPolar interacts with polarSeparation by partitioning or differential solubility in stationary phaseComponents are separated based on differences in polarity (interaction of dipole forces)GenerallyExample: Alcohols are polar Carbowax is polar liquid phaseGas Liquid Chromatography (GLC)

17、Parameter effect on R down sides Column length the longer the betterlonger elution timeFilm thickness the thinner the bettersmaller sample loads poor retention for extremely volatile compoundsInner diameter the smaller the bettersmaller sample loadsSummary of column parameters on Resolution不同型式管柱性能之

18、比較Comparison of Column Types12456891011&1271 2456910117&812Packed Column Analysis:Capillary Conventional5% OV101on 80/100 Chromosorb30m X 0.53mm X .88m30m X 0.32mm X .25mHP Column Evaluation Sample理想偵檢器特性n適當靈敏度(Sensitivity)n穩(wěn)定性(Stability)及再現(xiàn)性(Reproducibility)佳n適當線性範圍(Linear dynamic range)n適當溫度範圍n反應(yīng)時間(Response time)短且不受載流氣體流速影響n內(nèi)容積小以防止溶質(zhì)帶變寬n對一切溶質(zhì)都有類似訊號或?qū)σ换蚨喾N類型溶質(zhì)具選擇性感應(yīng)n對溶質(zhì)沒有破壞性n高可信度且運用方便n熱傳導度偵檢器nThermal Conductivity Detector (TCD)n火燄離子化偵檢器nFlame Ionization Detector (FID)n電子捕捉偵檢器nElectron Capture Detector (ECD)n氮磷偵檢器nNitrogen Phosphorus Detector (NPD)n火