1、線粒體蛋白質組學的研究進展(一)【摘要】 線粒體是真核細胞重要的細胞器， 隨著蛋白質組技術的發展和完善， 一些新方法也 被應用于線粒體蛋白質的研究， 線粒體蛋白質組研究雖然已取得了一些成果， 但線粒體蛋白 質組數據庫中的數據仍較匱乏，并且還有一些問題亟待解決和改善。【關鍵詞】線粒體；蛋白質組學 人類體細胞中除了紅細胞，其他所有細胞均含有線粒體。線粒體是真核細胞重要的細胞器， 它不僅是機體的能量代謝中心，而且還參與多種重要的細胞病理過程。線粒體擁有自己的DNA(mtDNA),可以進行轉錄、翻譯蛋白質合成。線粒體含有5002000種蛋白質，約占整個細胞蛋白質種類的5%10%。線粒體的蛋白質參與機體

2、許多生理、病理過程，如參與電 子傳遞和ATP合成、三羧酸循環、脂肪酸氧化、氨基酸降解等過程。線粒體蛋白質結構與功 能的改變與人類許多疾病相關， 如退行性疾病、心臟病、 衰老和癌癥。 運用蛋白質組研究技 術，從整體上研究這些蛋白質在生理及病理狀態下的變化趨勢及相互關系，可以為線粒體作用機制的探索提供新的有力的支持。1線粒體的超微結構和功能線粒體是機體細胞中重要的亞細胞器， 它具有獨特的超微結構和多種重要的生物學功能。 線 粒體由兩層膜包被， 外膜平滑， 內膜向內折疊形成嵴， 兩層膜之間有腔， 線粒體中央是基質。基質內含有與三羧酸循環所需的全部酶類，內膜上具有呼吸鏈酶系及ATP酶復合體。線粒體是細

3、胞內氧化磷酸化和形成ATP的主要場所，有細胞動力工廠”之稱。線粒體合成的ATP供給幾乎所有的細胞生理過程： 從骨骼肌和心肌的收縮， 到細胞膜跨膜離子梯度的維持、 甚至 激素和神經遞質的分泌等。另外，線粒體有自身的DNA和遺傳體系，但線粒體基因組的基 因數量有限， 因此， 線粒體只是一種半自主性的細胞器。 線粒體的主要化學成分是蛋白質和 脂類，其中蛋白質占線粒體干重的65%70%，脂類占25%30%。在肝細胞線粒體中外膜、內膜、 膜間隙和基質四個功能區， 各蛋白質的含量依次為： 基質67%，內膜21%，外膜8%， 膜間隙4%。內膜含有三類功能性蛋白：(1)呼吸鏈中進行氧化反應的酶。(2)ATP合

4、成酶復合物。 (3)一些特殊的運輸蛋白，調節基質中代謝物的輸出和輸入。細胞線粒體的功能， 不僅限于生物學功能。 它們在氨基酸和血脂新陳代謝、 血紅素和鐵硫群生物合成、 細胞信號 與細胞凋亡發揮關鍵作用。2線粒體蛋白質組學概述2.1蛋白質組學的概念蛋白質組學 (proteome)詞， 源于蛋白質(protein)與基因組(genome) 兩個詞的雜合，意指“一種基因組所表達的全套蛋白質 ”，即包括一種細胞乃至一種生物所表 達的全部蛋白質。 蛋白質組本質上指的是在大規模水平上研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平、翻譯后的修飾、 蛋白與蛋白相互作用等， 由此獲得蛋白質水平上的關于疾病發生、 細胞代

5、謝等過程的整體而全面的認識。2.2蛋白質組學的研究內容蛋白質組學的研究內容主要有兩個方面：即結構蛋白質組學和功 能蛋白質組學。 結構蛋白質組學主要是蛋白質表達模式的研究， 包括蛋白質氨基酸序列分析 及空間結構的解析、種類分析及數量確定。功能蛋白質組學主要是蛋白質功能模式的研究， 包括蛋白質的功能及蛋白質間的相互作用。 蛋白質組的研究不僅能為生命活動規律提供物質 基礎，也能為多種疾病機制的闡明及攻克，提供理論根據和解決途徑。2.3線粒體蛋白質組的分析對蛋白質組組成的分析鑒定是蛋白質組學中與基因組學相對應的主要內容。目前線粒體蛋白質組的分析工作主要有:(1)通過雙向電泳等技術得到正常生理 條件下的

6、蛋白質的圖譜，建立相應的數據庫。(2)比較病理組織細胞蛋白質組發生的變化，如蛋白質表達量的變化,翻譯后修飾的類型和程度,或者可能的條件下分析蛋白質在亞細胞水 平上定位的改變等。2.4線粒體蛋白質組研究技術線粒體蛋白質組研究常用的技術有：(1)用于蛋白質相互作用及作用方式研究的雙雜交系統。 （2）用于蛋白質分離技術方面的，如雙向凝膠電泳及HPLC等。（3）用于蛋白質鑒定的技術，如質譜技術、凝膠圖像分析、蛋白質和多肽的N端、C端測序及氨基酸組成分析等。（4）用于分析大量數據的生物工程信息學。線粒體蛋白質組與其他蛋白質組研究面臨同樣的難題：低豐度、小分子量蛋白質及疏水性蛋白質難以鑒定。3線粒體蛋白質

7、組學研究狀況3.1線粒體蛋白質組圖譜的構建通過不同的技術得到正常生理條件下的蛋白質的圖譜，建立 相應的數據庫。Rabilloud等1從健康人的胎盤組織中，分離提取線粒體進行蛋白質組研 究，并建立正常人線粒體蛋白質組圖譜。 以此為參考圖， 發現了遺傳性或獲得性線粒體功能 障礙時線粒體蛋白質譜的變化情況。他們使用了IPG（pH4.08.0）雙相電泳技術，共獲得1500個蛋白點。通過基質輔助激光解析離子化-飛行時間質譜-肽質指紋技術 （MALDI-TOF-PMF）只鑒定出46種線粒體蛋白。Taylor等2分離從心肌中純化的線粒體復合體，共鑒定出615種功能不同的蛋白質。 其中90%以上的蛋白質定位于

8、線粒體內膜，與氧化還原功能有關，19%為未知蛋白質。Fountoulakis等3從大鼠的肝臟中分離線粒體，并分別利用寬范圍和窄范 圍pH梯度IPG對線粒體蛋白質進行雙相電泳，通過MALDI-MS鑒定出192個基因產物。大約70%的基因產物是具有廣譜催化能力的酶，其中8個基因產物首次被檢測到， 并且由一個點構成， 而大多數蛋白質都是由多個點構成，平均1015個點對應于一個基因產物。Mootha等4從小鼠大腦、心臟、腎臟、肝臟中分離提取線粒體蛋白質，進行線粒體蛋白質組研591個線粒體蛋白質， 其中新發現了163個蛋白質與700和1150種蛋白質，從目前的統計看，酵母線粒36%，可以通過與酵母線粒體

9、蛋白質序列同源性比較，5。Sickmann等采用多種方法分離純化酵母線粒體蛋白，利用質譜技術鑒定出包括三羧酸循環、氧化磷酸化及線粒體編碼的蛋白質共750種。Washburn等利用多維色譜、質譜和sE-QUEST（數據分析程序）算法，分析酵母蛋白質組；這種多維蛋白質鑒定技術（MudPIT技術）鑒定出1484種酵母蛋白，包括低豐度蛋白（如 轉錄因子和蛋白激酶）和131種預測含有跨膜結構域的膜整合蛋白。3.2線粒體蛋白質復合物的研究線粒體內膜上嵌有很多蛋白質復合物，對于線粒體的功能具 有重要作用，應用常規的雙相電泳很難將這些蛋白質復合物完整地分離出來。Devreese等6采用Blue nativep

10、olyacrylamidegelelectrophoresis（BN-PAGE分離線粒體內膜上的五個氧化磷 酸化復合物，結合肽質量指紋圖譜，成功地鑒定出氧化磷酸化復合物中60%的已知蛋白質。BN-PAGE在分離蛋白質復合物時可以保持它們的完整性，因此這項技術可以用于研究在不同的生理病理狀態下蛋白質復合物的變化及臨床診斷等7。3.3線粒體亞組分的研究線粒體對維持細胞的體內平衡起著關鍵作用， 因此加速了人們對線 粒體亞組分的研究。線粒體內膜不僅包含有呼吸鏈復合物， 它還包含多種離子通道和轉運蛋 白，對線粒體發揮正常的功能起著重要作用。Cruz等8專注于線粒體內膜蛋白質的研究，他們通過二維液相色譜串

11、聯質譜技術鑒定出182個蛋白質，pI3.912.5，MW6000527000， 這些蛋白與許多生化過程相關， 比如電子傳遞、蛋白質運輸、 蛋白質合成、 脂類代謝和離子 運輸。3.4線粒體蛋白質組數據庫線粒體蛋白質數據庫MITOP是一個綜合性的有關線粒體編碼和核編碼的線粒體蛋白質的遺傳和功能信息以及它們的基因的數據庫。其中收錄了1150種線粒體相關的基因和對應的蛋白質，人們可依據基因、蛋白質、同源性、通道與代謝、人類疾病 分類查詢相關的信息9。MitoP2數據庫中主要為核編碼的線粒體蛋白質組的數據，它將 不同來源的線粒體蛋白質的信息整合在一起，人們可以根據不同的參數進行查詢。MitoP2數據庫既

12、包括最新的數據也包括最初的MITOP數據庫中的數據。目前數據庫中主要為酵母 和人的線粒體蛋白究。他們參照已有的基因信息共鑒定出 線粒體有關。酵母和人類線粒體各有約 體蛋白與人類線粒體蛋白的同源性高于 初步推測人類線粒體蛋白質的功能作用質組的數據， 以后還將收錄小鼠、 線蟲等的數據。 數據庫旨在為人們提供 線粒體蛋白質的綜合性數據10 。SWISS-PRO數據庫包含269種人類線粒體蛋白質，其中 與人類疾病相關的蛋白質有225種。數據庫中有相當一部分蛋白質沒有明確的定位和功能信 息的描述。 隨著線粒體研究熱潮到來和蛋白質組學技術的發展， 將有更多的數據被填充到數 據庫中。4線粒體蛋白質組研究中常見的影響因素4.1線粒體