1、 T-SPOT.TB診斷結核感染 臨床應用進展主要內容n結核病及其診斷現狀nT-SPOT.TB的原理及其特點nT-SPOT.TB技術的應用2主要內容n結核病及其診斷現狀nT-SPOT.TB的原理及其特點nT-SPOT.TB技術的應用3結核的現狀結核的現狀 結核病是全球嚴重的公共衛生問題之一。據結核病是全球嚴重的公共衛生問題之一。據WHO統計，全球約有統計，全球約有20億人感染結核分枝桿菌，每年有約億人感染結核分枝桿菌，每年有約200萬人死于結核。萬人死于結核。 我國是世界上我國是世界上22個結核病高負擔國家之一，結核個結核病高負擔國家之一，結核感染導致的死亡人數是其他傳染性疾病總死亡人數的感染

2、導致的死亡人數是其他傳染性疾病總死亡人數的2倍以上。倍以上。4中國是結核感染高負擔國家n患者人數占全球的14.3%，具體表現為“五多”n感染人數多5.5億人感染過結核n患病人數多現有活動性肺結核患者500萬n潛伏感染人數多受限于檢測條件較難統計，2009年流行病調查結果為總人口的44.5%（因采用PPD檢測，假陽性較多）n新發患者多僅活動性肺結核2009年新發病患107萬n死亡人數多13萬/年5結核的傳統診斷手段結核的傳統診斷手段u結核菌素皮試：結核菌素皮試：低敏感性：低敏感性：免疫力低下人群中其敏感性大大降低。低特異性：低特異性：與卡介苗接種和其他環境分枝桿菌有交叉，易造成“假陽性”結果。u

3、免疫學診斷 抗原、抗體（膠體金）u細菌學檢查：細菌學檢查：常規培養：2月；快速培養：1周； 涂片陽性率取決于采集標本中細菌數量，不利于早期診斷。u病理學檢查：病理學檢查：陽性率低，對取材有較高要求，有創傷，對肉芽腫性病變需進一步鑒別。u分子生物學診斷 PCRu影像學檢查6 免疫學診斷PPD皮膚試驗 抗體檢測 假陽性率高 48-72h讀取結果 敏感性、特異性差 7WHO關于血清學檢測聲明n2011年7月20日，世界衛生組織（WHO）正式聲明，要求禁止將血清學檢測方法（抗原，抗體，蛋白芯片等）用于肺結核和肺外結核的診斷。WHO warns against the use of inaccurate

4、 commercial serological tests for pulmonary and extra-pulmonary TB. A substandard test with unreliable results TB can be wrongly diagnosed A serological test for diagnosing active TB disease is bad practice Problems of misdiagnosis The inaccurate serological tests are costly Selling substandard test

5、s with unreliable results8 細菌學診斷抗酸染色涂片 分枝桿菌培養 陽性率低 含菌量1萬/mL痰液 需時4-6周 9快速培養系統1. BD BACTEC MGIT 960培培養系統養系統 2. BacT ALERT 3D培養系統培養系統 10分子生物學診斷實時熒光定量PCR技術：HRM 線性探針耐多藥檢測技術：HAIN技術 基因芯片 PCR 電離質譜檢測技術 11病理學檢查病理學檢查n陽性率低n對取材有較高要求，有創傷n對肉芽腫性病變需進一步鑒別12影像學檢查n目前診斷活動性肺結核的重要手段，尤其是粟粒性肺結核n對潛伏性結核診斷價值不大n對肺外結核診斷價值不大13現有檢

6、測手段不能滿足臨床要求n假陰性：免疫力低下或HIV人群，新生兒、老弱人群，藥物影響；n假陽性：BCG接種人群，其它分支桿菌感染，交叉污染n肺外的結核感染無法明確診斷n抗癆治療療效無法評價n無法排篩結核感染，造成生物制劑或移植手術治療后病患免疫力下降，引發結核，形成醫療事故14主要內容n結核病及其診斷現狀nT-SPOT.TB的原理及其特點nT-SPOT.TB技術的應用1521世紀結核檢測的重大突破n -干擾素釋放實驗（IGRAs)被商化（2006年），用于結核感染的檢測n將結核菌特異性抗原加入含受試者的血液標本的培養基中進行孵化，如果受試者受到過MTB感染，那么被結核菌激活的記憶T細胞就會對這些

7、特異性抗原產生反應，發生增殖分化并釋放-干擾素n通過定量檢測-干擾素的釋放水平，來診斷MTB感染nT-SPOT.TB(結核感染T細胞斑點試驗)16干擾素檢測陰性干擾素檢測陽性TB抗原多肽T細胞活化T細胞 干擾素17基于基于T淋巴細胞檢測結核感染的原理淋巴細胞檢測結核感染的原理n結核感染的免疫應答反應以結核感染的免疫應答反應以細胞免疫細胞免疫為主，結核感染為主，結核感染后體內長期存在后體內長期存在抗原特異性的記憶性抗原特異性的記憶性T細胞細胞n當再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增殖，釋放當再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增殖，釋放r r干擾干擾素素nr r干擾素干擾素是結核分枝桿菌感染后機體免疫應答

8、中最重要是結核分枝桿菌感染后機體免疫應答中最重要的細胞因子的細胞因子18基于基于T淋巴細胞檢測結核感染的原理淋巴細胞檢測結核感染的原理T-SPOT.TB技術：技術：n利用結核桿菌感染者外周血單核細胞（利用結核桿菌感染者外周血單核細胞（PBMC）中存）中存在結核特異性在結核特異性T T細胞細胞，這些淋巴細胞在受到結核特異抗這些淋巴細胞在受到結核特異抗原刺激后分泌原刺激后分泌r r干擾素而設計的干擾素而設計的T T細胞細胞免疫斑點試驗免疫斑點試驗。n檢測外周血中受結核特異抗原刺激釋放檢測外周血中受結核特異抗原刺激釋放r r干擾素的干擾素的T T淋淋巴細胞，經巴細胞，經酶聯免疫顯色酶聯免疫顯色后，通

9、過后，通過ELISPOTELISPOT分析系統分析系統 對斑點進行計數，對斑點進行計數，1 1個斑點代表一個細胞，計算出抗原個斑點代表一個細胞，計算出抗原特異性細胞的頻率。特異性細胞的頻率。19基于基于T淋巴細胞檢測結核感染的原理淋巴細胞檢測結核感染的原理包包20基于基于T淋巴細胞檢測結核感染的原理淋巴細胞檢測結核感染的原理患者體內存在針對MTB的效應T淋巴細胞患者體內不含針對MTB的效應T淋巴細胞21T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義nT-SPOT.TB高靈敏度高靈敏度 22T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義種類種類內容摘要內容摘要受試者數受試者數量量文獻發表文獻發表活動性結核活動性

10、結核/ /靈靈敏度敏度將將T-SPOT.TB的檢測結果與最后通過涂片和培養確診的結果進的檢測結果與最后通過涂片和培養確診的結果進行比較。包括牛型結核桿菌和非洲型結核桿菌感染的患者。行比較。包括牛型結核桿菌和非洲型結核桿菌感染的患者。T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為97.2%。（。（CI 90.3-99.7%）72Meier et al Eur J Microbiol Infect Dis(2005)；24: 529-536在經培養確診的活動性結核受試者中，在經培養確診的活動性結核受試者中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為96.6%。其中。其中29例免疫力低下患者，例免疫力低下患者，

11、T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為100%87Lee et al. ERJ 2006; 28:2430在確診病例（涂片或培養陽性）和臨床診斷病例（有臨床癥狀在確診病例（涂片或培養陽性）和臨床診斷病例（有臨床癥狀和抗癆治療有效）中，和抗癆治療有效）中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為90.3%，并且不，并且不受受CD4細胞數量影響。細胞數量影響。30Clark et al. Clin. Exp. Imm.2007; 150(2):238-44在經痰培養或肺部病變組織病理活檢確診的結核患者中，在經痰培養或肺部病變組織病理活檢確診的結核患者中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為92%。

12、140Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65在確診的肺結核患者和疑似肺外結核患者中，在確診的肺結核患者和疑似肺外結核患者中，T-SPOT.TB的陽的陽性率性率94%。32Kim et al. Arch Intern Med.2007; 167;20:2255-2259在免疫力正常和免疫力低下的受試人群中，在免疫力正常和免疫力低下的受試人群中，T-SPOT.TB的靈敏的靈敏度分別為度分別為94%和和95%。所有受試者中，所有受試者中，42%為肺外結核患者。為肺外結核患者。186Kim et al. Am J Med 2009；122, 189-195經培

13、養確診、抗癆治療不超過經培養確診、抗癆治療不超過2 2周的結核患者用周的結核患者用T-SPOT.TB檢檢測，陽性率測，陽性率98%（57/58）。）。58Janssens et al ERJ 2007；30(4):722-8在經培養確診的活動性結核患者中，在經培養確診的活動性結核患者中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為94%。32Dominguez et al Clin VaccImmunol 2008; 15;168-71在經培養確診的活動性結核患者中，在經培養確診的活動性結核患者中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為94.1%。270Chee et al J Clin Micro

14、biol.2008; 46(6):1935-4023T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義nT-SPOT.TB高特異性高特異性 ESAT-6CFP 10均來自結核分枝桿菌基因組均來自結核分枝桿菌基因組RD1區區域域 僅結核分枝桿菌復合群（人型、牛型、非洲型）存在僅結核分枝桿菌復合群（人型、牛型、非洲型）存在 RD1區區基因基因 卡介苗和大多數環境分枝桿菌缺失卡介苗和大多數環境分枝桿菌缺失RD1區區基因基因（M.gordonaeM.gordonae、M.kansasiiM.kansasii、M.marinumM.marinum、M.szulgaiM.szulgai） T-SPOT.TB不會受卡介

15、苗接種及其他分枝桿菌的影響不會受卡介苗接種及其他分枝桿菌的影響 24T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義種類種類內容摘要內容摘要受試者數受試者數量量文獻發表文獻發表特異性特異性用用T-SPOT.TB檢測檢測14例鳥分枝桿菌感染者，例鳥分枝桿菌感染者，13例陰性，例陰性，1例為例為臨界值，復查也為陰性。臨界值，復查也為陰性。14Adams et al Sc. J Inf. Dis.2008;40(3):196-203.經過結核篩查的無癥狀的受試者，經過結核篩查的無癥狀的受試者，T-SPOT.TB檢測結果全部為檢測結果全部為陰性，特異性陰性，特異性100%。47Clark et al. Clin

16、. Exp. Imm.2007; 150(2):238-44在德國用在德國用T-SPOT.TB對健康的衛生保健工作者進行篩查。僅對健康的衛生保健工作者進行篩查。僅1例陽性例陽性（1/95） ，為影像學工作者，接觸病人超過，為影像學工作者，接觸病人超過35年。年。 TST檢測假陽性結果檢測假陽性結果34% （32/95）。）。 95Barsegian et al. J of Hospital Inf 2008；69(1):69-76在接觸結核的健康醫務工作者和健康對照受試者中用在接觸結核的健康醫務工作者和健康對照受試者中用TST和和T-SPOT.TB檢測。檢測。155健康醫務工作者中，健康醫務工

17、作者中，TST陽性的陽性的27例，而例，而T-SPOT.TB僅僅3例陽性。健康對照組例陽性。健康對照組T-SPOT.TB全部陰性而全部陰性而TST有有3例陽性。例陽性。 218 Storla et al. BMC Infectious Diseases 2009,9:60 25T-SPOT.TB 的高特異性與靈敏度，給臨床準確、快速的診斷結果 特異性美國FDA臨床研究數據：特異性97.1%(297/306)國內臨床研究數據：特異性94.1%(478/508) 靈敏度美國FDA臨床研究數據：靈敏度95.6%(175/183)國內臨床研究數據：靈敏度95.3%(624/655)26T-SPOT.T

18、B的臨床意義的臨床意義n基于結核抗原特異性基于結核抗原特異性T細胞向病變部位集細胞向病變部位集中的特點，中的特點， T-SPOT.TB的檢測物已不局的檢測物已不局限于靜脈血，支氣管肺泡灌洗液、痰液、限于靜脈血，支氣管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、腦脊液等也可用于對肺內及肺外胸腹水、腦脊液等也可用于對肺內及肺外結核的診斷。結核的診斷。n敏感性優于敏感性優于ADA、TB-DNA，約在，約在62-75%，特異性無統計學差異。，特異性無統計學差異。27T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義n在結核病治療中的評價意義在結核病治療中的評價意義n效應效應T細胞隨結核桿菌的清除而消失，其陰細胞隨結核桿菌的清除而消

19、失，其陰性及陽性結果可作為評估治療效果的手段之性及陽性結果可作為評估治療效果的手段之一一 。 28T-SPOT.TB的缺點的缺點n仍有一定的假陽性及假陰性結果n實驗結果是對結核感染的判斷，陽性結果包括了活動性結核及潛伏性結核感染的可能，需要結合臨床來確診是否是結核病患者n不能夠提示臨床患者的病變部位，需要結合臨床來判斷29主要內容n結核病及其診斷現狀nT-SPOT.TB的原理及其特點nT-SPOT.TB技術的應用30病例1患者，男，35歲 患者于一月前開始無誘因下出現高熱、胸悶，動則氣急，無咳嗽，咯血，盜汗 。 胸片：兩肺（），右側胸腔積液，心包積液 心超：心包積液 心包穿刺：血性 診斷：腫瘤

20、？結核？細菌感染？ 31檢測結果外周血T-SPOT.TB：陽性 心包積液T-SPOT.TB：陽性 診斷：結核性心包炎 治療： INH、RFP、PZA、EMB、強的松 體會：診斷快速 心包積液結核培養 6周后報陽 32病例2患者，女性，60歲，浙江溫州人 主訴：反復發熱2月余，頭痛2周伴意識障礙2天 外院頭顱MRI見腦實質內彌漫性點狀、結節狀及環形病灶。 有皮肌炎史，外院予激素治療 33腰穿壓力250mmH2O，有核細胞420 x106/L，糖0.6mmol/L，蛋白1688mg/L，氯化物136mmol/L 隱球菌乳膠凝集試驗：陰性 34治療：抗細菌+抗結核美羅培南、利奈唑胺、異煙肼、利福平、

21、吡嗪酰胺、乙胺丁醇治療，同時予甘露醇250ml q8h及地塞米松每天7.5mg。 2天后患者體溫即平，意識障礙好轉 腦脊液T-SPOT.TB：陽性 診斷：傾向結核性腦膜腦炎 35五聯抗結核給予HRZE及左氧五聯抗結核 2周后，CSF分枝桿菌快速培養：陽性 3個月后： 36病例3女性，14歲，初中學生主訴：發熱1月余 患者5月初無明顯誘因下出現發熱，Tmax：39，以午后為著。伴頭暈、畏寒、盜汗，不伴寒戰、咳嗽、咳痰、四肢肌肉痛、皮疹等，家人自行予退燒藥（具體藥物不詳），體溫可恢復正常，但午后體溫仍反復 2013-05-24患者就診，查血常規示：WBC: 4.7x109/L， N:43.2% 。查尿常規示：WBC:8-10個/HP，Pro(+)。考慮為尿路感染，予頭孢丙烯等抗感染治療，但仍出現反復發熱，病程中，患者無尿頻、尿急、尿痛、腹脹、腹痛、腰痛等不適 2013-06-01予希刻勞0.5g及羅氏芬2.5g對癥治療后體溫有所好轉，但停藥后體溫仍上升 2013-06-09查肺CT示：左肺上葉炎性病變。增強CT示：左肺上葉