1、切割配合物的合成第一頁，共16頁。實驗目的實驗目的u了解化學核酸酶了解化學核酸酶u了解斷裂了解斷裂DNA的途徑的途徑 u掌握水平式瓊脂糖凝膠電泳的使用方法掌握水平式瓊脂糖凝膠電泳的使用方法 第二頁，共16頁。化學核酸酶化學核酸酶uSigma把生理條件下借助于氧化或光活化產生活性氧中間產物導把生理條件下借助于氧化或光活化產生活性氧中間產物導致核酸骨架斷裂，即顯示出與天然核酸酶相同或類似生物活性的過致核酸骨架斷裂，即顯示出與天然核酸酶相同或類似生物活性的過渡金屬配合物及其載體衍生物稱為化學核酸酶。渡金屬配合物及其載體衍生物稱為化學核酸酶。u化學核酸酶既有限制性內切酶的高度專一性，又能在人化學核酸酶

2、既有限制性內切酶的高度專一性，又能在人們預先設計的任何位點斷裂們預先設計的任何位點斷裂DNA，而且克服了傳統的限制性內，而且克服了傳統的限制性內切酶識別位點僅為切酶識別位點僅為48個核苷酸的限制，還具有分子小、結構簡個核苷酸的限制，還具有分子小、結構簡單、易于提純、成本低等優點。單、易于提純、成本低等優點。u可用于基因分離、染色體圖譜分析、大片段基因的序列分可用于基因分離、染色體圖譜分析、大片段基因的序列分析以及析以及DNA定位誘變、腫瘤基因治療與新的化學療法等領域定位誘變、腫瘤基因治療與新的化學療法等領域。第三頁，共16頁。DNA斷裂的途徑斷裂的途徑u水解斷裂水解斷裂DNA。僅影響磷酸二酯鍵

3、，不造成堿基和核糖。僅影響磷酸二酯鍵，不造成堿基和核糖環損傷。環損傷。 u氧化斷裂氧化斷裂DNA。以氧化作用攻擊。以氧化作用攻擊DNA的核糖環及堿基，的核糖環及堿基，產生各種氧化物，可以直接引起產生各種氧化物，可以直接引起DNA的單鏈或雙鏈發生斷裂的單鏈或雙鏈發生斷裂。 u光斷裂光斷裂DNA。化合物通過光反應產生多種氧化性的自由。化合物通過光反應產生多種氧化性的自由基，如超氧陰離子（基，如超氧陰離子（O2 ），超氧自由基（），超氧自由基（OOH ）或羥）或羥基自由基（基自由基（OH ）等。這些物質都能夠氧化）等。這些物質都能夠氧化DNA的鳥嘌的鳥嘌呤堿基，從而使呤堿基，從而使DNA發生斷裂。發

4、生斷裂。 第四頁，共16頁。水平式瓊脂糖凝膠電泳水平式瓊脂糖凝膠電泳 第五頁，共16頁。瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 天然瓊脂（天然瓊脂（Agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（Agarose ，約占，約占80）及瓊脂膠（）及瓊脂膠（Agaropectin）組成。瓊）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷。而脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現象，加之硫酸帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現象，

5、加之硫酸根可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖根可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖透明無紫外吸收，透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳。進行平板電泳。第六頁，共16頁。uDNA在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。u核酸為兩性分子，在核酸為兩性分子，在pH3.5時，整個分子帶正電；時，整個分子帶正電；pH8左右左右時，堿基幾乎不解離，整個分子帶負電。時，堿基幾乎不解離，整個分子帶負電。 u可進行分離。可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質量的對數值分子的

6、遷移速度與相對分子質量的對數值成反比關系，可以近似用于估算分子的大小。成反比關系，可以近似用于估算分子的大小。u可以分離相對分子質量相同，但構型不同的可以分離相對分子質量相同，但構型不同的DNA分子。分子。u共價閉環超螺旋共價閉環超螺旋DNA（ccDNA）直線）直線DNA（LDNA，2條條鏈發生斷裂）開環的雙鏈環狀鏈發生斷裂）開環的雙鏈環狀DNA（ocDNA，1條鏈發生條鏈發生斷裂）。斷裂）。電泳實驗原理電泳實驗原理第七頁，共16頁。溴化乙錠溴化乙錠 (Ethidium Bromide, EB)uEB能插入能插入DNA分子堿基對之間，分子堿基對之間，導致導致EB與與DNA結合。結合。DNA吸收

7、的吸收的260nm的紫外光的紫外光傳遞給傳遞給EB，或者結合的，或者結合的EB本身在本身在300和和360吸收的射線，均可在可見光區以吸收的射線，均可在可見光區以590波長波長發射出來，呈橙紅色。發射出來，呈橙紅色。uEB染料優點：染色操作簡便，快速，室溫下染料優點：染色操作簡便，快速，室溫下15-20min；不會；不會使核酸斷裂；靈敏度高，使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的或更少的DNA即可檢出；可以加即可檢出；可以加到樣品中可膠中。到樣品中可膠中。uEB是誘變劑，使用時一定要戴手套。是誘變劑，使用時一定要戴手套。 EB廢液要經過處理廢液要經過處理才能丟棄。才能丟棄。第八頁，共16頁。實

8、驗內容實驗內容u Cu(phen)2(H2O)(ClO4)2的制備的制備u 銅配合物氧化斷裂銅配合物氧化斷裂 DNAu 瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖凝膠的制備 u DNA氧化斷裂的檢測氧化斷裂的檢測第九頁，共16頁。實驗試劑實驗試劑 u質粒質粒pBR322 DNAuCu(phen)2(H2O)(ClO4)2u Tris 緩沖液緩沖液1000 mL：稱：稱Tris 6.057 g (50 mM), NaCl 1.052 g (18mM), 再用鹽酸調節酸度到再用鹽酸調節酸度到pH = 7.2。u溴酚藍指示劑點樣緩沖液：溴酚藍指示劑點樣緩沖液： 10 mL（甘油（甘油5 mL, Tris2緩沖溶液緩沖溶

9、液5mL，溴酚蘭，溴酚蘭 0.0251 g，EDTA 0.186 g，pH8；2）u1 g/ml溴化乙錠溶液溴化乙錠溶液 (瓊脂糖凝膠染色用瓊脂糖凝膠染色用)u電泳緩沖液（電泳緩沖液（TAE）：）：40mmol/L Tris-乙酸，乙酸，1 mol/L EDTA (配制方配制方法：法：24.2克克Tris堿，堿，5.71ml冰乙酸，冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定，定容至容至5000ml）u0.8% 瓊脂糖凝膠（配制方法：稱取瓊脂糖瓊脂糖凝膠（配制方法：稱取瓊脂糖0.4克，加入克，加入50ml TAE電泳緩沖液）。電泳緩沖液）。 第十頁，共16頁。實驗儀器實驗儀器

10、 u電磁攪拌器電磁攪拌器u恒溫水浴鍋恒溫水浴鍋u微量移液器微量移液器u電泳儀電泳儀u水平電泳槽水平電泳槽u透射紫外觀察儀透射紫外觀察儀 第十一頁，共16頁。實驗內容一：銅配合物制備實驗內容一：銅配合物制備將將Cu(ClO4)2.6H2O (270 mg, 1.0 mmol) 和和1,10-鄰菲咯啉鄰菲咯啉 (phen) (360 mg, 2.0 mmol) 加入加入15 ml甲醇中甲醇中, 25 oC下電磁攪下電磁攪拌半小時拌半小時, 產生的綠色沉淀經減壓抽濾并用少量的冷甲醇淋產生的綠色沉淀經減壓抽濾并用少量的冷甲醇淋洗后洗后, 再用再用P2O5真空干燥真空干燥. (參見文獻：參見文獻：G.

11、Murphy, C. Murphy, B. Murphy, B. Hathaway, J.Chem. Soc., Dalton Trans., 1997, 2653)第十二頁，共16頁。實驗內容二：銅配合物氧化斷裂實驗內容二：銅配合物氧化斷裂DNA首先用首先用Tris緩沖液配置緩沖液配置Cu(phen)2(H2O)(ClO4)2溶液（溶液（200 M，為使樣品溶解，可加入不超過總體積，為使樣品溶解，可加入不超過總體積10%的的DMF）和抗壞血酸溶液和抗壞血酸溶液(0.1 mM）。在排列固定好的樣品管里，依）。在排列固定好的樣品管里，依次用微量取液器加入次用微量取液器加入1 L 稀釋稀釋5倍的倍

12、的pBR322 DNA原液、原液、Cu(phen)2(H2O)(ClO4)2 (5 L）和抗壞血酸）和抗壞血酸 (1 L），再用），再用Tris緩沖液把所有樣品都補到緩沖液把所有樣品都補到10 L（另外要有一個（另外要有一個DNA的空白）。的空白）。37 oC下溫育下溫育1小時后，每個樣品管里加點樣液小時后，每個樣品管里加點樣液2 L，上樣，進行瓊脂糖凝膠電泳。，上樣，進行瓊脂糖凝膠電泳。 第十三頁，共16頁。實驗內容三：瓊脂糖凝膠的制備實驗內容三：瓊脂糖凝膠的制備u選擇合適的水平式電泳槽，調節電泳槽平面至水平。檢查穩壓電源與選擇合適的水平式電泳槽，調節電泳槽平面至水平。檢查穩壓電源與正負極的

13、線路。正負極的線路。u選擇孔徑大小合適的點樣梳子，垂直架在電泳膠模的一端，使點樣梳子底選擇孔徑大小合適的點樣梳子，垂直架在電泳膠模的一端，使點樣梳子底部離電泳膠模底部的距離為部離電泳膠模底部的距離為1.0mm。u制備制備1%瓊脂糖凝膠，瓊脂糖凝膠，100水浴加熱至瓊脂糖融化均勻。水浴加熱至瓊脂糖融化均勻。 u用吸管取少量瓊脂糖凝膠溶液將電泳膠模四周密封好，防止澆灌瓊脂糖凝膠板時發用吸管取少量瓊脂糖凝膠溶液將電泳膠模四周密封好，防止澆灌瓊脂糖凝膠板時發生滲透。待瓊脂糖凝膠冷卻至生滲透。待瓊脂糖凝膠冷卻至60左右時，加入一滴溴化乙錠，搖勻，輕輕倒左右時，加入一滴溴化乙錠，搖勻，輕輕倒入電泳膠模中，

14、瓊脂糖凝膠的厚度在入電泳膠模中，瓊脂糖凝膠的厚度在35mm。倒膠時要避免產生氣泡，若。倒膠時要避免產生氣泡，若有氣泡可用吸管小心吸去。有氣泡可用吸管小心吸去。u瓊脂糖凝膠凝固后，在室溫放置瓊脂糖凝膠凝固后，在室溫放置20分鐘，小心拔掉點樣梳子和電泳膠模分鐘，小心拔掉點樣梳子和電泳膠模兩端的擋板，保持點樣孔的完好。兩端的擋板，保持點樣孔的完好。u將電泳膠模放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，使電泳緩沖液面高出瓊脂糖凝膠表面將電泳膠模放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，使電泳緩沖液面高出瓊脂糖凝膠表面12mm。如點樣孔內有氣泡，用吸管小心吸出，以免影響加樣。如點樣孔內有氣泡，用吸管小心吸出，以免影響加樣。第十

15、四頁，共16頁。實驗內容四：實驗內容四：DNA氧化斷裂的檢測氧化斷裂的檢測u將實驗二得到的反應液樣品與將實驗二得到的反應液樣品與1/5體積的溴酚藍指示劑點樣緩沖液體積的溴酚藍指示劑點樣緩沖液混合。上樣緩沖液不僅可以提高樣品的密度，使樣品均勻沉到樣品混合。上樣緩沖液不僅可以提高樣品的密度，使樣品均勻沉到樣品孔內，還可以使樣品帶顏色，便于上樣和估計電泳時間和判斷電泳孔內，還可以使樣品帶顏色，便于上樣和估計電泳時間和判斷電泳的位置。的位置。u用微量移液器將樣品小心加入加樣孔內，記錄樣品點樣秩序。用微量移液器將樣品小心加入加樣孔內，記錄樣品點樣秩序。 u蓋上電泳槽，開啟電源開關，最高電壓不超過蓋上電泳

16、槽，開啟電源開關，最高電壓不超過5V/cm（100150V恒壓電泳），使恒壓電泳），使DNA從負極向正極移動。從電泳槽中取出凝膠，將從負極向正極移動。從電泳槽中取出凝膠，將凝膠置于凝膠置于1 ug/ml溴化乙錠水溶液中，室溫下振搖染色溴化乙錠水溶液中，室溫下振搖染色3045分鐘。回收染分鐘。回收染色液，自來水沖洗凝膠后，于紫外燈下觀察。色液，自來水沖洗凝膠后，于紫外燈下觀察。u電泳時間隨實驗的具體要求而異。電泳一般需電泳時間隨實驗的具體要求而異。電泳一般需13小時。電泳完畢小時。電泳完畢后關閉電源，戴一次性塑料手套取出凝膠，盡可能將所有的電泳緩沖液后關閉電源，戴一次性塑料手套取出凝膠，盡可能將

17、所有的電泳緩沖液淋干，在淋干，在254nm波長的透射紫外燈下觀察。波長的透射紫外燈下觀察。 第十五頁，共16頁。參考文獻參考文獻 uSigman D. S., Mazumder A. Perrrin D. M. Chem. Rev. 1993, 93, 2295uSigman D. S., Acc. Chem. Res., 1986, 19, 180.uDetmer III C. A., Pamatong F. V., Bocarsly J. R., Inorg. Chem., 1996, 35, 6292.u劉長林，周井炎，徐輝碧，劉長林，周井炎，徐輝碧，無機化學學報無機化學學報，1998，3，253.uSteenken S., Jovanovic