1、菌種保存大家談。甘油的濃度2009-08-1501:13大家好！我是保藏中心，最近發(fā)現(xiàn)基因酷保藏中心的共享菌株的保存出現(xiàn)了較嚴(yán)重的問(wèn)題，06年07年酷友共享的菌株很多都活化不了，好些酷友想要，保藏中心卻不能應(yīng)助，對(duì)此我們很抱歉！因此，在此向大家賜教，菌株應(yīng)如何保存呢？望大家能分享經(jīng)驗(yàn)，多提出建議（保藏中心如何保藏菌株和管理菌株為佳），一起努力搭建好這個(gè)平臺(tái)，讓它能幫到更多酷友！作者：保藏中心時(shí)間：09-2-1910:55有人說(shuō)，冷凍干燥保藏法是菌種保藏最有效的方法之一。因?yàn)闆](méi)有做過(guò)，所以請(qǐng)教做過(guò)這方面的酷友，大腸桿菌的冷凍保藏應(yīng)該注意的事項(xiàng)？甘油冷凍保藏及穿刺菌的保藏一般能保藏多久呢？作者：我

2、是好人時(shí)間：09-2-1921:34冷凍干燥法是國(guó)內(nèi)外一致認(rèn)為比較理想的菌種保藏方法。冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡(jiǎn)稱凍干法。它通常是用保護(hù)劑制備擬保藏菌種的細(xì)胞懸液或抱子懸液于安甑管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水開華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成無(wú)氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長(zhǎng)期保藏。常用的保護(hù)劑有脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質(zhì)。由于此法同時(shí)具備低溫、干燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長(zhǎng)，一般達(dá)515年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。除不產(chǎn)抱子的絲狀真菌不

3、宜用此法外，其他大多數(shù)微生物如病毒、細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等均可采用這種保藏方法。保藏菌種需用時(shí)，可在無(wú)菌環(huán)境下開啟安甑管，將無(wú)菌的培養(yǎng)基注入安甑管中，固體菌塊溶解后，搖勻復(fù)水，然后將其接種于適宜該菌種生長(zhǎng)的斜面上適溫培養(yǎng)即可。該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè)備。不適合酷友頻繁的求助菌種。我們實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，不管是細(xì)菌，放線菌還是霉菌和酵母，我們都是用的甘油管保藏。就是劃斜面得到單菌落，將單菌落置于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，在EP管中保存，菌液與甘油體積比為1:1,甘油要滅菌的。-20攝氏度保存即可。我們的菌種有保存七八年的依然能用。方便快捷。管理員不妨試試。作者：保藏中

4、心時(shí)間：09-2-2023:03終于有酷友理我了！感動(dòng)ing十分感謝您的指教！為了表達(dá)謝意，加兩點(diǎn)威望作者：保藏中心時(shí)間：09-2-2023:33如您所說(shuō)，冷凍干燥法該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè)備，不適合酷友頻繁的求助菌種。但考慮到一個(gè)菌株的傳代問(wèn)題，菌種傳代次數(shù)對(duì)菌株特性的影響？我有這樣的想法：每個(gè)菌種用冷凍干燥法保藏一些，也用甘油菌保藏（用于給酷友應(yīng)助，一兩年后再拿冷凍干燥法保藏的菌種活化，保新一批甘油菌、穿刺菌用于應(yīng)助（其實(shí)保藏中心一直都有保甘油菌，但06、07年的菌株還是有出現(xiàn)問(wèn)題）。這樣考慮怎樣呢？看了您介紹的冷凍真空干燥保藏法的操作，有不明白的地方：1、保護(hù)劑如

5、脫脂牛奶、淀粉、葡聚糖要如何處理滅菌呢？2、菌種在冷凍干燥機(jī)里冷凍干燥時(shí)會(huì)不會(huì)染菌，還是需要事先處理下冷凍干燥機(jī)？3、如何在真空條件下融封？因?yàn)闆](méi)有做過(guò)這方面的工作，很多不懂的，問(wèn)了不少，請(qǐng)諒解。還有，液氮冷凍保藏法和冷凍干燥法相比哪種方法較好，那種比較適合保藏中心？還是有其它方法更適合呢？大家多多提出寶貴意見(jiàn)、分享下經(jīng)驗(yàn)啦！作者：我是好人時(shí)間：09-2-2220:295#保藏中心作者：我是好人時(shí)間：09-2-2220:43液氮超低溫保藏法是目前比較理想的一種菌種保藏方法，已被國(guó)外一些菌種保藏機(jī)構(gòu)作為常規(guī)的方法應(yīng)用，美國(guó)的ATCCE于1965年開始用用，我國(guó)的菌種保藏中心也正積極的創(chuàng)造條件，準(zhǔn)

6、備或已采用此法。但投資費(fèi)用較大，并要有個(gè)可靠的氮源。作者：保藏中心時(shí)間：09-2-2409:50您好！您上傳的資料中介紹了好多種菌種保藏的方法，很受用，十分感謝您的幫助和支持！但我有一些疑問(wèn)想請(qǐng)教下：1/您上傳的PPT中講到“在作低溫保藏時(shí)，注意盡量不損傷細(xì)胞。在緩慢冷凍時(shí)，胞外基質(zhì)一般較快結(jié)冰而形成冰晶使基質(zhì)濃度增高，造成細(xì)胞水分外滲而大量脫水，可能使細(xì)胞死亡。如快速降溫，胞內(nèi)也很快形成冰晶，胞內(nèi)外滲透壓基本平衡，同時(shí)胞內(nèi)冰晶較小，對(duì)細(xì)胞及原生質(zhì)膜的損傷也較小，菌株不易死亡，影響也較小。，按這樣說(shuō)快速降溫對(duì)細(xì)胞的損傷較小，但這與細(xì)胞放入液氮罐前應(yīng)先進(jìn)行梯度降溫的做法似乎有矛盾。2/甘油菌甘油

7、終濃度為40%這個(gè)濃度是如何定的呢？因?yàn)楦视途哂忻撍饔茫瑵舛雀吡藭?huì)使菌株脫水死亡，有的人建議用終濃度為10%20的濃度，您是如何看待這個(gè)情況呢？作者：我是好人時(shí)間：09-2-2710：27管理員您好，很佩服您發(fā)現(xiàn)問(wèn)題的能力，嘿嘿，我這些資料都是在網(wǎng)上給您找的,我們實(shí)驗(yàn)室也沒(méi)有這種設(shè)備，我也沒(méi)做過(guò)，所以很多問(wèn)題也不是很清楚。我們保存菌種都是用的甘油保存，但也沒(méi)有注意到您說(shuō)的甘油具有脫水這個(gè)問(wèn)題，很是受用，以后我會(huì)注意的。我們用甘油保存過(guò)細(xì)菌，酵母，霉菌和放線菌，40%-50%的甘油是它的最終濃度。甘油濃度過(guò)低低溫保存易結(jié)冰，使菌死亡。我同學(xué)有直接將菌液-20保存的，不加任何保護(hù)劑，但保存的時(shí)間

8、很短，他們保存過(guò)一年的，但很多有死掉的。我們做大腸桿菌感受態(tài)，最終甘油是15%勺濃度，有時(shí)結(jié)冰也會(huì)使菌死掉。我用40%-50%勺甘油最終濃度一直很好，也不結(jié)冰，所以也沒(méi)考慮您提出的那個(gè)問(wèn)題，嘿嘿。對(duì)于液氮超低溫保藏我又查了本資料，它是把熔封的安甑管進(jìn)行慢速冷凍，以每份鐘下降1度的速度直至-35度，最后移到液氮中保藏。其他的就沒(méi)說(shuō)什么了。很不好意思啊。作者：保藏中心時(shí)間：09-2-2817:18不用不好意思！大家互相交流學(xué)習(xí)。我也是上網(wǎng)查了相關(guān)的資料，發(fā)現(xiàn)有些細(xì)節(jié)問(wèn)題說(shuō)法不一，自己經(jīng)驗(yàn)少，所以不懂的問(wèn)題要向大家請(qǐng)教！作者：wyat1984時(shí)間：09-3-502:40我們實(shí)驗(yàn)室都是用新鮮菌液+50

9、%C菌甘油1:1混勻，終濃度25%t油，-80度保存的。菌體可以多離心收集一點(diǎn)。凍干保存用的脫脂牛奶110度15分鐘滅菌。其實(shí)很多時(shí)候大家要的是質(zhì)粒而不是菌，一般的DH5,JM109類的大家都有。為什么不抽成質(zhì)粒保存呢？-80度基本不會(huì)降解。作者：保藏中心時(shí)間：09-3-510:13您好！感謝您的支持。“其實(shí)很多時(shí)候大家要的是質(zhì)粒而不是菌，一般的DH5JM10必類的大家都有。為什么不抽成質(zhì)粒保存呢？-80度基本不會(huì)降解。”保藏中心的質(zhì)粒都是抽提保存的，我想您有些誤解了，現(xiàn)出現(xiàn)的是菌株的保藏問(wèn)題而不是質(zhì)粒的保藏問(wèn)題，DH5,JM109類的菌株是很多人都有，但也還有其它不少的菌株較少的。作者：nf

10、u03200時(shí)間：09-3-1510：45我這里一般是需要用到質(zhì)粒的大腸桿菌用15%勺甘油1:1和菌液混合，酵母用的是30%勺甘油和菌液1:1混合，然后放在-80度冰箱中保存，效果很好作者：保藏中心時(shí)間：09-3-1618:43我這里一般是需要用到質(zhì)粒的大腸桿菌用15%勺甘油1:1和菌液混合，酵母用的是30%勺甘油和菌液1:1混合，然后放在-80度冰箱中保存，效果很好nfu03200發(fā)表于09-3-1510:45質(zhì)粒的大腸桿菌用15%勺甘油1:1和菌液混合，甘油的終濃度7.5%,感覺(jué)挺低的，請(qǐng)問(wèn)您那里-80度保存大概能保存多長(zhǎng)時(shí)間？作者：ferraricyn時(shí)間：09-3-2015:17本帖最

11、后由ferraricyn于09-3-2015:21編輯個(gè)人覺(jué)得脫脂牛奶凍干的方法保藏效果較好，我們的霉菌就是這么弄哦，看了一下，原來(lái)都是細(xì)菌保藏，那還是加甘油保護(hù)，液氮速凍，-70保藏吧,呵呵另外，有的凍干機(jī)是有封口功能的，凍干機(jī)也是在無(wú)菌室內(nèi)操作的，凍干后可以取出封口，同樣是無(wú)菌條件下操作的作者：yueyuetby時(shí)間：09-3-2117:37我們實(shí)驗(yàn)室的保存方式是，按3:1的比例加入菌液和甘油，一定要混勻，然后放在-70度冰箱中保存。作者：rcm001時(shí)間：09-3-2921:20本帖最后由rcm001于09-3-2921:23編輯您好！您上傳的資料中介紹了好多種菌種保藏的方法，很受用，十

12、分感謝您的幫助和支持！但我有一些疑問(wèn)想請(qǐng)教下：1/您上傳的PPT中講到“在作低溫保藏時(shí)，注意盡量不損傷細(xì)胞。在緩慢冷凍時(shí)，胞外基質(zhì)一般較快結(jié)冰而.保藏中心發(fā)表于09-2-2409:50不是啊！細(xì)菌保存最好要快速冷凍，我在PASTEUR博士后時(shí)他們的PROTOCOL都是用液氮先澆在有菌液+冷凍液的EP管上，凍好后放-80度冰箱，可以保存10年左右。冷凍液配方需再找找再給你，印象中不是簡(jiǎn)單的甘油溶液。動(dòng)物細(xì)胞當(dāng)然是要緩慢冷凍了。作者：rcm001時(shí)間：09-3-2921:43本帖最后由rcm001于09-3-2921:52編輯如您所說(shuō)，冷凍干燥法該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè)備，

13、不適合酷友頻繁的求助菌種。但考慮到一個(gè)菌株的傳代問(wèn)題，菌種傳代次數(shù)對(duì)菌株特性的影響？我有這樣的想法：每個(gè)菌種用冷凍干燥法保藏一些.保藏中心發(fā)表于09-2-2023:33凍干保護(hù)劑是先配成溶液，再用0.22um的濾膜過(guò)濾除菌，再按比例加到培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液；真正的凍干機(jī)操作當(dāng)然不會(huì)染菌了，進(jìn)去的空氣都是經(jīng)過(guò)濾的；真空封融菌種管是把凍好的菌種管口套在抽氣機(jī)上，抽至一定真空度，如6pa,在噴燈上封融。凍干曲線（溫度和真空度隨時(shí)間調(diào)整的曲線）也影響到存活率。作者：保藏中心時(shí)間：09-3-3010:35不是啊！細(xì)菌保存最好要快速冷凍，我在PASTEUR博士后時(shí)他們的PROTOCOL都是用液氮先澆在有

14、菌液+冷凍液的EP管上，凍好后放-80度冰箱，可以保存10年左右。冷凍液配方需再找找再給你，印象中不是簡(jiǎn)單的甘油溶液。.rcm001發(fā)表于09-3-2921:20非常感謝！期待作者：rcm001時(shí)間：09-3-3021:59冷凍液配方來(lái)了：-翻了半天，終于找到了，是HOGNES黔哈excellentforE.colipreservation10XHognessModifiedFreezingMedium:SolutionA:5mMMgSO4x4H2O,20mMSodiumCitrate,85mM(NH4)2SO4,45%Glycerin.SolutionB:0,66MKH2PO4,1,3MK2

15、HPO4Dilute"B"4Xwith"A"=10xHMFM(e.g.,1B+4A)例子：10xHMFM(HognessModifiedFreezingMedium)(Forfreezingofbacteria)SolutionAMgSO4.7H2O0.9gNa3-citrate.2H2O4.5g(NH4)2SO49gGlycerol(100%)440gThevolumewasadjustedto800mlwithsterilewaterandsterilizedbyautoclaving.SolutionBKH2PO418gK2HPO447gThevo

16、lumewasadjustedto200mlwithsterilewaterandsterilizedbyautoclaving.Beforeusing,640mlsolutionAwasaddedto160mlsolutionB.作者：保藏中心時(shí)間：09-3-3110:32冷凍液配方來(lái)了：-翻了半天，終于找到了，是HOGNES黔哈excellentforE.colipreservation10XHognessModifiedFreezingMedium:SolutionA:5mMMgSO4x4H2O,20mMSodiumCitrate,85mM（N.rcm001發(fā)表于09-3-3021:59

17、對(duì)于您的分享，代表需要它的人感謝您！需要的酷友大家來(lái)試試?yán)玻”２刂行臅?huì)嘗試看是否適合我們?yōu)楸硎靖兄x，給您加上兩點(diǎn)威望。作者：保藏中心時(shí)間：09-3-3110:47冷凍液配方來(lái)了：-翻了半天，終于找到了，是HOGNES黔哈excellentforE.colipreservation10XHognessModifiedFreezingMedium:SolutionA:5mMMgSO4x4H2O,20mMSodiumCitrate,85mM（N.rcm001發(fā)表于09-3-3021:59Glycerol是保護(hù)劑，Na3-citrate應(yīng)該是起到一個(gè)緩沖體系的作用吧？KH2PO4K2HPO4a兩個(gè)是不

18、是也是屬于緩沖體系的？其它的成分就猜不出了可是在這些成分里沒(méi)有看到有營(yíng)養(yǎng)成分，看過(guò)一些資料，他們的是有加血清、牛奶、培養(yǎng)基之類任一個(gè)成分的，沒(méi)營(yíng)養(yǎng)成分的話，可以保存十年左右么？您能不能給我們稍微介紹下這個(gè)配方的基本原理呢？作者：rcm001時(shí)間：09-4-313:01可是在這些成分里沒(méi)有看到有營(yíng)養(yǎng)成分，看過(guò)一些資料，他們的是有加血清、牛奶、培養(yǎng)基之類任一個(gè)成分的，沒(méi)營(yíng)養(yǎng)成分的話，可以保存十年左右么？1）GOODQUESTIONS能指望大腸桿菌在80C條件下利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)嗎？那些蛋白之類的是保護(hù)劑。我用過(guò)他們保存10年的困。2）所附文件應(yīng)該可以解釋為什么，還有酵母保存的使用方法。作者：保藏中心時(shí)間

19、：09-4-623:04可是在這些成分里沒(méi)有看到有營(yíng)養(yǎng)成分，看過(guò)一些資料，他們的是有加血清、牛奶、培養(yǎng)基之類任一個(gè)成分的，沒(méi)營(yíng)養(yǎng)成分的話，可以保存十年左右么？1）GOODQUESTION能指望大腸桿菌在80C條件下利rcm001發(fā)表于09-4-313:01感謝您的指教！作者：rcm001時(shí)間：09-4-715:37不用謝，應(yīng)該做的。順便提一下，取用菌種時(shí)也應(yīng)該特別小心，那些鬼子在我取菌種時(shí)都在邊上盯著，不是怕我拿了菌種，是提醒我不要把菌種管化了再取，而是用滅菌牙簽挑取一點(diǎn)冰凍物，放到試管中即可，菌種管應(yīng)飛速放回，盡量保持其溫度不變，覺(jué)得與其長(zhǎng)時(shí)間保存有關(guān)，特再告知。作者：保藏中心時(shí)間：09-4-716:4525#rcm001作者：wwchhappy時(shí)間：09-4-1221:53液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，加入20%的甘油，然后利用液氮速凍后，放置于超低溫冰箱（70度），可以長(zhǎng)期保存。作者：ouclhf時(shí)間：09-4-1310:32菌株加了甘油放在負(fù)八十的冰箱里面，一般3-5年都不會(huì)死的為什么會(huì)死呢，主要原因是溫度不夠低，如果是負(fù)二十或者負(fù)四十那么可能半年就會(huì)死掉的。死了的菌接種液體LB培養(yǎng)基一般是活不了了，建議直接取100微升保種的菌液，涂在不加任何抗