1、中華人民共和國國家標準消毒與滅菌效果的評價方法與標準GB15981-1995Evaluatingmethodandstandardfortheefficacyofdisinfectionandsterilization第一篇壓力蒸汽滅菌效果評價方法與標準1主題內容與適用范圍本方法規定了壓力蒸汽滅菌技術標準及其評價滅菌效果的檢測方法本方法適用于對壓力蒸汽滅菌設備滅菌效果的評價。2試齊I本標準所用試劑，凡未說明規格者，均為分析純（AR）,水為蒸儲水。2.1 蛋白月東。2.2 葡萄糖。2.3 澳甲酚紫酒精溶液：取澳甲酚紫2.0g,溶于100mL95%乙醇中。2.4 澳甲酚紫蛋白月東水培養基配制：蛋白

2、月東10.0g,葡萄糖5.0g,溶于1000mL蒸儲水中，調pH值至7.07.2,然后再加2%澳甲酚紫酒精溶液0.6mL,搖勻后，按5mL/管，分裝包口，置壓力蒸汽滅菌器中，于115c滅菌40min后備用。3指本菌嗜熱脂肪桿菌芽胞（ATCC7953或SSIK31）菌片，含菌量為5X1055X106cfu/片，121c下，殺滅90%微生物所需時間D121值為1.31.9min,殺滅時間（KT值）為W19min,存活時間（ST值）為冷.9min。4化學指示劑需用衛生部批準的化學指示劑5技術要求壓力蒸汽火菌器壓力，MPa/cm2溫度，C火菌時間，min下排氣式0.070115400.10512130

3、預真空式0.2101344-66檢測方法10.1 生物學指標（用作壓力蒸汽滅菌設備滅菌效果的依據）。10 將嗜熱脂肪桿菌芽胞菌片兩個分別放入滅菌小紙袋內，置于標準試驗包中心部位。10 滅菌柜室內，上、中層中央和排氣口處各放置一個標準試驗包（由3件平紋長袖手術衣，4塊小手術巾，2塊中手術巾，1塊大手術巾，30塊10cmX10cm、8層紗布敷料包裹成25cmx30cm><30cm大小）。手提壓力蒸汽滅菌器用通氣貯物盒（22cmx13cm>6cm）代替標準試驗包，盒內盛滿中試管，指示菌片放于中心部位兩只滅菌試管內（試管口用滅菌牛皮紙包封），將盒平放于手提壓力蒸汽滅菌器底部。10 經

4、一個滅菌周期后，在無菌條件下，取出標準試驗包或通氣貯物盒中的指示菌片，投入澳甲酚紫葡萄糖蛋白月東水培養基中，56c培養48h,觀察培養基顏色變化。10.2 化學指標在物品包外用化學指示膠帶，可作為物品是否經過滅菌的處理標志。在物品包內中心部位用化學指示劑，可作為物品是否滅菌的參考標志。7結果判定及評價1 同次檢測中，標準試驗包或通氣貯物盒內，每個指示菌片接種的澳甲酚紫蛋白月東水培養基全部不變色，判定為滅菌合格。指示菌片之一接種的澳甲酚紫蛋白月東水培養基由紫色變為黃色時，判定為滅菌不合格。1 化學指示劑的顏色變為與滅菌合格標準色相同時，或熔化時作為滅菌合格的參考標準。第二篇紫外線表面消毒效果評價

5、方法與標準8主題內容與適用范圍本方法規定了物體表面消毒用紫外線的波長、強度及評價其消毒效果的物理學指標和生物學檢測方法。本方法適用于紫外線直接照射到的物體表面消毒效果評價。9指不菌1 大腸桿菌（8099或ATCC25922）。1 枯草桿菌黑色變種芽胞（ATCC9372）。10物理學指標在電壓220V時，普通30W直管型紫外線燈，在室溫為2025c的使用情況下，253.7nm紫外線輻射強度（垂直1m處）應70m/cm2。在電壓220V時，高強度紫外線燈，在室溫為2025C的使用情況下，253.7nm紫外線輻射強度（垂直1m處）應比00m/cm2。10.3照射劑量按式（1）計算：(1)劑量（ws/

6、cm2）=強度（W/cm2）x時呵s）物理學檢測方法燈管的紫外線強度（訓/cm2）用中心波長為253.7nm的紫外線強度測定儀（標定有效期內），在燈管垂直位置1m處測定。在實際應用中消毒表面的照射強度應以燈管與消毒對象的實際距離測定。表面消毒接受的照射劑量，應達殺滅目標微生物所需。對大腸桿菌，照射劑量應達到20000Ms/cm2,對枯草桿菌黑色變種芽胞應達到100000pWs/cm2。生物學檢測方法采用載體定量消毒試驗。載體制備按本標準附錄C進行。開啟紫外線燈5min后，將8個染菌玻片平放于滅菌器皿中，水平放于適當距離照射，于4個不同間隔時間各取出2個染菌玻片，分別投入2個盛有5mL洗脫液（1

7、%吐溫80,1%蛋白月東生理鹽水）試管中，振打80次。經適當稀釋后，取0.5mL洗脫液，作平板傾注，每個染菌玻片接種兩個，放37c培養48h作活菌計數。陽性對照，除不作照射處理外，取2個染菌玻片分別投入2個盛有5mL洗脫液中振打80次，余按4.2.3進行。計算殺滅率陽性對照回收菌數-試驗組回收菌數殺滅率（%）-=X100<2）陽性對照回收菌數12判定標準對指示菌殺滅率A99.9%判為消毒合格。達物理學檢測標準時，作為消毒合格的參考標準。第三篇液體消毒劑消毒效果評價方法與標準13主題內容與適用范圍本方法具體規定了消毒劑消毒效果生物學檢測方法及其評價標準。本方法適用于消毒劑對各種物體的消毒效

8、果評價。14理化指標置20i2c水浴中，測定在使用濃度下殺滅指示微生物達到消毒或滅菌所需的最短時間（min）。15指示微生物細菌細菌繁殖體：金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、大腸桿菌（8099或ATCC25922）。細菌芽胞：枯草桿菌黑色變種芽胞（ATCC9732）。真菌：白色念珠菌（ATCC10231）。乙型肝炎表面抗原：純化抗原（1.0mg/mL）。16檢測方法中和試驗（見附錄A）。消毒劑定性消毒試驗（見附錄B）。消毒劑定量消毒試驗（見附錄C）。消毒劑殺菌能量試驗（見附錄D）。乙型肝炎表面抗原（HBsAg）抗原性破壞試驗（見附錄E）。17消毒效果評價標準對細菌和真菌的殺滅率A99.9%,

9、對HBsAg,將檢測方法靈敏度104倍或5X104倍（載體試驗）的HBsAg抗原性破壞，可判為消毒合格。對枯草桿菌黑色變種芽胞全部殺滅，可判為滅菌合格。在實際應用中消毒效果評價以有機物保護試驗的最低濃度和最短時間為該消毒劑達到實用消毒所需的濃度和時間。附錄A中和劑中和效果試驗（補充件）A1內容提要為了準確評價消毒劑對微生物的殺滅作用，消毒試驗中要求選擇適當中和劑。所選中和劑不僅能及時中止消毒劑的殺微生物作用，且中和劑本身及其與消毒劑的反應產物（下稱中和產物）尚需對微生物無抑制或殺滅作用，對培養基無不良影響。A2培養基和試劑A2.1營養瓊脂培養基成分：蛋白月東10g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g

10、-20g蒸儲水1000mL制法：除瓊脂外，其他成分溶解于蒸儲水中，調pH至7.2-7.4,加入瓊脂后加熱溶解，過濾分裝，經121C、壓力蒸汽作用30min,滅菌后備用。A2.20.03mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.27.6,下稱PBS）。成分：磷酸氫二鈉2.84g磷酸二氫鉀1.36g蒸儲水1000.00mL制法：將磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀溶解于蒸儲水中，pH為7.27.4,分裝，經121C、30min壓力蒸汽滅菌后備用。A3器材A3.1錐形燒瓶。A3.2平皿（直徑9cm）。A3.3量筒。A3.4精密pH試紙。A3.5無菌試管。A3.6無菌刻度吸管（1.0,5.0,10.0mL）。A3.7恒溫培

11、養箱。A3.8冰箱。A3.9菌落計數器。A3.10酒精燈。A4中和劑"注明生產廠家，批號）A5操作方法A5.1用PBS將指示菌制成5M055X106cfu/mL懸液。A5.2將消毒劑用滅菌蒸儲水配制成3種不同濃度，在不加中和劑的情況下，測知該消毒劑10min抑殺指示菌99.9%以上的最低有效濃度。A5.3取消毒劑10min抑殺指示菌的最低有效濃度與待選擇中和劑進行試驗，選出中和劑種類并依據等當量中和原則，調整中和劑濃度，選出試驗濃度的消毒劑使用中和劑的濃度。A5.4中和劑選擇試驗時，先將消毒劑1.0mL與中和劑溶液9.0mL混合，制成中和產物溶液，再按表A1分組進行。表A1中和劑選擇

12、試驗組號0.5mL菌液加于：混勻作用10min取0.5mL混勻液加入：（加入后總量為5mL、作用10min后，取原淞口以希釋泄05mL接1消電劑4.5mLPBS4.5mL原液，X102消電劑4.5mL中和劑4.5mL原液，X103中和產物4.5mLPBS4.5mLX100,X10004PBS4.5mLPBS4.5mLX100,X10005中和劑4.5mLPBS4.5mLX100,X10006PBS5.0mL原液然后，傾注平板置37c培養48h,計數菌落數，按稀釋倍數計算出回收菌數（cfu/mL）。A6中和試驗結果報告方法（如表A2）表A2中和試驗結果舉例中和劑各組回收菌落數，cfu/mL3、4

13、、51234561%卵磷脂0704.67M064.83X1064.11X1060ljL|1U6.271%卵磷脂+0.1%吐溫0795.81M065.89X1065.78X10600.721%吐溫800193.31M065.31X1065.21X106018.170.5%硫代硫酸鈉0133.20M065.03X1065.18X106018.943、4、5組間誤差率計算公式誤差率（）=（I三組均數3組菌數+I三組均數4組菌數+I三組均數5組菌數I）/（3X三組均數）X100A7判定標準A7.13、4、5組菌數相似，其誤差率W10%。A7.26組無菌生長。A7.32組菌數明顯少于3、4、5組。A7,

14、41組不長菌或明顯少于2組。符合上述標準的中和劑表明可消除消毒劑對指示菌的作用，中和劑及其與消毒劑的中和產物對指示菌無毒害，判定為該消毒劑的中和劑。A8消毒試驗用中和劑濃度的選擇按A5.4步驟進行，按A7.17.4的標準判定。附錄B消毒劑定性消毒試驗（補充件）B1內容提要定性消毒試驗是測定受消毒因子作用后的樣本有無細菌生長的試驗方法。用于對消毒因子滅菌效果的鑒定和消毒劑殺滅細菌效果的初步評價。B2培養基與試劑普通肉湯培養基成分：蛋白月東10.00g氯化鈉5.00g肉浸液1000.00mL制法：取蛋白月東、氯化鈉加入肉浸液內，微溫溶解，調節pH至弱堿性，煮沸、濾清，調節pH使滅菌后為7.27.4

15、,壓力蒸汽滅菌備用。試劑稀釋液：含1%蛋白月東的0.03mol/LPBS(pH7.27.4)。滅菌蒸儲水。中和劑：按本標準附錄A選擇。B3器材滅菌刻度吸管(1.0,5.0,10.0mL)。滅菌試管。滅菌三角燒瓶。酒精燈。恒溫水浴箱。恒溫培養箱。B4試驗方法將菌液進行活菌計數，并用稀釋液配制成含菌量為5X1055M06cfu/mL的菌懸液。將滅菌試管10支排列于試管架上，標記管號。每個試管加滅菌蒸儲水2.5mL,放20i2c水浴中。于第1管內加適當濃度消毒液2.5mL,混勻后取2.5mL移入第2管，再次混勻，從第2管中取2.5mL移入第3管，以此類推至第9管，混勻后棄去2.5mL,第10管中不加

16、消毒液作對照。加菌懸液2.5mL于各管中，混勻并記錄各管加菌時間，使菌藥混合液中含菌量均為105106cfu/mL。各管分別于加菌后4個不同間隔時間，取出0.5mL,加入4.5mL中和劑內，中和10min后，取出0.5mL加入4.5mL營養肉湯管內。將接種細菌的肉湯管放37c培養48h,觀察初步結果，無菌生長管繼續培養至第7天。試驗重復5次。B5結果判定若肉湯管混濁，則表示有菌生長，記為陽性，以（+）表示。若培養至第7天，肉湯管澄清，則表示無菌生長，記為陰性，以（一）表示。對難以判定的肉湯管，取0.1mL接種于營養瓊脂平板，用滅菌L棒涂勻，放37c培養48h,觀察菌落形態；并做涂片染色鏡檢，判

17、斷是否有指示菌生長。有指示菌生長記為陽性。B5.45次試驗，均無指示菌生長表示達到滅菌。附錄C消毒劑定量消毒試驗（補充件）C1內容提要定量消毒試驗是測定受消毒因子作用后，樣本殘存微生物數量的試驗方法，以殺滅率表示結果。用于對消毒劑殺滅效果的評價。C2培養基與試劑C2.1普通營養瓊脂培養基：按本標準A2.1制備。C2.2試劑C2.2.1稀釋液：含1%蛋白月東的0.03mol/LPBS(pH7.27.4)。C2.2.2滅菌蒸儲水。C2.2.3中和劑：按本標準附錄A選擇。C2.2.40.03mol/LPBS(pH7.27.4)。C2.2.5洗脫液：含中和劑、1%蛋白月東、0.1%吐溫80的PBS。C

18、3器材C3.1滅菌刻度吸管(1.0,5.0,10.0mL)。C3.2滅菌試管。C3.3滅菌三角燒瓶。C3.4滅菌平皿(直徑為9cm)。C3.5恒溫水浴箱。C3.6恒溫培養箱。C3.7酒精燈。C3.8菌落計數器。C3.9微量進樣器。C3.10載體：根據需要及試驗目的選用經脫脂處理0.5cmX1.0cm大小的布片、紙片、玻片、橡膠片、塑料片、不銹鋼片或鋁片C4試驗方法C4.1定量懸液試驗C4.1.1將菌液進行活菌計數，并用稀釋液稀釋成含菌量為5X1055X106cfu/mL的菌懸液。C4.1.2將消毒劑用滅菌蒸儲水稀釋成3個不同濃度，各吸取4.5mL分別加入三個試管內，放20i2c水浴中。C4.1

19、.3待試管內液體溫度與水浴溫度平衡后，在三個試管中分別加入0.5mL菌懸液（含菌量為5X1055X106cfu/mL）,混勻并開始記時。C4.1.4分別于4個不同間隔時間，各取0.5mL菌液混合液移入4.5mL中和劑中混勻。C4.1.5中和10min,作適當稀釋后進行活菌計數。C4.1.6陽性對照以洗脫液代替消毒液，同時按C4.1.2C4.1.5進行。C4.1.7按不同稀釋度推算出每個樣本存活菌數（cfu/mL）,按式（C1）計算殺滅率:C4.1.8試驗重復5次。C4.2載體定量試驗C4.2.1將滅菌載體平放于滅菌平皿內，每個載體滴注定量菌液（載體回收菌量達5X1055M06cfu/片），涂勻

20、，放37c培養箱待干。應用市售染菌載體時，回收菌量亦應達5X1055X106cfu/片）。C4.2.2用滅菌蒸儲水將消毒劑稀釋成3個不同濃度，各吸取5mL分別加入三個試管內，放20i2c水浴中。C4.2.3待試管內液體溫度與水浴溫度平衡后，加入染菌載體，作用至規定時間，將染菌載體移入含中和劑的5mL洗脫液試管內，中和10min,振打80次，適當稀釋，接種兩個平板。放37c培養2448h,進行活菌計數。C4.2.4陽性對照，以洗脫液代替消毒液按C4.2.2C4.2.3進行。C5結果判定C5.15次試驗的殺滅率均A99.9%判為消毒合格。C5.2對枯草桿菌黑色變種芽胞5次試驗均全部殺滅判為消毒合格

21、。附錄D有機物保護試驗（補充件）D1內容提要有機物保護試驗是測定消毒劑對有機物保護條件下的微生物的殺滅作用，以殺滅率表示之，其結果與該消毒劑定量消毒試驗相比較，用于評價有機物對消毒劑的殺菌能力的影響。D2培養基與試劑D2.1普通營養瓊脂培養基，按本標準A2.1制備。D2.2試劑：D2.2.1稀釋液：同C2.2.1。D2.2.2滅菌蒸儲水。D2.2.3中和劑：按本標準附錄A進行選擇。D2.2.40.03mol/L磷酸緩沖液（pH7.27.4）（簡稱PBS）。D2.2.5洗脫液：含1%蛋白月東，0.1%吐溫80的生理鹽水D2.2.6小牛血清加入菌懸液中，使其最終濃度為10%。D3器材同本標準C3。

22、D4試驗方法D4.1實驗前預先將菌液進行活菌計數，用稀釋液稀釋，加入小牛血清，使其最終含血清量為10%,含菌數為5X1055M06cfu/mL,以此作為試驗菌懸液。D4.2以下步驟同本標準C4.1.2C4.1.8。D5結果判定D5,15次試驗的殺滅率均大于99.9%所需最低濃度和最短時間，判為該消毒劑在有機物存在下，可以達到消毒的有效濃度和時間。D5.2此有效濃度和時間與定量消毒試驗達到消毒的有效濃度和時間相同或相近，判為有機物對消毒劑殺菌作用無明顯影響。達到消毒最低有效濃度增加一倍以上或最短作用時間延長一倍以上者可視為有明顯影響。附錄E乙型肝炎表面抗原破壞試驗（補充件）E1內容提要乙型肝炎表

23、面抗原（HBsAg）破壞試驗是以HBsAg的抗原活性為間接標志,評價消毒因子對乙型肝炎病毒（HBV）滅活能力的試驗方法。適用于評價化學消毒劑、紫外線對HBV的消毒效果。E2試劑E2.1小牛血清(56C,30min滅活)。E2.20.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.27.4)。E2.3純化HBsAg(1.0mg/mL)。E2.4固相放射免疫分析法試劑，要求特異性100%,精密性CVW15%,靈敏度w1.0ng/mL,線性r>0.95。E2.5酶聯免疫吸附法試劑，要求特異性100%,精密性CVW5%,靈敏度w3.2ng/mL,線性r>0.95。E3器材E3.1吸量器：包括試

24、管、吸管(0.1,1.0,5.0和10.0mL4種)和微量進樣器(100.0mU。E3.2載體(直徑1.5cm大小的不銹鋼片)。E3.3免疫計數儀。E3.4酶聯免疫測定儀。E3.5低溫冰箱(一30C一70C)。E4HBsAg懸液的配制E4.1取0.01mol/LPBS(pH7.27.4)9.4mL加入小牛血清0.6mL,配成含6%小牛血清的懸液。再取該PBS9.0mL,加入濃度為1.0mg/mL的純化HBsAg懸液1.0mL,使成含5.4%小牛血清，HBsAg濃度為100用/mL的試驗用HBsAg懸液。E4.2將試驗用HBsAg懸液1.0mL盛裝入容量為1.5mL的玻璃安甑中，封口，放-30C

25、-70C冰箱保存備用。保存期為三個月。E5HBsAg的檢測方法E5.1固相放射免疫分析法（SPRIA）。E5.2酶聯免疫吸附法（ELISA）。E6中和劑選擇在測定消毒劑對HBsAg的破壞效果時，應先選出適宜的中和劑及其使用濃度，再進行破壞試驗。所用中和劑：a,應能有效而及時中止消毒劑的殘余作用；b.中和劑及其與消毒劑的中和產物對HBsAg的抗原活性沒有影響，亦不影響檢測方法對HBsAg檢出的靈敏度。E6.1將消毒劑用無菌蒸儲水配成不同濃度，取1.2mL消毒液與0.3mLHBsAg懸液混勻，置20i2c水浴條件下，作用10min,測定該消毒劑10min抑制或破壞HBsAg抗原性的最低有效濃度。E

26、6.2取消毒劑10min抑制或破壞HBsAg抗原性的最低有效濃度與待選中和劑進行試驗，試驗可按下列組別進行：a,消毒液0.9mL+HBsAg懸?取0.1mL;b,消毒液0.4mL+HBsAg懸液0.1mL作用10min后+含20%小牛血清的中和齊ij0.5mL;c,先取含20%小牛血清的中和劑1mL與消毒液1mL,混勻，作用1030min,制成中和產物溶液，再行試驗。中和產物溶液0.9mL+HBsAg懸液0.1mL;d,含10%小牛血清的PBS0.9mL+HBsAg懸液0.1mL;e.含10%小牛血清的中和劑0.9mL+HBsAg懸液0.1mL;f,中和產物溶液0.9mL+PBs0,1mL。經

27、檢測只有在c、d、e組HBsAg活性的測定值相近（相差10%以下）并都明顯多于b組，a組HBsAg活性不能檢出或檢出活性明顯少于b組，f組陰性對照正常，方可證明所選中和劑及其使用劑量是適宜的。E6.3進行消毒試驗時，依據消毒劑與中和劑等當量中和原則，適當調整中和劑的用量。再次按E6.2步驟測定中和效果后，方可進行抗原性破壞試驗。E7破壞試驗方法E7.1懸液法懸液法指將HBsAg在懸液中與消毒劑相互作用并進行抗原性破壞效果觀察的試驗方法。E7.1.1HBsAg懸液的濃度為檢測試劑靈敏度的104倍。如檢測試劑的靈敏度為1ng/mL,HBsAg的濃度應為10國/mL。E7.1.2取含5%小牛血清的P

28、BS2.7mL加到含0.3mL濃度為100聞/mL的HBsAg懸液中，混勻。E7.1.3取小牛血清20mL加到含80mL滅菌的中和劑溶液中，混勻。E7.1.4破壞試驗：將預定消毒液濃度1.25倍的消毒液與HBsAg懸液按41比例混合，混合液容量不少于1.5mL。然后置20±2C水浴條件下，作用達規定時間，即亥IJ取0.3mL混合液與等體積含20%小牛血清的中和劑混勻，作用1030min,取樣測定殘留HBsAg的活性，每一樣本平行測定2份，每份0.1mL,取其平均值，判定破壞效果。每種消毒劑觀察3個濃度，每一濃度觀察4個作用時間。試驗重復5次。E7.1.5陽性對照：取含20%小牛血清的

29、中和劑1mL,加到含1mL試驗用消毒液的試管中混勻，作用1030min,制成中和產物溶液。取該中和產物溶液0.9mL加入試驗濃度的HBsAg懸液0.1mL取樣檢測，每一樣本檢測3份，每份0.1mL,取其平均值為陽性對照值。E7.1.6陰性對照：取含20%小牛血清的中和劑1mL加到含1mL試驗用消毒液的試管中，混勻，作用1030min,取樣檢測，每一樣本檢測3份，每份0.1mL取其平均值為陰性對照值。應注意陰性對照不能用試劑盒的陰性對照樣本。E7.2載體法載體法指將在載體表面的HBsAg與消毒因子相互作用，并進行抗原性破壞效果觀察的試驗方法。E7.2.1HBsAg載體的制備E7.2.1.1載體為直徑1.5cm大小的不銹鋼片，經洗滌劑煮沸洗滌脫脂、壓力蒸汽滅菌備用。E7.2.1.2HBsAg懸液的濃度為檢測方法靈敏度的5X104倍。如靈敏度為1ng/mL,HBsAg的濃度應為50聞/mL。E7.2.1.3HBsAg的污染方法為滴染法。滴染時，將滅菌載體平鋪于無菌平皿內，用微量進樣器吸取HBsAg懸液，滴注于載體中央，每個載體20人。然后用L型白金絲將懸液涂布均勻，放37c培養箱4060min,待懸液干燥后進行抗原性破壞試驗。E7.2.2抗原性破壞試驗取污染HB