1、實驗一 淀粉酶生產菌的篩選一、實驗目的學習淀粉酶產生菌的篩選方法。二、實驗原理淀粉酶在釀造、紡織、食品加工、醫藥等領域有廣泛用途。淀粉酶是一類淀粉水解酶的統稱，它能將淀粉水解成糊精等小分子物質并進一步水解成麥芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再變藍色，因此可根據淀粉培養基上透明圈的大小來判斷所選菌株的淀粉酶活力。三、實驗用品1樣品淀粉含量豐富的土樣。2培養基肉湯培養基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水至1000ml，pH7.0。121滅菌20min。初篩平板培養基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉 2g，瓊脂 18g，加水至1000ml，pH7.4。121滅菌

2、20min。Lugol碘液：碘 1g，碘化鉀 2g，蒸餾水 300ml。先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘溶解于碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加足水即可。3器材高壓蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺，電子天平，電爐，恒溫振蕩器，恒溫培養箱；燒杯，量筒，三角瓶，培養皿，移液管，洗耳球，試管，試管架，接種針，涂布棒。四、實驗方法1培養基制備：配制肉湯培養基45ml，分裝于250ml三角瓶中，紗布封口，滅菌。配制初篩平板培養基350ml，分裝于500ml三角瓶中，封口膜封口，滅菌。2倒平板：將融化的初篩平板培養基冷卻至5060，以無菌操作法倒至已滅菌的培養皿中，至蓋滿底部。冷卻凝固待用。3樣品預處理：取5g土樣接入4

3、5ml肉湯培養基中，30搖床振蕩15min制成土壤懸液，此時的稀釋度為10-1。另取4支試管，分別記作10-2、10-3、10-4、10-5共5個梯度，每支試管內加入9mL無菌水。用無菌移液管從三角瓶中吸取1mL土壤懸液，加入到10-2試管中混勻，再從此試管中吸取1mL加入到10-3試管中，依此類推直至10-5試管。4平板涂布分離：分別從不同稀釋度的試管中吸取0.1ml懸液，均勻涂布于初篩培養基平板上，于30培養2448h。5菌株檢測：待初篩平板長出菌落后，根據菌落不同挑取菌落進行保存并編號。同時，將檢測試劑（Lugol碘液）加入到平板中，涂布均勻，菌落周圍形成水解圈的菌株即是產淀粉酶的菌株，

4、記住其編號，以便進行下一步實驗。6保存菌種：將得到的菌株轉接至斜面培養基上，30培養4872h，待菌苔長好后，4保存。五、思考題微生物菌種的分離篩選通常包括哪幾個部分？實驗二 淀粉酶酶活測定一、實驗目的1掌握分光光度法測定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法2從初篩所獲得的菌株中篩選出淀粉酶活力高的菌株二、實驗原理淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷鍵的一類酶，包括-淀粉酶、淀粉1，4-麥芽糖苷酶（-淀粉酶）、淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（異淀粉酶）。-淀粉酶可以從淀粉分子內部切斷淀粉的-1，4糖苷鍵，形成麥芽糖、含6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖，使淀粉的粘度下降，

5、因此又稱為液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈藍色。這種淀粉-碘復合物在660nm處有較大的吸收峰，可以用分光光度計測定。隨著酶的不斷作用，淀粉長鏈被切斷，生成小分子糊精，使其對碘的藍色反應逐漸消失，因此可以根據一定時間內藍色消失的程度為指標來測定-淀粉酶的活力。三、實驗用品1粗酶液實驗一保存的菌種進行搖瓶發酵，發酵液離心后可作為粗酶液。2試劑碘原液：稱取碘化鉀22g，加少量蒸餾水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500ml，貯于棕色瓶中；比色用稀釋碘液：取碘原液2ml，加碘化鉀20g，用蒸餾水定容至500ml，貯于棕色瓶中；2%可溶性淀粉：稱取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸餾水混合調勻，徐徐傾入煮

6、沸的蒸餾水中，邊加邊攪拌，煮沸2min后冷卻，加水定容至100ml，需當天配制；pH6.0的磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）4.523g，檸檬酸0.807g，用水溶解并定容至100ml；0.5mol/L乙酸溶液。3器材離心機，分光光度計，恒溫水浴鍋，試管架，秒表；試管，移液管，燒杯，離心管。四、實驗方法1標準曲線的繪制：表21標準曲線的制作試 劑管號123456淀粉稀釋液濃度/%00.20.51.01.52.0淀粉稀釋液/ml222222緩沖液/ml11111140水浴中保溫5min蒸餾水/ml11111140水浴中保溫30min，加入0.5mol/L乙酸10

7、ml，混勻后吸取反應液1ml稀碘液/ml101010101010A660將可溶性淀粉稀釋成0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的稀釋液；吸取淀粉稀釋液2.0ml加至試管中，加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.0ml，40水浴保溫15min；加蒸餾水1ml，40保溫30min后加入0.5mol/L乙酸10ml；吸取反應液1ml，加入稀碘液10ml，混勻，在660nm下測吸光值A；以淀粉濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，作標準曲線。2酶液的制備將發酵液離心（5000r/min，10min），取上清液作為粗酶液，以pH6.0緩沖液稀釋至適當濃度，作為待測酶液。3淀粉酶活力測定按下列程序操作：試管A（空白

8、）試管B（酶試樣，需作三個平行試樣）加2%淀粉稀釋液2.00ml加2%淀粉稀釋液2.00ml加緩沖液1.00ml（搖勻）加緩沖液1.00ml（搖勻）400.2，5min400.2，5min加蒸餾水1.00ml（搖勻）加粗酶液1.00ml（搖勻）400.2，30min400.2，30min加乙酸10.0ml加乙酸10.0ml混勻混勻取反應液1.00ml取反應液1.00ml加稀碘液10.00ml加稀碘液10.00ml混勻混勻測定A660測定A660五、注意事項1淀粉一定要用少量冷水調勻，再倒入熱水中溶解，若直接加到熱水中，會溶解不均勻，甚至結塊。淀粉液應當天配制，配好的淀粉液應是透明澄清的，不能有

9、顆粒狀物質存在。2酶液應該進行適當稀釋。六、作業1繪制標準曲線。2記錄各樣品的A660，并計算其酶活力，計算方法參見附錄。七、思考題1測定酶活力時，在具體操作上應注意哪些問題？2為什么測定酶活力的試劑要在40水浴鍋中預熱？附：酶活力單位的定義：1ml酶液在40、pH 6.0的條件下，每小時分解的淀粉的毫克數。表示為u/ml。實驗三 淀粉酶生產菌發酵條件的優化一、實驗目的掌握發酵培養基的配制原則，熟悉用正交試驗優化發酵培養基的方法。二、實驗原理發酵條件對產物的形成有著非常重要的影響，其中培養基pH、培養溫度和通氣狀況是三類最主要的發酵條件。培養基pH一般指滅菌前的pH，可以酸堿溶液調節控制，因發

10、酵過程中pH會不斷改變，所以最好用緩沖溶液來調節；通氣狀況可用培養基裝量和搖床轉速來衡量，封口紗布的厚度也會影響氧氣的傳遞，一般以68層為好。發酵培養基是指大生產時所用的培養基，一般碳源含量較高。工業發酵培養基與菌種篩選時所用培養基不同，以經濟節約為主，一般選用廉價的農副產品為原料。由于天然原料的組分復雜，不同批次的原料成分各不相同，因此發酵前必須進行培養基的優化試驗。本實驗將對菌株的培養基配方進行優化。三、實驗用品1菌種:實驗一篩選得到的淀粉酶生產菌。2器材:搖床，高壓滅菌鍋；三角瓶，燒杯，移液管，試管。四、實驗方法1培養基制備：以黃豆粉、玉米粉、可溶性淀粉、酵母膏作為培養基的主要影響因素，

11、每一因素設定3個水平，按表3-1配制培養基（W/V），另加入Na2HPO4 0.8%，(NH4)2SO4 0.4%，NH4Cl 0.15%，分裝于250ml三角瓶，每瓶50ml，6層紗布封口，滅菌。取5ml蒸餾水加入試管中，滅菌。2接種：挑取斜面菌苔5環接入5ml無菌水中，搖勻后用無菌移液管吸取0.5ml菌懸液，接到每一組培養基中。30，150r/min搖床培養36h左右。3結果測定：參照實驗三方法測定菌株在各培養基中培養的淀粉酶活力。表3-1 發酵培養基優化正交試驗表組別因素A黃豆粉因素B玉米粉因素C淀粉因素D酵母膏酶活力/(U/ml)113%11%13%10.4%213%22%25%20.

12、6%313%33%37%30.8%425%11%25%30.8%525%22%37%10.4%625%33%13%20.6%737%11%37%20.6%837%22%13%30.8%937%33%25%10.4%五、作業將酶活力測定結果填入表3-1，通過正交分析，確定三個因素對酶活力影響的主次順序，并確定最適培養基配方。六、思考題正交試驗原理。實驗四 淀粉酶的提取一、實驗目的掌握鹽析法的基本原理，學會用鹽析法提取蛋白質。二、實驗原理鹽析法是加入中性鹽到蛋白質溶液中，蛋白質的溶解度開始增大，但隨著繼續加入鹽，蛋白質的溶解度卻逐步減小，并形成沉淀，不同蛋白質在不同中性鹽濃度下析出，利用此原理，可

13、對溶液中的雜蛋白質及目的蛋白進行分級沉淀以達到提取分離的目的。三、實驗用品1粗酶液實驗一保存的菌種進行搖瓶發酵，發酵液離心后可作為粗酶液。2器材燒杯，布氏漏斗，真空泵。四、實驗方法1鹽析：取120ml發酵液倒入燒杯中，調pH至6.7-7.8，加硫酸銨使其濃度達到40%-42%，加完后靜止數小時（3小時以上），即可抽濾或離心，收集濾餅。2加入硫酸銨量的計算方法：硫酸銨的溶解度在0-30變化很少，在水中飽和溶液濃度密度約為1.235g/ml。在20飽和溶液為533g/L，但加入硫酸銨體積會變大，1L水中加硫酸銨至飽和需加硫酸銨761g。考慮到溶液硫酸銨體積要增大，則于20時使1LM1摩爾濃度硫酸銨溶液增至M2摩爾濃度，所需的硫酸銨量為GG=533（M2-M12)上式如以飽和度表示，則以S1%增至S2%，需加入量為G=533（S2-S1）/(100-0.3S2)本實驗所需硫酸銨濃度