1、山 東 天 力 藥 業 有 限 公 司標題：細菌內毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243-B頁碼：1/9制定人：審核人： 批準人： 頒發部門：日期：日期：日期：生效日期：分發部門：品質部、中心化驗室、過程分析室目的：標準細菌內毒素檢驗操作程序。范圍：適用于細菌內毒素檢查操作。責任：品質部組織制定，中心化驗室負責實施。內容1準備工作1.1實驗設備及用具1.1.1刻度吸管、稱量瓶、鑷子、安瓿瓶2ml、5ml、藥匙、250烘烤1小時。1.1.2枯燥箱、恒溫水浴鍋、漩渦混合器、精細天平。1.1.3剪刀、砂輪片、醫用膠布、洗耳球、試管架、脫脂棉球、水銀溫度計、試管1.2內毒素標準品與實驗試劑1.2.

2、1鱟試劑：在使用前應進展靈敏度測定，原那么上購進一個批號測定一次。1.2.2細菌內毒素檢查用水內毒素含量0.015Eu/mL滅菌注射用水。1.2.3細菌內毒素國家標準品和工作標準品。1.2.4 75%乙醇、鉻酸洗液。1.3實驗用具的消毒處理：但凡參與實驗樣品或試劑接觸的器具，在實驗前必須經除細菌內毒素處理，將洗凈的器具經純化水沖洗后，在250干熱滅菌至少60分鐘。1.4恒溫水浴箱內水浴溫度調節到37±1。2鱟試劑靈敏度復核2.1根據鱟試劑靈敏度的標示值如：=0.25 EU/ml，細菌內毒素工作標準品參加1ml細菌內毒素檢查用水溶解，在漩渦混合器上混勻15分鐘。2.2將工作標準品制備成

3、2、0.5、0.25四個濃度0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.06 EU/ml的內毒素標準溶液，備用。山 東 天 力 藥 業 有 限 公 司標題：細菌內毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼：2/9例：工作標準品為160 EU/ml時160EU/ ml標準品溶液0.2ml16EU/ ml0.5ml8EU/ ml0.5ml1.8ml0.2ml1.4ml1EU/ ml0.9ml0.9ml0.5EU/ ml0.9ml0.9ml0.25EU/ ml0.9ml0.9ml0.125EU/ ml0.9ml0.9ml0.06EU/ ml注意：每稀釋一步均應在混

4、合器上混勻30秒。2.3取18支0.25 EU/ml鱟試劑，每支中參加0.1mlBET 水，然后分別參加0.1ml2.2中制備好的4個濃度的標準液,按濃度從高到低依次參加，每個濃度加4支，；最后2支參加0.1mlBET 水作陰性對照。2.4將上述試管用醫用膠布封口，垂直放入37±1水浴鍋中，保溫60±2分鐘。放入水浴前把水攪動幾下，以使水溫均勻。再次檢查溫度是否在所要求的范圍，注意保溫和取放過程應防止受到振動造成的假陰性結果。2.5保溫完畢后將試管輕輕取出，緩緩轉到180°，假設關內形成凝膠，不變形、不從管壁滑落者為陽性；未形成凝膠或形成凝膠變形從壁滑落者為陰性。

5、注意：保溫盒拿取試管過程應防止受到震動而造成的假陰性結果2.6 結果判定當最大濃度24支管均為陽性，最低濃度0.254支管均為陰性，陰性對照2支管為陰性，實驗方有效。如圖1山東天力藥業標題：細菌內毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼：3/9按下述公式計算反響終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值c。c=antilg(x/4)當c在0.5-2時，方可用于細菌內毒素的檢查，并以標示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。式中：X為反響終點濃度的對數值lg。反響重點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。antilg是lg函數的反函數，在excel里可以用power公式，

6、power數值2.7舉例設待復核鱟試劑的靈敏度為0.25 EU/ml，即=0.25 EU/ml。實驗結果如下：內毒素濃度  EU/ml  0.50   0.25  0.125  0.062  Nc     反響終點濃度X 1 + + - - - 0.25 2 + - - - - 0.50 3 + + + - 0.125 4 + + + - 0.125山東天力藥業標題：細菌內毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼：4/9那么：c =antilg(X/4)=antilglg0

7、.25lg0.50lg0.125lg0.125/4= antilg(-0.602-0.301-0.903-0.903)/4= antilg(-0.508)=0.310EU/mlc在0.5-2范圍內，符合規定。結果不是內毒素最大濃度24管全部陽性，最小濃度0.254管全部陰性，本批鱟試劑不能使用。需查找原因，可能是靈敏度標示不準確或內毒素效價標示不準確，或操作不當所致。3.干擾實驗干擾試驗的目的是確定供試品在多大的稀釋倍數或濃度下對內毒素和鱟試劑的反響不存在干擾作用，為能否使用細菌內毒素檢查法提供依據。3.1制備內毒素標準對照溶液取1支細菌內毒素標準品，用細菌內毒素檢查用水稀釋成4個濃度的標準溶

8、液即2.0、0.5、0.25。3.2制備含內毒素的供試品溶液將供試品稀釋至預實驗中確定的不干擾稀釋倍數，再用此稀釋液將11.1中的同支細菌內毒素標準品稀釋成4個濃度即2.0、1.0、0.5、0.25的含內毒素的供試品溶液。3.3鱟試劑的準備取規格為0.1ml/支的鱟試劑36支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內。每支參加0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉動瓶壁，使內容物充分溶解，防止產生氣泡。假設待復核鱟試劑的規格不是0.1ml/支時，按其標示量參加檢查用水復溶，將復溶后的鱟試劑溶液混和在一起，然后每0.1ml分裝到10×75m

9、m凝集管中，要求至少分裝36管備用。3.4凝膠反響山東天力藥業標題：細菌內毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼：5/9將準備好的鱟試劑18支管放在試管架上，排成5列，4列4支管，1列2支管。其中的4支4列每列每支分別參加0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的內毒素標準對照液，另一列2支管參加0.1ml檢查用水作為陰性對照。將另外18支管鱟試劑放在試管架上，排成5列，4列4支管，1列2支管。其中的4支4列每列每支分別參加0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的內毒素的含供試品溶液；另一列2支管參加0.1ml供試品溶液作為樣品陰性對照，如表1所示。加樣完畢后，用封口膜

10、封口，輕輕振動混勻，防止產生氣泡，兩同試管架放入37±1水浴或適宜恒溫器中，保溫60±2分鐘后，觀察并記錄結果。表l 凝膠法干擾試驗溶液的制備編號內毒素濃度/被參加內毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數所含內毒素的濃度平行管數A無/供試品溶液2B2/供試品溶液供試品溶液12421440.5480.254C2/檢查用水檢查用水12421440.5480.254D無/檢查用水2注：A為供試品溶液；B為干擾試劑系列；C鱟試劑標示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。山東天力藥業標題：細菌內毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼：6/93.5判定并計算C和B的反響終點濃度的集合平均值

11、(Es和Et) 只有當溶液A 和陰性對照溶液D 的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C 的結果在鱟試劑靈敏度復核范圍內時，試驗方為有效。按下式計算系列溶液C 和B 的反響終點濃度的幾何平均值Es和Et ) :Es= antilg Xs / 4 )Et=antilg Xt / 4 )式中Xs、Xt分別為系列溶液C 和溶液B 的反響終點濃度的對數值lg。當Es在0.52包括0.5和2及Et在0.5Es 2 Es 包括0.5Es和 2 Es時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。假設供試品溶液在小于MVD 的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進展不超過MVD 的進一步稀釋，再重復干擾試驗。可通過對供試

12、品進展更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法如過濾、中和、透析或加熱處理等排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進展干擾試驗。當進展新藥的內毒素檢查試驗前，或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進展干擾試驗。當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進展干擾試驗。3 供試品細菌內毒素檢查凝膠限度試驗4.1要求：在細菌內毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品和2支供試品陽性對照，同時每次試驗必須做2支陽性對照和2支陰性對照。 4.1.1因?藥典?對甘露醇原料藥內毒

13、素無要求，參照甘露醇注射液內毒素限值，每1g甘露醇中含內毒素的量應小于1.25EU。根據MVD=CL/ ，且當供試品為注射用原料藥時，MVD取1。故20%甘露醇注射液的鱟試劑限度為： =0.2g/ml×1.25EU/g=0.25EU/ml4.2操作方法4.2.1供試品溶液的制備山東天力藥業標題：細菌內毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼：7/9準確稱取0.2甘露醇用1mlBET水溶解，制成20%甘露醇溶液。根據MVD=CL/，將供試品進展稀釋，其稀釋倍數不得超過MVD。式中：C為供試品濃度。L為供試品的細菌內毒素限值。為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度。例：當用標示值為0

14、.25EU/ml靈敏度的鱟試劑時，MVD=CL/=20%×1.25/0.25=1(倍),所以把供試品制成20%的稀釋液即可。當用標示值為0.125EU/ml靈敏度的鱟試劑時，MVD=CL/=20%×1.25/0.125=2(倍),所以把供試品制成10%的稀釋液即可。當用標示值為0.06EU/ml靈敏度的鱟試劑時，MVD=CL/=20%×1.25/0.06=4(倍),所以把供試品制成5%的稀釋液即可。4.3陽性對照溶液的制備用檢查用水將內毒素標準品稀釋制成2濃度的內毒素標準溶液。取規格為10EU的細菌內毒素標準品一支 用酒精棉球將瓶頸消毒后開啟，加BET檢查用水1.

15、0ml混合15分鐘后備用。例：當用標示值為0.25EU/ml靈敏度的鱟試劑時，2=0.5EU/ml， 10EU/ ml標準品溶液0.2ml(10EU/ml標準品溶液)10EU/ ml1.0ml(1.0EU/ml標準品溶液)0.50EU/ ml1.0mlBET1.8mlBET 例：當用標示值為0.125EU/ml靈敏度的鱟試劑時，2=0.25EU/ml， 10EU/ ml標準品溶液0.2ml(10EU/ml標準品溶液)10EU/ ml1.0ml(1.0EU/ml標準品溶液)0.50EU/ ml1.0mBET1.8mlBET1.0ml(0.50EU/ml標準品溶液)1.0mBET0.250EU/

16、ml山東天力藥業標題：細菌內毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼：8/94.4供試品陽性對照溶液的制備用待檢測的供試品溶液或其稀釋液將內毒素標準品制成2濃度的內毒素溶液。例：當用標示值為0.25EU/ml靈敏度的鱟試劑時，2=0.5EU/ml， 10EU/ ml標準品溶液0.2ml10EU/ml標準品溶液10EU/ ml1.0ml(1.0EU/ml標準品溶液)0.50EU/ ml供試品陽性對照溶液 1.0ml20%供試品溶液1.8ml20%供試品溶液例：當用標示值為0.125EU/ml靈敏度的鱟試劑時，2=0.25EU/ml， 10EU/ ml標準品溶液0.2ml(10EU/m

17、l標準品溶液)10EU/ ml1.0ml(1.0EU/ml標準品溶液)0.50EU/ ml1.0ml10%供試品溶液1.8ml10%供試品溶液1.0ml(0.50EU/ml標準品溶液)1.0ml10%供試品溶液0.25 EU/ml供試品陽性對照溶液4.5陰性對照液即細菌內毒素檢查用水4.5.1鱟試劑的準備取規格為0.1ml的鱟試劑8支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后開啟備用，防止玻璃屑落入瓶內。每支參加0.1ml檢查用水溶解。4.5.2加樣取8支溶解好的鱟試劑，其中2支參加0.1ml供試品溶液，作為供試品管；2支參加0.1ml陽性對照溶液，作為陽性對照管PC

18、；2支參加0.1ml供試品陽性對照溶液，作為供試品陽性對照管PPC；2支參加0.1ml檢查用水作為陰性對照管NC。試驗加樣如：單位ml參照管試劑供試品管陽性對照PC供試品陽性對照PPC陰性對照NC12121212鱟試劑0.10.10.10.10.10.10.10.1山東天力藥業標題：細菌內毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼9/9供試品液0.10.1BET用水0.10.1供試品陽性對照液0.10.1陽性對照液0.10.14.5.3將2.2.6試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入37±1水浴鍋中，保溫60±2分鐘。注意保溫和取放過程應防止受到振動造成的假陰性結果。4.6結果判斷 當陽性對照都為陽性、供試品陽性對照都為陽性且陰性對照都為陰性時，試驗方為有效。假設供試品2管均為陰性，認為該供試品符合規定；如假設供試品2管均為陽性，認為該供試品不符合規定；如2管中1管為陽性，另1管為陰性，那么必須