1、 分離小鼠心肌細胞Protocol實驗動物：小鼠, 體重2030g 1急性分離心肌細胞A 實驗準備 ：1）無鈣臺氏液：配500mL無鈣臺氏液(50mL臺氏母液+450mL去離子水+1g 葡萄糖), 用NAOH 調PH， 一般在7.357.4之間即可，注：充氧后調PH值，否則充氧后PH下調。調PH值前嚴格校正PH計，小鼠心肌細胞對PH值特別敏感。表1：臺式母液配方mM MW g/L g/500ml (10x)NaCl12658.447.36336.82KCl5.474.550.4032.02Hepes10238.32.38311.92MgCl2.6H2O1.0203.30.2031.02NaH2

2、PO4.2H200.33156.010.0520.2574CaCl21.8147.03 Glucose10198.2注：CaCl2, Glucose配制時后加，（濃度0.9M CaCl2母液6.616g(有水)或者 4.995g(無水)+50ml去離子水），0.2ml CaCl2母液/100ml無鈣臺氏液2）稱取5mg膠原酶+8mg白蛋白3）配有鈣液200ml： 即200ml無鈣液+0.4ml CaCl2 (0.9M)。注：小鼠心肌細胞對鈣濃度特別敏感，我們為了縮短心臟復跳時間，減少心肌耗氧，把有鈣液中鈣離子濃度降到正常的濃度的1/44) 準備器械：大彎剪刀一把，小直剪刀兩把，直鑷子兩把，止血

3、鉗兩把，彎鑷子兩把，紗布一塊，注射器60mL一個，10mL一個；手術線一團(小鼠主動脈比較細，手術線比大鼠的要細)；表面皿三個，小燒杯50mL 三個，量筒50mL兩個， 500mL一個；大燒杯500mL一個250mL一個；濾紙若干！滴管 4個, 7號注射針頭一個（尖端磨平，靠近尖端兩厘米處用止血鉗夾出一道深溝以便于固定主動脈時系線）。5）KB 液配方mM MWg/LGlutamic acid (谷氨酸)70 147.13 10.3Taurine(牛黃酸)15 125.14 1.875KCl 30 74.55 2.237Hepes 10 238.3 2.383MgCl2.6H2O 0.5 203

4、.3 0.1015Glucuse 10198.21.982EGTA 0.5380.40.19KH2PO4 10136.091.36注：5M KOH 調PH 值（7.3-7.4），5M KOH 配制：28g KOH 溶于100ML去離子水，KB 液保存在-20冰箱中保存。B 實驗過程1）、實驗前準備：（1）、準備儀器：電熱恒溫器（帶水泵的）、Langendorff灌流系統。（2）、檢查氧氣瓶里是否有氧氣。（3）、打開恒溫灌流裝置的電源開關，調節電熱恒溫器的水溫，泵出的水打入冷凝管，使通過冷凝管的灌流液保持37的恒溫。（4）、清潔Langendorff管路，第一次使用先泡酸后用蒸餾水沖洗干凈，以后

5、每次使用前先用去離子水將Langendorff管沖洗3遍即可開始實驗。（5）、配制好無鈣的細胞外液及有鈣液，并取約50ml有鈣液置于表面皿中后放置在冰袋上，使其溫度降到0左右；另一50ml有鈣液置于表面皿中放入4冰箱待用（6）、向沖洗后的Langendorff管中加入有鈣液，用注射器輕輕吸出氣泡，并向管中通入氧氣。有鈣液濃度降到正常濃度的1/4，灌入大概50ml有鈣液，上面倒無鈣液。（7）、分別稱取5mg膠原酶和8mg白蛋白，用約50ml無鈣液溶解、備用。（8）、10ml注射器連接預備好的7號針頭，手術線打松結待用。2）、正式試驗：（1）、選取小鼠，稱重，用1%戊巴比妥麻醉(腹腔注射），麻醉劑

6、劑量盡量小，如果無需監測心電可采用斷髓法處死小鼠。不必打肝素，肝素抗凝同時對心臟也用副作用。（2）、待麻醉充分后，迅速開胸取出心臟（取心臟時切忌用手碰到心臟，首先用小直剪刀靠近頭段剪斷主動脈，用另一只手持直鑷子提起肺組織，從下方游離心臟），放到0的有鈣液中洗滌（可以輕輕的用食指按壓心臟，使心臟內的血液蹦出來，同時觀察蹦出來的動脈孔，即主動脈），分離出主動脈（主動脈不能分離太長，同時去除心包膜，即周圍的組織，動作要迅速，主動脈一般位于兩個白色胸腺下方，主動脈上端可見其三個分支，沿分支處剪斷主動脈，暴露主動脈干出口），用預備好的連在10ml注射器的7號針頭輕輕插入主動脈，用手術線固定主動脈（使灌流

7、針頭在主動脈的根部即可，太向下或者太向上灌流效果都不好，一般在肺動脈圓錐上端），將Langendorff管上三通打開，液體流出，然后把固定心臟的7號針頭連接到Langendorff管上，用有鈣液灌流，同時觀察肺動脈流出道是否被堵住，如果堵住立即用小剪刀剪開（同時觀察液體流下的速度，調節灌流針的深度）待心臟跳動幾次后，加入無鈣液，直至心臟停止跳動（完全停止，否則影響酶的消化，同時用拇指和食指輕輕擠壓心臟感覺硬度），無鈣液灌流時間稍微長一點比較好，停跳后1020分鐘加入預先配好的膠原酶和白蛋白混合液（先棄掉20mL，而后開始計時）大約30min心臟顏色變淺、質地變軟時，煎取少許右側心肌組織放到KB

8、液中，待有細胞下來時，將剩余心肌組織取下，用剪刀輕輕剪周圍組織，不要剪斷，然后將組織放到KB液中用吸管吹打，吹打時細胞下來，而組織相對保持完整形態比較好，吹打完細胞，剩余組織扔掉，心肌細胞保存在KB液中。穩定一小時后待用.小鼠心肌細胞消化時長大約在3050分鐘（3）、試驗結束后，用去離子水沖洗整個管路系統，防止酶殘留在管路中剩余的無鈣液配成有鈣液！2 實驗室溶液配方普通電極液（Pipette solution，in mmol/L）KCl 20, K-aspartate 110, MgCl2 1.0, HEPES 5, EGTA 10, Na2ATP 5 at pH 7.2；用KOH調pH至7.

9、3。有鈣臺式液（Tyrode solution containing, in mmol/L）NaCl 126, KCl 5.4, MgCl2 1, CaCl2 1.8, NaH2PO4 0.33, glucose 10, and Hepes 10, 用NaOH調pH至7.4。3 實驗過程記錄電流protocol內向整流鉀通道電流記錄protocol將電壓鉗制于-40 mV，從-120 mV至+50 mV，以10 mV為步階，脈沖持續時間為300 ms，可記錄到內向整流鉀電流。+50 mV-40 mV-120 mV瞬時外向鉀通道電流記錄protocol將膜電位鉗制于-50 mV，給予1個100 ms的脈沖刺激，該脈沖在-40 mV至+50 mV，以10 mV遞