1、糞便微生物宏基因組來源的B-半乳糖甘酶的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究乳糖是哺乳動(dòng)物乳汁及乳制品中存在的主要碳水化合物,當(dāng)人們飲用牛奶后,在消化過程中乳糖必須被B-半乳糖甘酶催化水解為半乳糖和葡萄糖才能被機(jī)體吸收利用。據(jù)報(bào)道，世界上約有十分之一的人由于體內(nèi)缺乏B-半乳糖甘酶而患有乳糖不耐受癥;飲用牛奶后,身體會(huì)出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等不良反應(yīng)。其中，B-半乳糖甘酶具有很大的商業(yè)利用情景，性質(zhì)優(yōu)良的B-半乳糖甘酶在生產(chǎn)生活中具有重要的實(shí)用價(jià)值。B-半乳糖甘酶屬于糖甘水解酶的一種,廣泛存在于自然界中。根據(jù)氨基酸序列的相似性,將B-半乳糖甘酶歸入五種糖甘水解酶(Glycosidehydrolases,GH)家族,包

2、括1、2、35、42和59家族。其中,部分B-半乳糖甘酶除了具有水解活性以外，還具有轉(zhuǎn)糖基活性。目前，對B-半乳糖甘酶的研究較多，但尚未有來源于動(dòng)物胃腸道且具有轉(zhuǎn)糖基活性的B-半乳糖甘酶報(bào)道,以及很少有報(bào)道具有耐鹽性的B-半乳糖甘酶；由于B-半乳糖甘酶被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)和生化分析等鄰域，耐鹽與否與其運(yùn)用前景息息相關(guān)。本論文研究的B-半乳糖甘酶來源于滇金絲猴糞便微生物宏基因組DNA通過PCRS隆得至ij基因galRBM20<sub>1</subxgalRBM20<sub>2</subxgalRBM20₁外口

3、galRBM20₁5,配合pEASY-E對體和宿主EscherichiacoliBL21(DE3菌種構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng),分別對其進(jìn)行異源表達(dá)和純化,并對純化后的重組酶galRBM20₁、galRBM20₂galRBM20₁3和galRBM20₁5進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，結(jié)果表明：(1)重組酶galRBM20₁ft適pH為5.0,在

4、pH4.0-7.0之間仍能保持70%及其以上的活性,在pH5.0-8.0的范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性;最適溫度為45,37和45下具有良好的穩(wěn)定性;大多數(shù)金屬離子和化學(xué)試劑對該酶的活性都具有激活作用;其耐鹽性較強(qiáng),當(dāng)反應(yīng)環(huán)境中有適當(dāng)濃度的NaCl或是經(jīng)一定濃度范圍內(nèi)的NaCl處理后,能明顯提高酶的活力。(2)重組酶galRBM20₂ft適pH為7.0,在pH7.0-9.0之間仍能保持70%及其以上的活性;在pH5.0-7.0的范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性;該酶溫度穩(wěn)定性良好,最適溫度為45,55處理1h后還具有45%以上的活性;大多數(shù)金屬離子和化學(xué)試劑對該酶

5、的活性都具有激活作用;該酶具有良好的耐鹽性,經(jīng)一定濃度范圍內(nèi)的NaCl處理后,酶的活力明顯提高。(3)重組酶galRBM20₁3ft適pH為7.0,在pH7.0-9.0之間仍能保持70班其以上的活性;最適溫度為45,在37、45、50和55下穩(wěn)定性良好;1mM的B-mercaptoethanol、Mg<sup>2+</supxFe²⁺對該酶的活性具有明顯的激活作用;該酶具有良好的耐鹽性,且一定濃度范圍內(nèi)的NaCl處理能提高酶的活力。(4)重組酶galRBM20<sub>1&

6、lt;/sub>5最適pH為8.0,在pH7.0-9.0之間仍能保持70炊具以上的活性；galRBM20₁5受pH的激活作用較強(qiáng)，在pH5.0-10.0的范圍內(nèi)處理1h后,酶活均在100%以上,其中pH10處理1h后,相對酶活達(dá)到180犯上；最適溫度為45C,50C和55c下穩(wěn)定性良好;1mM的B-mercaptoethanol、Mg<sup>2+</supxMn²⁺t該酶的活性具有明顯的激活作用；該酶具備一定的耐鹽性，當(dāng)反應(yīng)環(huán)境中有2M的NaCl存在時(shí)，仍具有55%勺活性。TLC檢測結(jié)果表明，重組酶galRBM20₁galRBM20₂galRBM20₁3和galRBM20₁5除了能將乳糖水解為