1、PTD4-apoptin 融合蛋白和達卡巴嗪聯用對小鼠黑色素瘤的協同抑制效應黑色素瘤高表達抗凋亡蛋白Bcl-2, 是黑色素瘤對化療藥物產生耐藥的原因之一。Apoptin( 凋亡素 ) 是來自雞貧血病毒的小分子蛋白質, 能選擇性地誘導腫瘤細胞凋亡而對正常細胞無毒副作用, 其誘導凋亡的作用不依賴抑癌基因p53 亦不被抗凋亡蛋白 Bcl-2 所抑制 ,Bcl-2增高甚至能夠增強其凋亡誘導效應。PTD4-apoptin 融合蛋白是一種具有透膜能力的能特異性誘導腫瘤細胞凋亡的融合蛋白。達卡巴嗪 (Dacarbazine, DTIC)是最早由美國 FDA批準的治療惡性黑色素瘤的一線藥物 , 至今仍作為評價

2、其他藥物對黑色素瘤療效的標準。本實驗旨在探討PTD4-apoptin 融合蛋白與化療藥物達卡巴嗪聯用對小鼠黑色素瘤細胞B16-F1,人黑色素瘤細胞系A875, SK-MEL-5 的細胞毒效應以及對荷黑色素瘤小鼠C57BL 6 的抗腫瘤效應 , 并初步探討其聯用機制。MTT法檢測達卡巴嗪聯合PTD4-apoptin 融合蛋白對小鼠黑色素瘤細胞系B16-F1, 人黑色素瘤細胞系 A875,SK-MEL-5的生長抑制作用 ,CDI 分析藥物相互作用的特點。DAPI染色觀測藥物孵育B16-F1 細胞后細胞核形態的變化 ,AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率。 Western blott

3、ing檢測藥物孵育B16-F1 細胞后 Bcl-2 和 CDK2的表達變化 , 初步探索兩藥聯合作用的機制。皮下注射 B16-F1 細胞建立 C57BL6 小鼠荷黑色素瘤模型 , 觀察 PTD4-apoptin 融合蛋白及其與化療藥物達卡巴嗪聯用對黑色素瘤的生長抑制作用。腫瘤標本制成石蠟切片后分別做原位免疫組化以及TUNEL染色 , 觀察PTD4-apoptin 融合蛋白分布情況及腫瘤細胞凋亡情況。對無瘤C57BL/6 小鼠施藥后 , 進行血常規檢測 , 分析藥物的骨髓抑制作用。體外實驗結果表明 ,PTD4-apoptin 融合蛋白與達卡巴嗪均可抑制小鼠黑色素瘤細胞系B16-F1, 人黑色素瘤

4、細胞系 A875, SK-MEL-5 的增殖并呈劑量依賴關系。三種不同濃度的 PTD4-apoptin 融合蛋白分別與不同濃度的達卡巴嗪聯用對三種不同的黑色素瘤細胞的生長抑制作用比達卡巴嗪單藥明顯增強,CDI 分析兩藥相互作用的性質 ,CDI<1,表明兩者聯合有協同效應；在某些濃度聯合時CDI<0.7,具有顯著的協同效應。 DAPI染色和 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測兩藥聯合孵育 B16-F1 細胞的細胞凋亡事件 , 結果表明 , 聯合用藥后 , 細胞凋亡程度加強 , 細胞凋亡率顯著升高。 Western blotting檢測到聯合用藥后B16-F1

5、細胞中 CDK2和 Bcl-2 的表達均有所升高。采用 C57BL6 荷瘤小鼠模型進行藥物的體內實驗, 結果表明 ,PTD4-apoptin融合蛋白能有效抑制小鼠黑色素瘤生長, 而 PTD4-EGFP融合蛋白與 PBS不能。PTD4-apoptin 融合蛋白與達卡巴嗪以不同比率聯合治療小鼠黑色素瘤, 結果表明“半劑量”聯合治療組或“全劑量”聯合治療組對黑色素瘤的抑制效應顯著高于 PTD4-apoptin 融合蛋白單藥治療組或達卡巴嗪單藥治療組 , 且“半劑量”或“全劑量”聯合治療組其抑瘤效應無明顯差異。 TUNEL染色以及原位免疫組化結果顯示 ,PTD4-apoptin 融合蛋白單用能夠有效透過皮膚進入腫瘤組織 , 兩者聯合能引起大量的腫瘤組織細胞凋亡。血常規檢測 , 分析藥物的骨髓抑制作用 , 結果顯示 , 與對照組相比 , 達卡巴嗪單藥治療組有骨髓抑制作用 ,PTD4-apoptin 融合蛋白及“半劑量”聯合治療組沒有骨髓抑制作用 , 而“全劑量”聯合治療組骨髓抑制作用也明顯小于達卡巴嗪單藥組。PTD4-apoptin 融合蛋白能夠有效抑制黑色素瘤的生長, 與達卡巴嗪聯用后對黑色素瘤的生長有協同抑制效應。PTD4-apoptin 融合蛋白能夠加強達卡