1、精品文檔第三十五章DNA的重組第一節(jié)同源重組、Holliday模型二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組致育因子（F因子）通過結(jié)合作用由F+細(xì)胞向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移，F(xiàn)質(zhì)粒約1/3的基因與轉(zhuǎn)移有關(guān)，traS和traT基因編碼表面排斥蛋白，阻止F+細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移，F(xiàn)+細(xì)胞的性菌毛與F-細(xì)胞結(jié)合后收縮，使二者靠近，TraD蛋白構(gòu)成轉(zhuǎn)移的通道，在TraI在TraY的幫助下結(jié)合到轉(zhuǎn)移起點(diǎn)oriT上，切開一條鏈，使其5'端進(jìn)入受體細(xì)胞，并合成其互補(bǔ)鏈，使F-細(xì)胞轉(zhuǎn)化為F+細(xì)胞，給體細(xì)胞中的單鏈也可以合成互補(bǔ)鏈。在細(xì)菌基因轉(zhuǎn)移的不同時(shí)間將配對(duì)細(xì)胞分開，可以確定基因在染色體上的位置。F質(zhì)粒DNA可以通過重組整合到受體的

2、染色體中，使受體菌成為高頻重組（Hf）菌株，若F質(zhì)粒的DNA未能完整地進(jìn)入受體菌，則受體菌不能轉(zhuǎn)化為F+,F質(zhì)粒的DNA可以被切割出來(lái)，有時(shí)可攜帶宿主菌的染色體DNA,稱作F'因子，F(xiàn)'因子攜帶的基因可在受體菌表達(dá)。外源基因可以進(jìn)入感受態(tài)細(xì)菌，稱作轉(zhuǎn)化，自然條件下感受態(tài)的形成需要10多種蛋白質(zhì)參與，實(shí)驗(yàn)室常用高濃度的Ca2+處理使細(xì)菌形成感受態(tài)。通過噬菌體將細(xì)菌基因從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌稱作轉(zhuǎn)導(dǎo)，若宿主菌任意部位的基因取代噬菌體DNA的一部分轉(zhuǎn)入受體菌，稱作普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)，若宿主整合部位的DNA取代了噬菌體的部分DNA稱作限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)。進(jìn)入受體菌的基因可與染色體重組。用溶菌酶除去細(xì)菌的

3、細(xì)胞壁，人工促使原生質(zhì)體融合，可引起廣泛的重組。大腸桿菌染色體的基因圖噬菌體的基因重組三、重組有關(guān)的酶依賴RecBCD起始的重組模型：RecBCD有依賴ATP的核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶和解螺旋酶活性，當(dāng)DNA斷裂時(shí)，它結(jié)合在其游離端，使其解旋并降解，直至酶移動(dòng)到chi位點(diǎn)(GCTGGTGG)，在其3/側(cè)4-6核甘酸處將鏈切斷，產(chǎn)生3/游離單鏈，隨后單鏈與RecA結(jié)合，開始同源區(qū)重組。精品文檔護(hù)apgrlvi.卜|TX4bfcMAlaiI1hriWHbRecA蛋白的絲狀聚合體與DNA的相互作用II'，l巾啜UUtWR叫Wbllr'.H.nutri：kc|2rRecA蛋白的帶狀圖解R

4、ecA蛋白的絲狀聚合體，每一圈螺旋由6個(gè)RecA蛋白單體構(gòu)成，其中一個(gè)單體由紅色標(biāo)出。RecA蛋白引起DNA同源重組的模型 luTIK 山要Ml'DNA duplex在大腸桿菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白參與的同源重組。(a) RuvA四聚體的圖解。四個(gè)亞基形成的結(jié)構(gòu)像四個(gè)花瓣的花。(b) RuvA/RuvB的作用：(左)RuvA四聚體結(jié)合到Holliday位點(diǎn)；(中)RuvB六聚體結(jié)合到雜合雙螺旋的兩對(duì)面，DNA穿過其中心，RuvB六聚體的作用像馬達(dá)，促進(jìn)超螺旋分叉點(diǎn)通過復(fù)合體移動(dòng)。(右)RuvC結(jié)合到Holliday位點(diǎn)，由其核酸酶活性切斷核酸鏈，切割位點(diǎn)由剪切體辨認(rèn)。(c

5、) RuvA四聚體的電荷分布，藍(lán)色表示正電荷，紅色表示負(fù)電荷，注意正電荷位于四聚體的表面，有四個(gè)負(fù)電荷區(qū)域位于其中心。(d)假設(shè)的RuvA四聚體與Holliday位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)構(gòu)模型。第二節(jié)特異位點(diǎn)重組(alLnicoinhiniiiliun修iliithe3nl召ontrniaiionjIbl*4MTittirXi加量hiMtnwiNTIMFns+xrsFlQUMM-4#1/4事miln«2*NIwi"wWw鏟*tw*kllwnmnuml*ddA*h*H*IE%ApK卞OH>-jnF>4w，rcmhI*hp,/aj«ff4rtr*精6dWtyMwlwh

6、"iiinRiItidh*“華41nltf1*rt4*w»>i4llwtvuftkifl臚f>FW<tw*rm*jefeKiwfc'rt»u»皿艮4AdjHqt«4ih|id*n*rgr*dDna.riwmIt，AMvgpiiifer中HlGmJ2Gufe-JJJfil'LnnilAlL-i-mlilwyEjm.*/w*1卜KvOiwdlt,#irl*Jrflu14hvKvdIti,rfwlfc«flhilferIhMhH-HJfn用據(jù)，*ME*BfdlinI卜q/，4nM53«>3e

7、fKi*ib-Hwfwtwifum細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門氏菌兩種鞭毛蛋白表達(dá)的調(diào)控DHA>| H,rnwiMr fi-iF 叩白 /nd npprr尸of 附僦1 -IMnobr/酎呼:,' hiRNAd " nnd T mKNAI IIhn monlWnmF'UBflAg*Uin吵pro4#iA i*pr»sMiriTrunx>owdwffiwnl11 ： TfliR而ri|AJX'.ifi tiHNA:M nilWAHtn recubiHueRiC riiUinFIGURE llU3l RtfpJ.Miefli O< llffl

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10、;w*rfe«<Ti GnHJMKTH免疫球蛋白基因的重組IgG的分子結(jié)構(gòu)»muiCH/h”HckhtitbiiMtr11iiiijekiotiFhR雕？匕44tnMihvV.rH|*ioe(4ItirhtriTunl*CL>ppjbhrdihuijii.ihiKpEudm9Mli*伊jrat*小dnNn$1ihp*«ph%m-hViminwnt#11bo-30DiJCfp£is«nlMH*HWRHvxnlc卜一(krin-lirONAHJi棺點(diǎn)IK-IT峭小中u<|£M*inJl><>MMKmrm

11、micvMRm4nbmdontMmdwDMAgwi鼻mjpjinkiuUr%wdj1,£即加珈W*rmBrntlEHnrultsnwm13、鼻HbfM，VmdJymuuiwMrit*iLfi口imhoniMyniBcin二|七*1inihjpi眄inmJjtfcMi：durr%F»cKj|inpjh|»prkhsTh*lightdtiilBcanrQinbAM*"hjmt；»pzkLdiiin*+，.事njrvbdytnolruiMatun*】*9H*chainUj4I.,BnktQtotr9n*cnp<)m：Hv1固IPFIcivinv

12、.dnT?iqnonrfftbclViwn耳andCHrmRNAsplicingPrim”TYtrnKiriiln1Lhl-ch«biIU-.Jpel>iKiAbdvVMilbitOf&KtJifitrvftonrpfebwipnX*lntuldlni，血取7皿附VfijJj|CmHNA重組位點(diǎn)有7和9nt的信號(hào)序歹U,中間間隔12或23bp。免疫球蛋白基因重組的模型重組酶(RAC1/RAC2)復(fù)合體與重組信號(hào)序列結(jié)合。復(fù)合體使編碼序列與重組信號(hào)序列之間的雙連斷裂，編碼序列的末端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。重組信號(hào)序列結(jié)合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。編碼序列連接前經(jīng)過加工，連接位點(diǎn)不十分確定，增加

13、了免疫球蛋白的多樣性。DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)和DNA連接酶參與了加工和連接過程。在不同的核甘酸位點(diǎn)重組可以生成不同的蛋白質(zhì)。第三節(jié)轉(zhuǎn)座重組I"""VAcct舄核.TGCl-TOiCJmBCAPtBET83丁【;11人林01入CUTAEtHF喇r4r卜iu*hl一=一.一"HG".TMWWPIWfgMITiKKTg<；aTC<=AlCCST，愚工!&1Ai-GTIdlTF11I<il，tillFihl；.17|打I.MLi；1L.cH(ifAlhiAni-1i(i>ii-1.dk一、細(xì)困的轉(zhuǎn)座因子1S

14、.2Insert沁nsequencesaresimpletmnspositionmodtiles插入因子轉(zhuǎn)座子具有反向末端重復(fù)序列以及在靶部位兩側(cè)產(chǎn)生的同向重復(fù)序列。在該例中靶序列為5bp,轉(zhuǎn)座子末端由9bp反向重復(fù)序列組成，數(shù)字1-9指序列重復(fù)堿基對(duì)。Figure15ITransposonshavemveiledteimittalrcpeiitsmidLu'iiciiUcduectrepealsoffhiikii里DNA阻thehirgeisiteInthisexample,tlioteugetisa5bpsequenceTheendsofthetrailsposoiiconsist

15、ofinvertedrepeatsof9bp,wherethenumbeta1Ii，nigh1-indjcutchsequenceofbasepairsPLrtk£irL-3口noFix>92i999RRJ1 5.3 Com positetraiispuson hdve IS組合型轉(zhuǎn)座子：兩個(gè)插入序列之間夾著一段序列（可以是某個(gè)基因，如抗性基因）。兩個(gè)插入序列可以同向或反向排列，有時(shí)均有轉(zhuǎn)座活性，有時(shí)只有一個(gè)有轉(zhuǎn)座活性。figure152AcoinpositetistnsposonhngaCLiitulII”口JLHikcisISlitj:lxdiresistaiice)Han

16、kedbyISnioduleaThemoduleshave；-hcninviiicdicmtinalrepcIfthemodulesIhemjclvesaicininvertedorientationrasdrawn),Hie!?hortinvertedterniinarepealsatihccn<1aftlie：Mi!<pOf；LHiMieideillical復(fù)合型轉(zhuǎn)座子：插入序列被轉(zhuǎn)座酶基因取代，圖示為Tn3（TnA家族）的結(jié)構(gòu)。兩端為38bp的反向重復(fù)，其兩側(cè)為5bp的靶序列，tnpA編碼轉(zhuǎn)座酶，tnpR編碼的蛋白質(zhì)可以作為解離酶（使轉(zhuǎn)座子與受體DNA形成的共整合體重組和解離

17、），也可以作為阻遏蛋白調(diào)節(jié)tnpA和tnpR兩個(gè)基因的表達(dá)，res為解離的控制位點(diǎn)，TnpR蛋白結(jié)合于其上發(fā)揮調(diào)控作用。轉(zhuǎn)座的方式轉(zhuǎn)座子可用不同的方式轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座因子插入基因后可使基因失活，也可引起染色體的斷裂、重復(fù)、缺失、倒位、易位等變化。15.3CompositetransposonshaveISmodulesFigure153TwoIS10ImodulescreateaIcompositetransposonthatIcaninobihzeanyregionIofDNAthatliesbetweenIthemWhenI'ntOispartIofasmallcncularIinole

18、cuIe.theIS10Irepeatscantfatisposc|eithersidecfthecircle兩個(gè)IS10組件構(gòu)成一個(gè)復(fù)合轉(zhuǎn)座子，它能使位于他們之間的任何DNA易位。當(dāng)Tn10是個(gè)小的圓形分子的一部分時(shí)，IS10重復(fù)序列可轉(zhuǎn)座至環(huán)狀分子的任一側(cè)。插入序列使靶序列的數(shù)量增加，在插入序列兩側(cè)各有一個(gè)。Staggeredmade i: target srteTransposon jonea tc sn git-branded ericsFigure 15.4 The direct repeats of target DNA ITaiiking a transposon are gen

19、erated by the introduction of staggered cuts whose protruding ends are linked to the transposon.15 4 I ransposiiion occurs by l卬th ruplicativc and nonreplicadvc mechanisms復(fù)制轉(zhuǎn)座作用產(chǎn)生了轉(zhuǎn)座子的一個(gè)拷貝，它插入到一個(gè)接受位點(diǎn)。給予位點(diǎn)保持不變，以致給予者和接受者都有轉(zhuǎn)座子的一個(gè)拷貝。G書和吠targetsitefliecinandsealedFigure 15.5 Replicative transposition cre

20、ates a copy ot the IransposoiK iduch insetts at a recipient site. Hie dewr site renriins unchanged so both demor and recipient have a copy of the Iransposn口.非復(fù)制轉(zhuǎn)座作用在未被修復(fù)的情況下，可能造成致死突變。154Iranspositia】occursbvbothreplicalhe:iridnonreplicativeniediantsiiis15.4Transpositionoccursbybothreplicativeandnoii

21、feplicativemechmusiiisFigureI5.6oiireplicalieInntsposi口onallowsab'iwisposoiitomoveasaphysicalentityfromadonortoarecipientsitellusleavesabreakatthedonor3依whichislethalunlessiicanberepaired保守的轉(zhuǎn)座作用不造成核甘酸的丟失，如入噬菌體的整合和切除。DonorRecipient15,4 Transposilion qqcuts by both replicative and nonrqilicatne me

22、clianistnsFigure157Consenativetranspositionuivohesdirectmovementwithnolossofnuckolidcbonds:comparewitlilambdamUirratioitandexcisionJnorRecipient反向重復(fù)序列的重組能引起其間序列反向排列。Figure 15.8 Reciprocal recombination bctuccn direct repeats excises the material between tlicni. each product of recombination has one

23、copy of the direct repeal.Xanng of direct /eoeatse;omDinaticn rgieases material tstwesn 叫 oeats as circulaTHTolecule轉(zhuǎn)座子引起DNA的重排，正向重復(fù)序列的重組引起其間序列的切除或插入。155TransposonscatiserearrangeinentofDNAInverted repeatsinvented repeats pairFigure 15.9 Reciprocal recombination between in x cried repeats inverts th

24、e region between them.15.5TransposonscauserearrangementofDNA轉(zhuǎn)座作用可引起給體和受體的整合或分割，并可引起轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的增加。Figure15.12Transpositionmayfuseadonorandrecipientrepliconintoacointcgratc.Resolutionreleasestxvoreplicons,eachcontainingacopnfthetransposon,15.7Replicativetranspositionproceedsthroughacointegrate二、真核生物的轉(zhuǎn)座因子原

25、核生物的轉(zhuǎn)座酶主要作用于產(chǎn)生它的轉(zhuǎn)座因子，表現(xiàn)出順式顯性。真核生物的轉(zhuǎn)座酶可以作用于任何末端具有該酶所識(shí)別的反向重復(fù)順序的DNA,使其轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的靶位點(diǎn)。在玉米白勺激活-解離系統(tǒng)(activator-dissociationsystem,Ac-Ds)中，Ac編碼轉(zhuǎn)座酶(自主因子），Ds（非自主因子）是Ac不同程度的缺失中間序列形成白1無(wú)轉(zhuǎn)座酶活性，但隨Ac轉(zhuǎn)座后可抑制鄰近基因的表達(dá)。在玉米白抑制-促進(jìn)-增變系統(tǒng)（suppressor-promotor-mutator,Smp）中，Smp和En（增強(qiáng)子）序列相似，均為自主因子，與其對(duì)應(yīng)的非自主因子dSmp為有缺陷的Smp因子，轉(zhuǎn)座后，若Smp插入

26、靶基因附近的合適部位，可以促進(jìn)靶位點(diǎn)基因的表達(dá)，若Smp插入外顯子，可抑制基因的表達(dá)。百田MDtE5.11(oiHrollinekmviihinmemu8cj<ndrearranmvntsUSWMiHf1riJlTMM0t*Figure 15,23 Ds provides a site to inilialc the thioimUid fii siun- bndgc-brctikigc cycle he products crui be fallowed hy clonal analysis.wrbrir tr圳，rt 3 e a « o口TUTObF El二皿1陋廠且, U

27、jiMMrE：5f 同 rtf i-hnira玉米的控制元件形成轉(zhuǎn)座子的不同家族，每個(gè)家族均有自主和非自主成員。廿B! IE! W G15.12Controllingelementsinmaizeformfamiliesoftransi)osonsFigure 15.24 Each controlling element family has both auhiotnmis and nonautonomoiis tn cm bet s. : tu toiiom uu s clc ni ent & arc capable of transposition Nonautonomoiis e

28、lements are deficient in transpositiim, Pairs ot autonomous and nonaulonomous elements uati be c Lis st Red in 4 families4Auronomous7W/V女mt加4VH rr 匚兀 jtjpPecur?s3Tonxncnr削mPkipm suppttssoGmuiator爐號(hào)總匚理 Spm)rn (emanceri7 (irtlffiror)DatedJfirsr ec寸'八rm城P品系的果蠅含有40-50個(gè)P因子（一種轉(zhuǎn)座子），P因子的mRNA前體含有3個(gè)內(nèi)含子,若P

29、品系雄性與M品系雌性交配，子一代的體細(xì)胞mRNA前體加工時(shí)保留了第3個(gè)內(nèi)含子，合成阻遏蛋白，不發(fā)生轉(zhuǎn)座，性細(xì)胞mRNA前體加工時(shí)切除了全部3個(gè)內(nèi)含子，活躍的轉(zhuǎn)座使性細(xì)胞失去功能。P雄性或M雄性與P雌性交配時(shí)，由于雌性的卵細(xì)胞質(zhì)中存在抑制P因子轉(zhuǎn)座酶活性的蛋白質(zhì)，子代的生殖功能正常。第四節(jié)真核生物基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄前調(diào)控410%的DNA在發(fā)育過程中1 .染色體丟失：如四膜蟲的大核為營(yíng)養(yǎng)核，由小核發(fā)育而來(lái),被丟失。2 .基因擴(kuò)增：如非洲爪蟾卵母細(xì)胞的rDNA可以大量擴(kuò)增，形成1000個(gè)以上的核仁。3 .基因重排：重排可以使表達(dá)的基因發(fā)生切換，也可以產(chǎn)生新的基因。4 .組蛋白的乙酰化和去乙酰化：組蛋白的

30、乙酰化和基因表達(dá)的狀態(tài)相關(guān)。組蛋白H4的乙酰化不足(underacetylation)是雌性哺乳動(dòng)物一條X染色體失活的原因之一。去乙酰化和基因活性的阻遏有關(guān)。5 .染色體DNA的修飾和異染色質(zhì)化：DNA的甲基化可以使其失去轉(zhuǎn)錄活性，高度甲基化的DNA可以形成高度壓縮的異染色質(zhì)，異染色質(zhì)的基因無(wú)轉(zhuǎn)錄活性。6 .染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變模型-組蛋白置換占先模型(pre-emptivemodel):決定的因素是轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白誰(shuí)先占據(jù)調(diào)控位點(diǎn)。DNA復(fù)制時(shí)，組蛋白8聚體解離，轉(zhuǎn)錄因子乘機(jī)結(jié)合到調(diào)控位點(diǎn)上，一直持續(xù)到下一個(gè)復(fù)制周期，抑制了組蛋白和DNA的結(jié)合。例1:當(dāng)5srRNA基因與組蛋白結(jié)合時(shí)TFmA不能激

31、活此基因。而TFmA可與游離的5srRNA基因結(jié)合，再加入組蛋白不能使此基因失活。例2:含腺病毒啟動(dòng)子的質(zhì)粒能被TFIID結(jié)合，再被RNApoln轉(zhuǎn)錄，如先加入組蛋白，則不起始轉(zhuǎn)錄，如先加入TFnD則形成的染色質(zhì)中，模板仍能轉(zhuǎn)錄。動(dòng)態(tài)模型(dynamicmodel):組蛋白置換需輸入能量。一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA時(shí)可裂解核小體，或建立一個(gè)可產(chǎn)生核小體定位結(jié)合位點(diǎn)的邊界。如果蠅Hsp70啟動(dòng)子上的核小體在體外實(shí)行重建。GAGA(細(xì)胞核結(jié)合蛋白)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子中4個(gè)富含(CT)n位點(diǎn)結(jié)合，破壞了核小體，形成一高敏感區(qū)，而且導(dǎo)致鄰接的核小體重排，這樣它們就優(yōu)先插入到隨機(jī)位點(diǎn)。核小體打開的過程是需要水解ATP的耗能過程。7 .細(xì)胞周期的調(diào)控最關(guān)鍵的是兩個(gè)蛋白質(zhì)家族：周期素(cyclin)家族和依賴周期素的蛋白激酶(cyclin-dependingproteinkinase,CDK)家族，目前發(fā)現(xiàn)的周期素有10種以上，用字母A,B,C等表示，CDK有8種以上，用CDK1,CDK2,CDK3等表示。周期素A,周期素D,CDK2,CDK4的合成受轉(zhuǎn)錄因子E2F的調(diào)節(jié)，他們共同的作用控制著G1期向S期的轉(zhuǎn)化，周期素A