1、病毒中和抗體檢測1 .病毒TCID50檢測TCID50是指組織培養物（細胞）半數致死劑量。它有幾個性質我們必須明白：1）它表示的是計量，不是濃度；2）它是一個單位；3）它的值等于1，實際上問它的值等于多少是一個沒有意義的問題，就像問km的值等于多少一樣，如果非要說出的的值等于多少，那我們只能說它的值在任何情況下都等于1。理解這三個性質對于理解TCID50非常重要，但是這三個性質經常被誤解，所以導致對TCID50的理解出現偏差。首先我們來看一下這個表示法的意思：病毒滴度為ml。它表示的是每ml病毒溶液里含有個TCID50的病毒，這和氯化鈉的濃度為L表示每L溶液中含有個mol的氯化鈉是一樣的道理。

2、經?？梢月牭饺苏f我的病毒的TCID50是。這個說法是不科學的，應該說我這個溶液里含有個TCID50的病毒或者說我這個溶液的病毒滴度是10xxTCID50/ml。也可以說病毒的TCID50效價是。TCID50=10Ao即：將病毒懸液作10A稀釋后，接種細胞，可以使50%勺細胞產生CPE（將病毒懸液作10A稀釋后，中含1個TCID50,作其他一些實驗時（如中和試驗），一般常用100TCID50/或者100TCID50/）本方法的優缺點:.優點:出現陽性結果時間較短,且較明顯;.缺點:有時候,在用槍頭吸出細胞生長液時,容易出現污染;使用本方法時的注意事項:.稀釋病毒時,每做一個病毒稀釋度都需要換槍頭

3、,減少濃度誤差;.96孔板,每孔接種的細胞量:一般在此種測定病毒滴度的方法下,要將細胞密度適當調低,至少要比正常傳代時低一些,否則細胞生長速度過快,未到7天則細胞出現死亡,對觀察CPE不利.一般情況下,小塑料瓶（8-9ml液體為正常用量）,培養長慢單層后,消化細胞,加入6ml培養液,吹勻,吸出其中的2ml,到另外的瓶子,在該瓶中加入14-16ml即可,如果不放心,可以用顯微鏡看一下,細胞數過多則補加培養液,少則補加剩余4ml的細胞懸液;維持液，即病毒培養液，配方為：.MEM+2%、牛血清+3將氨酰胺+1%Z抗+NaHCO3;.MEM+3給氨酰胺+1%Z抗+NaHCO3兩種維持液的不同在于是否有

4、FBS（小牛血清）.我個人曾經做過實驗,在狀態很好的細胞上接種病毒,分別使用兩種不同的維持液,最終結果是一樣的,沒有什么不同,所以可以根據個人需要進行選擇.另外,曾經請教過專門做中和實驗的老師,他認為適當的FBS對細胞有保護作用，而且他說這是國外文獻上的報道.1）細胞準備檢查培養瓶中的單層細胞，以5ml胰酶一EDTA至微沖洗加入45ml胰酶EDTAZ覆蓋單層細胞放平培養瓶，37c5%CO茹養箱中孵育1020min,直到細胞脫落加入510ml培養液，洗下細胞后移到離心管中以PBSgfc細胞兩次（12000rpm,5min）以D-ME麗懸細胞，并用血球計數板計數以D-MEM1將細胞濃度調整到1X1

5、0A5/ml乂10A5/ml在微量培養板的各孔中加入100仙1細胞，相當于X10A4細胞/孔在37c5%CO邪養箱中過夜培養（1822h）,用處于生長相剛達到完全融合的細胞進行病毒的滴定2）病毒制備3）病毒稀釋取凍存的病毒，以病毒生長培養液（VGM稀釋10倍，即100微升病毒液+900微升稀釋液，共1毫升。（于EP管中進行，將混合液充分吹打振蕩，很重要?。┳?0倍稀釋在另一新EP管中加入100口第一管稀釋病毒液（1/10）,按10的比例進行倍比稀釋，再加入900口稀釋液，將混合液充分吹打振蕩。以此類推共稀釋至10A13倍。此過程中需要使用加樣器和tip頭。使用前用75叱醇擦拭加樣器，并用紫外線

6、照射20min,確保無菌。使用新高壓的tip頭，外包裝一定在超凈臺（或安全柜中打開）4） 病毒接種：取細胞培養板，用多道加中¥器（又稱排槍）吸去96孔板中的培養液，吸取孵育液或無血清DMEM口在每孔中再輕輕吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因為血清能干擾病毒的吸附）。于各孔中加100ul各不同的病毒稀釋液，每個稀釋度做一列孔，即每個病毒稀釋度做8個平行復孔，根據觀察的習慣，一般從右到左，從上到下，從高稀釋度到低稀釋度到原液加樣。（病毒稀釋度的選擇10A310A12或者10A410A13,因為目的基因不同，重組腺病毒滴度差距很大，應該盡量將稀釋度加大，看到有人用的稀釋度是1

7、0A610A13）第11列和12列為陰性對照，陰性對照孔中加入100ul含5%臺牛血清的DMEM監測細胞存活情況；切記：設置正常的細胞對照。每次實驗要重復4次，計算標準差。3456789101112CONCONABCDEFGH37CCO邪養箱中孵育1h,取出培養板吸去病毒液（從低濃度向高濃度吸取可避免竄孔），加入維持液200口繼續于37C,5%CO邸養5-10大；逐日觀察，5-10天后倒置顯微鏡下觀察，計算每一列中出現CPE（cytopathiceffects,CPES的孔數。只要有一小點或是一些細胞出現CPE即為陽性，如果無法確定，可與陰性對照比較；如果陰性對口中無任何CPE且細胞生長良好，

8、最低稀釋度100%日性而最高稀釋度100制性，則本試驗即為有效；計算每一列中出現陽性的孔數；用Reed-Muencht計算病毒TCID50/ml。（1）計算各病毒稀釋度陽性孔數目（1）和陰性孔數目（2）（2）計算陽性和陰性孔的累積數。陽性孔累積數由下向上累計（3）;陰性孔累積數由上向下累計（4）（3）計算陽性孔的百分比：比率（5）=（3）/（3）+（4），（6）=（5）X100（4）計算距離比例（PD=（大于50%勺陽性百分比50）/（大于50%勺陽性百分比一小于50%勺陽性百分比）TCID50的對數=大于50%勺陽性百分比的最高稀釋對數十距離比例X稀釋系數的對數（稀釋系數的對數1:10稀釋為

9、1,半對數稀釋為，倍比稀釋為，1:5稀釋為）舉例計算：TCID50的測定和計算（Reed-Muencha）病毒液稀釋度細胞管觀察結果累計細胞官數細胞管總數出現CPE的細胞管所占的出現CPE管不出現CPE管，出現CPE管不出現CPE27/27)10-28019019100(19/19)10-37111112(11/12)10-435461040(4/10)10-517；E_11314(1/14)10-608021210(0/21)出現細胞病變（CPE以及血凝素等的細胞管數分別列于表14-2的第二和第三列它們的累計數分別列于第四和第五列（根據箭頭所示方向），第六列為

10、細胞管總數，第七列為出現細胞病變的細胞管數占細胞管總數的百分率?？梢娫摬《局甑腡CID5。在10-3（%）和10-4（40%）之間，其確切稀釋倍數可按下列公式計算：（高于50%的百分數）-50（高于50%的百分數）-40（低于50%的百分數）將由上式獲得加在高于50%E亡的稀釋度的對數（3）上，因此該病毒的TCID50應是稀釋的病毒液。查反對數得6310，即該病毒6310倍稀釋液等于1個TCID50。2 .中和實驗1）細胞準備檢查培養瓶中的單層細胞，以5ml胰酶一EDTA至微沖洗加入45ml胰酶EDTAZ覆蓋單層細胞放平培養瓶，37c5%CO2W養箱中孵育1020min,直到細胞脫落加入510

11、ml培養液，洗下細胞后移到離心管中以PBSgfc細胞兩次（12000rpm,5min）以D-ME麗懸細胞，并用血球計數板計數以D-MEM將細胞濃度調整到1X10A5/ml乂10A5/ml在微量培養板的各孔中加入100仙1細胞，相當于乂10A4細胞/孔在37c5%CO邪養箱中過夜培養（1822h）,用處于生長相剛達到完全融合的細胞進行病毒的滴定2）待測血清準備動物血清中，含有多種蛋白質成分對抗體中和病毒有輔助作用，如補體、免疫球蛋白和抗補體抗體等。為排除這些不耐熱的非特異性反應因素，用于中和試驗的血清須經加熱滅活處理。各種不同來源的血清，須采用不同溫度處理，豬、牛、猴、貓及小鼠血清為60；水牛、

12、狗及地鼠血清為62；馬兔血清為65；人和豚鼠血清為56。加熱時間為20-30min，60以上加熱時，為防止蛋白質凝固，應先以生理鹽水作適當稀釋。取已滅活處理的血清，在96孔微量細胞培養板上，用稀釋液作一系列倍比稀釋，使其稀釋度分別為原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，或者按1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280稀釋，每個稀釋度做3-4個平行孔。3 ）加入病毒,感作以VGM等病毒稀釋到100TCID50/50al（200TCID50/100a）除細胞對照孔外每孔中加入與血清量相等的病毒液，在細胞對照孔中加入與血清量相等的

13、VGM輕混病毒血清混和物，37c5%CO2W養箱中孵育2h4）接種細胞準備用于接種的剛達到完全融合的細胞的培養板，吸掉培養液，加入3501無血清D-MEMS養液以洗掉剩下的FBS病毒-血清混和物孵育2h結束后，各取100屋中和液到細胞培養板相應的孔中37c5%CO2W養箱中孵育2h吸掉中和液，力口250仙lD-MEM洗滌加200仙lDMEM在37C5%CO邪養箱中孵育34d,檢測培養液中血凝活性，以能保護50細胞培養管不被感染的最高血清稀釋度的倒數作為中和終點。在制備細胞懸液時，其濃度以在24h內長滿單層為度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100屋細胞懸液。置5%COZ7c溫箱培養,自培養4

14、8h開始逐日觀察記錄，14D終判。由于各種病毒引起細胞病變時間不同，終判時間應根據病毒致細胞病變的快慢而定。5）對照組對照的設定：包括細胞對照（培養液中僅含細胞，不含病毒和血清），陰性對照（培養液中含有l00TCID50病毒、細胞及陰性血清）和空白對照（培養基中含有100TCID50病毒及細胞，不含血清）,各設3個平行孔。為保證試驗結果的準確性，每次試驗都必須設置下列對照，特別是在初次進行該種病毒的中和試驗時，尤為重要。陽性和陰性血清對照：陽性和陰性血清與待檢血清進行平行試驗，陽性血清對照應不出現細胞病變，而陰性血清對照應出現細胞病變。病毒回歸試驗：每次試驗每一塊板上都設立病毒對照相館，先將病

15、毒作、1、10、100、1000TCID50稀釋，每個稀釋度作4孔，每孔加50仙l。然后每孔100屋細胞懸液。TCID50應不引起細胞病變，而且100TCIDTCID50必須引起細胞病變，否則該試驗不能成立。血清毒性對照相：為檢查被檢血清本身對細胞有無任何毒性作用，設立被檢血清毒性對照是必要的。即在組織細胞中加入低倍稀釋的待檢血清（相當于中和試驗中被檢血清的最低稀釋度）。正常細胞對照相：即不接種病毒和待檢血清的細胞懸液孔。正常細胞對照應在整個中和試驗中一直保持良好的形態和生活特征，為避免培養板本身引起試驗誤差，應在每塊板上都設立這一對照。6）結果判定和計算當病毒回歸試驗，陽性、陰性、正常細胞對

16、照相，血清毒性對照全部成立時，才能進行判定，被檢血清孔出現100%CPEJ為陰性，50%Z上細胞出現保護者為陽性；固定病毒稀釋血清中和試驗的結果計算，是計算出能保護50%細胞孔不產生細胞病變的血清稀釋度，該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價。舉例計算：用Reed和Muench兩氏法（或Karber法）計算結果，固定病毒稀釋血清法中和抗體效價計算如表2-26血清稀釋CPE數無積累CPE積累無CPECPE比率百分數1:40/4040120/1201:80/404080/801:161/413141/5201:323/431414/5801:644/440808/810080%50%距離比例二二80%20%IgTCID50=高于50%血清稀釋度的對數距離比例X稀釋系數的對數IgTCID50=X（-）=（稀釋系數的對數1:10稀釋為1，半對數稀釋為，倍比稀釋為，1:5稀釋