1、茴香霉素對(duì)小鼠同種異基因皮膚移植的影響                              作者：陳笛, 邢飛躍, 狄靜芳, 陳玲 【摘要】  目的: 闡明茴香霉素對(duì)淋巴細(xì)胞反應(yīng)性的影響以及在皮膚移植中抑制排斥反應(yīng)的作用。方法: 用MTT法檢測(cè)茴香霉素刺激下淋巴細(xì)胞在單向或雙向混合淋

2、巴細(xì)胞反應(yīng)中的反應(yīng)性。C57BL/6小鼠作為供體, BALB/c小鼠作為受體。手術(shù)前3 d分別給3組BALB/c小鼠皮下注射生理鹽水、 環(huán)胞霉素A以及茴香霉素, 手術(shù)當(dāng)天繼續(xù)注射至術(shù)后第7天。環(huán)胞霉素A及茴香霉素的注射劑量分別為: 20 mg/kg、 12.5 mg/kg。結(jié)果: 在劑量10.0 g/L時(shí), 茴香霉素能抑制單向或雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性（P均<0.01）; 茴香霉素組移植皮膚的存活時(shí)間明顯高于環(huán)胞霉素A組以及對(duì)照組。結(jié)論: 茴香霉素能明顯抑制淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性; 并且能明顯延長(zhǎng)受體對(duì)皮膚移植物的耐受時(shí)間, 可能為移植免疫排斥的提供新的途徑。 【關(guān)鍵詞】

3、0; 茴香霉素 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 皮膚移植Abstract  AIM: To investigate the effect of anisomycin on the reactivity of lymphocytes and the rejection in the skin transplantation in mice. METHODS: The reactivity of T cells in unilateral or bilateral mixed lymphocyte reaction was detected by MTT assay. The skins from C

4、57BL/6 mice were transplanted to BALB/c mice and the survival period of the grafts was assessed. The recipients were divided into three groups (physiological saline group, cyclosporin A group and anisomycin group). They were injected with physiological saline (0.1 mL), cyclosporin A (20 mg/kg) and a

5、nisomycin (12.5 mg/kg) separately once a day for 3 days before the operation and 7 days after the operation. RESULTS: With the optimal dose of 10.0 g/L, anisomycin inhibited the reactivity of lymphocyte cells in both unilateral and bilateral mixed   lymphocyte reactions. The survival perio

6、d of the grafts from anisomycin group was longer than that from cyclosporin A group and physiological saline group. CONCLUSION: Anisomycin can inhibit the reaction of lymphocytes and prolong the survival period of the grafts in skin transplantation effectively. It could be used as a new way for tran

7、splantation rejection treatment.Keywordsanisomycin; mixed lymphocyte reaction; skin transplantation茴香霉素是由鏈霉菌分泌的一種活性成分, 能結(jié)合在核糖體60S亞基上阻止多肽鏈形成。作為臨床藥物, 茴香霉素已被用于治療由真菌和阿米巴原蟲引起的疾病1。最近有研究發(fā)現(xiàn), 茴香霉素與學(xué)習(xí)、 記憶關(guān)系密切2-4。然而茴香霉素在免疫系統(tǒng)方面的相關(guān)研究很少, 我們?cè)谘芯恐幸馔獍l(fā)現(xiàn)茴香霉素能明顯抑制淋巴細(xì)胞的增殖活化（另文發(fā)表）, 因此, 將其試用于動(dòng)物體內(nèi)研究。本研究以混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)為模型測(cè)試茴香霉素處理的

8、淋巴細(xì)胞在體外對(duì)同種異基因抗原刺激的反應(yīng)性, 以皮膚移植為模型觀察其體內(nèi)對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用。結(jié)果顯示, 茴香霉素對(duì)單向和雙向混合淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性均有明顯的抑制作用, 并能明顯地抑制受體對(duì)供體皮膚的排斥反應(yīng), 延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間。提示茴香霉素對(duì)免疫系統(tǒng)有著明顯的抑制作用, 可能為開發(fā)免疫抑制藥物提供新的途徑。1  材料和方法1.1  材料  SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠(68周齡, 體質(zhì)量1822 g);  SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠(68周齡, 體質(zhì)量1822 g), 由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。刀豆蛋白A（ConA）、 碘化丙錠（PI）、

9、L谷氨酰胺、 巰基乙醇、 茴香霉素和MTT均購自美國(guó)Sigma公司。RPMI1640、 胎牛血清（FBS）為美國(guó)GibcoBRL公司產(chǎn)品。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為111 g/L的水合氯醛由廣州華僑提供, 環(huán)胞霉素A由華北制藥廠生產(chǎn), 慶大霉素由華北制藥廠生產(chǎn)。6/0羊腸手術(shù)縫合線由上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司提供, 顯微外科器械生產(chǎn)于上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠, 顯微外科手術(shù)鏡為德國(guó)Laica公司產(chǎn)品。1.2  方法2  結(jié)果2.1  茴香霉素對(duì)小鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的影響  在雙向混合淋巴細(xì)胞中, 茴香霉素組A540值低于對(duì)照組（P<0.01）, 與地塞米松

10、組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;  茴香霉素ConA組A540值低于ConA組（P<0.01）, 與地塞米松ConA組比較亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A）。在單向混合淋巴細(xì)胞中, 茴香霉素ConA組A540值低于ConA組（P<0.01）, 茴香霉素組A540值明顯低于對(duì)照組（P<0.05）, 與地塞米松組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B）。表明茴香霉素能明顯抑制小鼠淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。圖1  茴香霉素對(duì)單向（B）或雙向（A）混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的影響（略）Fig 1  The effect of anisomycin on the unilateral(B) or bilate

11、ral(A) mixed lymphocyte reactionAnisomycin: 10.0 g/L; Dexamethasone: 1.0 mg/L.1         2.2  茴香霉素對(duì)小鼠移植皮瓣的影響  術(shù)后第4天拆開包扎紗布, 發(fā)現(xiàn)傷口均已愈合, 移植皮膚均紅潤(rùn)、 柔軟, 皮毛生長(zhǎng)正常。術(shù)后第8天發(fā)現(xiàn)生理鹽水組有2只小鼠移植皮瓣開始干燥、 皺縮, 視為開始排斥。術(shù)后第10天發(fā)現(xiàn)環(huán)胞霉素A組有小鼠的移植物發(fā)生排斥的現(xiàn)象。術(shù)后第13天發(fā)現(xiàn)茴香霉素組的小鼠移植物發(fā)生排斥現(xiàn)象（表1）。從

12、圖2中可以看到, 生理鹽水組其中一只小鼠的移植皮瓣在第9天開始邊緣就出現(xiàn)干枯、 翹起。環(huán)胞霉素A組小鼠在第11天邊緣出現(xiàn)干枯、 皺縮、 泛黃。而茴香霉素組的小鼠在第13天才開始出現(xiàn)邊緣翹起、 壞死的排斥癥狀。且皮瓣掉落的時(shí)間順序也為: 生理鹽水組環(huán)胞霉素A組茴香霉素組（表2）。皮瓣存活時(shí)間和皮瓣脫落時(shí)間統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的結(jié)果為生理鹽水和環(huán)胞霉素A組; 生理鹽水組和茴香霉素組; 環(huán)胞霉素A和茴香霉素組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明環(huán)胞霉素A實(shí)為移植耐受的有效藥物, 而茴香霉素作為移植耐受藥物, 效果比環(huán)胞霉素A更為明顯。從觀察小鼠注射藥物后的狀態(tài), 可發(fā)現(xiàn)環(huán)胞霉素A組小鼠自第1次注射后起

13、就顯得暴躁不安, 且逐漸消瘦。停藥后體質(zhì)量恢復(fù)較慢。而茴香霉素組小鼠雖稍有消瘦及躁動(dòng), 但狀態(tài)明顯好于環(huán)胞霉素A組小鼠, 停藥后體質(zhì)量恢復(fù)也較快。表1  茴香霉素對(duì)小鼠移植皮瓣開始排斥時(shí)間的影響（略）Tab 1  The effect of anisomycin upon the initiation rejection time of skinaP<0.05, bP<0.01 vs control; dP<0.01 vs CsA.表2  茴香霉素對(duì)小鼠移植皮瓣脫落時(shí)間的影響（略）Tab 2  The effect of anisomy

14、cin upon the exfoliation time of skinaP<0.05 vs CsA; bP<0.01 vs control.圖2  茴香霉素對(duì)小鼠移植皮瓣的影響（略）Fig 2  The effect of anisomycin upon the allogeneic skinA, B, C: The state of allogeneic skin of physiological saline group, cyclosporin A group and anisomycin group separately of day 9; D, E

15、, F: The state of allogeneic skin of physiological saline group, cyclosporin A group and anisomycin group separately of day 11; G, H, I: The state of allogeneic skin of physiological saline group, cyclosporin A group and anisomycin group separately of day 13.3  討論    茴香霉素是p38絲裂原活

16、化蛋白激酶（MAPK）的激活劑5, 而各種炎癥效應(yīng)細(xì)胞中p38MAPK的激活能刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì), 參與炎癥反應(yīng)。然而, 目前未見茴香霉素對(duì)免疫系統(tǒng)影響的相關(guān)報(bào)道。我們?cè)谘芯縫38MAPK通路時(shí), 發(fā)現(xiàn)茴香霉素作為p38MAPK通路的激活劑能夠明顯抑制單向或雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中T細(xì)胞的增殖活性, 抑制T細(xì)胞表面早期及中期活化標(biāo)志分子CD69和CD25的表達(dá), 且能抑制T細(xì)胞對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞的殺傷活性, 其作用不亞于經(jīng)典的抑制劑地塞米松。在體外試驗(yàn)中, 我們發(fā)現(xiàn)大于1.0 ng/mL茴香霉素就足以產(chǎn)生明顯的抑制作用, 在10 ng/mL100 ng/mL的劑量范圍內(nèi), 茴香霉素能發(fā)揮更好的作用

17、, 其毒副作用較小（另文發(fā)表）。因此, 我們將其試用于皮膚移植動(dòng)物。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來, 茴香霉素在小劑量范圍內(nèi)的作用甚至優(yōu)于臨床常用的免疫抑制劑環(huán)胞霉素A。小鼠在注射環(huán)胞霉素A后出現(xiàn)明顯的躁狂、 消瘦等毒副作用。最近研究發(fā)現(xiàn), 環(huán)胞霉素A會(huì)引起多種并發(fā)癥, 最常見的是腎毒性, 肝毒性, 糖尿病,  高動(dòng)脈壓和神經(jīng)毒性等6。而茴香霉素劑量在小于環(huán)胞霉素A的情況下就能取得較好的效果, 可以減少藥物的毒副作用, 并且移植物的存活狀態(tài)也比環(huán)胞霉素A組小鼠要好。因此, 茴香霉素很可能具有作為免疫抑制劑開發(fā)應(yīng)用的潛在前景。但是, 茴香霉素會(huì)引起短時(shí)記憶的丟失, 且它在其他方面的毒副作用仍然未知,

18、因此還需通過大量的研究來探明其臨床應(yīng)用價(jià)值。【】  1 Hazzalin CA, Le Panse R, Cano E, et al. Anisomycin selectively desensitizes signalling components involved in stress kinase activation and fos and jun inductionJ. Mol Cell Biol, 1998, 18(4): 1844-1854.2 Cohen H, Kaplan Z, Matar MA, et al. Anisomycin, a protein synthesis inhibitor, disrupts traumatic memory consolidation and attenuates posttraumatic stress response in ratsJ. Biol Psychiatry, 2006, 60(7): 767-776.3 Lattal KM, Abel T. Behavioral impairments caused by injections of the protein synthesis inhibitor anisomycin after contextual retrieval