1、http：/DOI：10.7685/jnau.201603004南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2017,40(2):302-307JournalofNanjingAgriculturalUniversity楊品品，劉瑞瑞,楊倩.聚乙烯亞胺配合滅活禽流感病毒口服免疫對(duì)雞免疫反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育的比響J.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2017,40(2)：302-307.聚乙烯亞胺配合滅活禽流感病毒口服免疫對(duì)雞免疫反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育的影響楊晶晶，劉瑞瑞,楊倩*(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095)摘要：目的本文旨在研究聚乙烯亞胺(PE1)配合滅活H5N1禽流感病毒曰服免疫對(duì)雞免疫反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

2、方法1日齡雛雞35只，隨機(jī)分成5組，每組7只。根據(jù)免疫方法分為口服生理鹽水0.3mL蛆(CK)、口服滅活禽流感病毒0.25mL組(IAIV)、口服0.08g聚乙烯亞胺所合0.25mL滅活禽流感病毒組IAIV+PEI(0.08)、口服0.02g聚乙烯亞胺配合0.25mL滅活禽流感病毒組1AIV+PEI(O.O2)和皮下注射滅活禽流感油乳佐劑疫苗組(詛)。分別在首次免疫后第3、5、7周通過(guò)檢測(cè)口腔棉拭子、腸道和氣管涮洗液中特異性IgA、血清中特異性IgG和HI抗體水平對(duì)免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，然后稱體質(zhì)址，檢測(cè)空腸和P1腸絨毛長(zhǎng)度以對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果0.02g聚乙烯亞胺配合0.25mL滅活禽流

3、感病毒門(mén)服免疫維雞的口腔棉拭子和腸道涮洗液中特異性IgA水平顯著高于單獨(dú)口服滅活病毒雛雞組"<0.05)；0.08g和0.02g聚乙烯亞胺分別配合0.25mL滅活禽流感病毒口服免疫雛雞后第7周，血清中特異性IgG水平極顯著升高(P<0.01);0.02g聚乙烯亞胺配合0.25mL滅活禽流感病毒口服免疫雛雞后，其空腸、回腸絨毛長(zhǎng)度比單獨(dú)口服滅活病毒極顯著增長(zhǎng)(P<0.01)o結(jié)論0.02g聚乙烯亞胺配合0.25mL滅活H5N1禽流感病毒口服免疫雛雞，不僅增強(qiáng)免疫反應(yīng)，提高免疫力，還能促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收。關(guān)鍵詞：聚乙烯亞胺;口服免疫；滅活禽流感病毒中圖分類號(hào):S852.4

4、文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1000-2030(2017)02-0302-06EffectoforalimmunizationwithinactivatedavianinfluenzavirusandadjuvantpolyethyleneimineontheimmuneresponseandgrowingdevelopmentinchickenYANGJingjing,LHjRuirui,YANGQian*(KeylaboratoryofAnimalPhysiologyandBiochemistry,MinistryofAgriculture,NanjingAgriculturalUnivers

5、ity,Nanjing210095.China)Abstract:ObjectivesAnexperimentwasconductedtoinvestigatetheeffectoforalimmunizationwithH5N1inactivatedAvianinfluenzavirus(IAIV)andadjuvantpolyethyleneimine(PEI)ontheimmuneresponseandgrowingdevelopmentinchicken.MelhcxisAccordingtotheimmunemethod,35onedayoldchickenswererandomly

6、dividedinto5groups,oralimmunizationwithnormalsaline0.3mL(CK),oralimmunizationwithIAIV0.25mL(IAIV),oralimmunizationwith0.08gPEIplusIAIV0.25mLIAIV+PE!(0.08).oralimmunizationwith0.02gPEIplusIAIV0.25n)LIAIV+PEI(0.02)ysubcutaneousinjectionwithinactivatedoil-adjuvantemulsionvaccine(ill).3,5,7weeksafterthe

7、firstvaccination,antigen-specificmucosalIgAtitersinmouthswab,trachealandintestinalwash,theantigen-specificserumIgGtitersandHItitersweredetectedtoevaluatetheimmuneeftert.Weightandthelengthofintestinalvillusinjejunumandileumweredetectedtoevaluategrowingdevelopment.ResultsTheantigen-specificIgAantibody

8、titersinmouthswabandintestinalwashinducedby0.02gPEIplus0.25mLIAIVweresubstantially(P<0.05)greaterthanantigen-alonetreatment.7weeksafterthefirstvaccination,thelevelofIgGinsenirninducedbyseruminducedby0.08gPEIand0.02gPEIplus0.25rnLIAIVweremoresignificantlyincreased(/><0.01)thanantigen-alonetr

9、eatment.Thelengthofintestinalvillusinjejunumandileumof0.02gPEIgroupweremoresigniGcantly(P<0.01)increasedthanantigen-alonetreatment.ConclusionsChickenoralimmunizationwith0.02gPEIand0.25mLII5N1IAIVcouldstrengthenimmuneresponseandabsorptionofnutrients.Keywords:polyethyleneimine;oralimmunization；inac

10、tivatedAvianirifluenzavirus收稿日期：2016-03-03基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)R(31172302)；國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303046)作者簡(jiǎn)介:楊晶晶.碩士研究生。通信作者：物倩.教授，博導(dǎo)，主寒從事動(dòng)物黏膜免疫研究,E-mail：zxbyqnjau.e<o高致病性禽流感（highlypathogenicavianinfluenza,HPAI）以高死亡率為主要特征，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前預(yù)防和控制禽流感主要依靠皮下注射禽流感全病毒滅活疫苗,但此種免疫方式不能有效刺激局部黏膜免疫的產(chǎn)生，而旦皮下注射疫苗還會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物因應(yīng)激反應(yīng)造

11、成的生產(chǎn)力下降等不良后果以及人力、物力資源的花費(fèi)。禽流感病毒（Avianinfluenza疝/你，AIV）主要通過(guò)呼吸道和消化道入侵機(jī)體，黏膜免疫將更有效地阻斷禽流感病毒的入侵。口服免疫法不僅方便，還能誘導(dǎo)局部黏膜產(chǎn)生免疫應(yīng)答，更重要的是口服免疫可通過(guò)共同免疫網(wǎng)絡(luò)使其他黏膜部位產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。試驗(yàn)表明單獨(dú)應(yīng)用滅活禽流感病毒（inactivatedAvianinfluenzavirus,IAIV）抗原免疫不能有效應(yīng)對(duì)當(dāng)前流感病毒的高變異性'I。添加佐劑或免疫增強(qiáng)劑以提高魏膜免疫效果，可能是解決這個(gè)問(wèn)題的途徑之一6刃。聚乙烯亞胺（polyethyleneimine,PEI）是一種陽(yáng)離子聚

12、合物，可作為體外核酸轉(zhuǎn)染試劑和體內(nèi)DNA疫苗遞送載體1國(guó)，近年來(lái)被證實(shí)可增強(qiáng)多種疫苗尤其是黏膜免疫疫苗的免疫效果，并能顯著增強(qiáng)流感疫苗對(duì)抗流感病毒的能力方。研究發(fā)現(xiàn)PEI與抗原結(jié)合成納米復(fù)合物，通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞攝取并運(yùn)送到淋巴結(jié)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答f，4-，5o本試驗(yàn)應(yīng)用PEI配合滅活H5N1禽流感病毒口服免疫雛雞，研究雞局部和全身特異性免疫反應(yīng)以及對(duì)生長(zhǎng)性能的影響，為禽流感提供方便、安全有效的防控途徑。1材料與方法1.1材料1日齡雛雞購(gòu)于江蘇南通普民雞場(chǎng)，經(jīng)檢測(cè)禽流感血凝抑制抗體水平為5；1AIV由青島農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所提供，病毒毒株為H5N1亞型,紅細(xì)胞凝集價(jià)（HA）為10,雞胚半數(shù)致死量（ELD）

13、為IxlO717mL*；PEI購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司（相對(duì)分子質(zhì)量Mn-60000byGPC,Mw-75OOOObyLS）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗雞IgA購(gòu)自上海基峰生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG購(gòu)自南京鐘鼎生物科技有限公司;滅活H5N1禽流感油乳佐劑疫苗由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供。分別將0.8g和0.2gPEI加入0.5mL蒸偕水中，置于37X.溫箱中直至溶解，再加入2.5mL滅活禽流感病毒渦旋混勻備用。1.2動(dòng)物試驗(yàn)1日齡惟雞35只，隨機(jī)分成5組，每組7只，按表1進(jìn)行分組和免疫。首次免疫后（簡(jiǎn)稱:首免）每周每只雞翅靜脈采血,3000r-min-

14、1離心10min分離血清,-20Y保存。分別于首免后第3、5、7周，稱體質(zhì)量,然后采取口腔棉拭子，用0.2mLPBS涮洗后10000r-min-離心10min,取上清液于-20T保存。首免后第8周斷頭剖殺，1）取相同部位和&度的氣管段和空腸段，用PBS涮洗后，取涮洗液于-20T保存;2）取相同部位的空腸段和回腸派爾氏斑，用波恩氏液固定。表1動(dòng)物試驗(yàn)分組及免疫Table1Thegroupandimmunemethodinanimalexperiment分組Group免疫方法Immunemethod免疫劑MImmunedose免疫日齡DaysofageCK0.3mL生理鹽水Normalsa

15、line0.3mL10,141A1V口服免疫0.25mLIAIV(H5NI)10,14IA1V+PEI(O.O8)Oralimmunization0.08gPEI+0.25mLIAIV10,141AIV+PEK0.02)0.02gPEI+0.25ml,IAIV10,14iH皮下注射Subcutaneousinjection0.3mL滅活H5N1鴦流感油乳佐劑疫苗Inactivatedoil-adjuvantemulsionvaccine0.3mL101.3間接ELISA法測(cè)定血清和黏膜分泌物中的禽流感特異性IgG和IgA水平用1：100稀釋的IA1V抗原包被酶標(biāo)板，每孔0.1mL,4T過(guò)夜;將

16、抗原甩出，用1%BSA封閉，37T作用2h；洗滌液（PBST,pH7.4）洗滌5次，符次5min；加入待檢樣品（口腔、血清、氣管或腸道涮洗液樣品），每孔0.1mL,37X.作用1h；洗滌5次，每次5min；加HRP標(biāo)記羊抗雞lgA（l：l000）或HRP標(biāo)記兔抗雞lgG（l：500）,每孔0.1mL,37幻作用1h；洗滌5次，每次5min；加底物顯色液TMB顯色，每孔0.1mL,37丁避光作用810min；加終止液;酶標(biāo)儀讀取D攸值。用PBS代替羊抗雞IgA或兔抗雞IgG作對(duì)照。每個(gè)樣品至少重復(fù)4次。1.4血凝抑制試驗(yàn)（HI）測(cè)定血清中禽流感特異性HI抗體水平在96孔微在反應(yīng)板（V型）的111

17、孔加入0.025mLPBS,第12孔加入0.05rnLPBS。吸取0.025mL的待檢血清加入第1孔，依次倍比稀釋至第10孔，然后在第111孔均加入4HA單位禽流感（H5N1）病毒抗原0.025mL（用前混勻）。在室溫（25P）下作用30min。每孔加入0.025mL1%的雞紅細(xì)胞懸液，室溫（25T）下作用40min后觀看結(jié)果，第11孔作為4HA單位陽(yáng)性對(duì)照，第12孔為PBS陰性對(duì)照孔。以完全抑制4HA單位抗原紅細(xì)胞凝集的血清最高稀釋倍數(shù)作為該血清的血凝抑制價(jià)（HI）。1.5石蠟切片的制作和組織學(xué)觀察組織塊固定,梯度乙醇脫水，二甲苯透明，透蠟，包埋，制作4呻厚的石蠟切片，HE染色。用Olymp

18、usBH-2顯微鏡觀察并拍照。利用ipwin32系統(tǒng)測(cè)量空腸、回腸絨毛長(zhǎng)度。每試驗(yàn)組取5張切片，每張切片選取10個(gè)視野的小腸絨毛進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel2007進(jìn)行初步整理，用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)汁分析，采用單因子方差（One-WayANOVA）進(jìn)行差異顯著性分析。采用鄧肯氏法進(jìn)行多重比較。2結(jié)果與分析2.1PEI配合IAIV口服免疫對(duì)雛雞口腔棉拭子、腸道和氣管涮洗液中特異性IgA水平的影響從圖1-A中可以看出：0.08g和0.02gPEI配合0.25mLIAIV口服免疫雛雞后，第3周口腔棉拭涮洗液中特異性IgA水平顯著高于單獨(dú)口服0.25mLIAIV（P<

19、;0.05）；第5和第7周IgA水平與單獨(dú)口服0.25mLIAIV無(wú)顯著差異。從圖1-B中可以看出：0.02gPEI配合0.25mLIAIV口服免疫雛雞，小腸涮洗液中特異性IgA水平顯著高于單獨(dú)口服0.25mLIAIV、口服0.08gPE1配合0.25mLIAIV和皮下注射滅活禽流感油乳佐劑疫苗免疫雛雞（尹<0.05）；單獨(dú)口服0.25mLIAIV.0.08gPEI配合0.25mLIAIV口服和皮下注射滅活禽流感油乳佐劑疫苗免疫雛雞組間IgA水平無(wú)顯著差異。0.08gPEI配合0.25mLIAIV口服免疫雅雞后，氣管涮洗液中特異性IgA水平比單獨(dú)口服0.25mLIAIV、口服0.02gP

20、EI配合0.25mLIAIV和皮下注射滅活禽流感油乳佐劑疫苗免疫雛雞顯著下降;單獨(dú)口服0.25mLIAIV,0.02gPE1配合0.25mLIAIV口服和皮下注射圖1PEI配合IAIV口服免疫對(duì)口腔棉拭子（A）和腸道、氣管涮洗液（B）中特異性IgA水平（S/N值）的影響Fig.1TheeffectoforalimmunizationwithIAIVandPEIonthelevelofantigen-specificIgA（S/N）inmouthswab（A）andintestinal,tracheal（B）wash.P<0.05,.P<0.01.Thesameasfollows.2

21、.2PEI配合IAIV口服免疫對(duì)雛雞血清中禽流感特異性IgG和HI抗體水平的影響2.2.1血清特異性IgG水平的變化從圖2-A中可以看出：0.08g和0.02gPEI分別配合0.25mLIAIV口服免疫錐雞后，第3和第5周血清中特異性IgG水平與單獨(dú)口服IA1V無(wú)顯著差異;第7周血清中特異性IgG水平比單獨(dú)口服0.25mLIAIV極顯著升高（P<0.01）。2.2.2血凝抑制HI結(jié)果從圖2-B可以看出：0.08g和0.02gPEI配合0.25mLIAIV門(mén)服免疫雛雞后，第14周HI抗體水平逐漸降低;第5周HI抗體水平小幅上升;第7周HI抗體水平下降至0（1。&）；與單獨(dú)口服0.2

22、5mLIAIV無(wú)顯著差異。皮下注射滅活禽流感油乳佐劑疫苗免疫維雞后，第2周HI抗體水平下降至2（1。%）;第27周HI抗體水平升至7（log,）o2.3PEI配合IAIV口服免疫對(duì)體質(zhì)量、空腸和回腸絨毛長(zhǎng)度的影響2.3.1體質(zhì)量的變化從圖3-A中可以看出：隨看日齡的增加，試驗(yàn)雞體質(zhì)址逐漸增加。錐雞免疫后第1、3、7周各組間體質(zhì)量無(wú)顯著差異;第5周，單獨(dú)口服0.25mLIAIV體質(zhì)ht顯著高于口服0.08g和0.02gPE1配合0.25mLIAIV和皮下注射滅活禽流感油乳佐劑疫苗雛雞（P<0.05）o2.3.2空腸、回腸絨毛長(zhǎng)度的變化從圖3-B中可以看出：0.02gPEI配合0.25mLI

23、AIV門(mén)服免疫錐雞,比單獨(dú)口服0.25mLIAIV雛雞空腸絨毛長(zhǎng)度極顯著增長(zhǎng)（P<0.01）,Pl腸絨毛K度顯著增K（/<0.05）。SW-SIH圖2PEI配合IAIV口服免疫對(duì)血清中特異性lgG(S/N值)(A)和HI(B)抗體水平的影響Fig.2TheeffectoforalimmunizationwithIAIVandPEIonthelevelofantigen-specificlgG(A)andHl(B)inserumCl免后時(shí)間/wTimeafterfirstimmunizationCK；1A1V；!A!V+PEI(0.08)；1AIV+PE(O.O2)；iHsn=>

24、;«u=s«.£jo-£8113Em妾w歸寒Jejunum圖3PEI配合1AIV口服免疫對(duì)雛雞體質(zhì)(A)和空腸、回腸(B)絨毛長(zhǎng)度的影響Fig.3TheeffectoforalimmunizationwithIAIVandPEIonbodyweight(A),lengthsofintestinalvillusinjejunumandileum(B)IAIVIAIVIAIV+PEI(0.08)IAIV+PEI(0.02)iHAB圖4PEI配合IAIV口服免疫雛雞（7周）后空腸（A）和回腸（B）絨毛長(zhǎng)度的變化（HE染色,xl（）0）Fig.4Thechang

25、eoforalimmunizationwithIAIVandPEIonlengthofintestinalvillusinjejunum（A）andileum（B）byHEstaining3討論黏膜產(chǎn)生的主要抗體是slgAJgA分泌細(xì)胞合成IgA,在通過(guò)黏膜上皮的過(guò)程中與上皮細(xì)胞的分泌片段結(jié)合形成slgA,分泌到黏膜表面形成防御病原微生物入侵的第一道屏障口服免疫能夠在消化道和呼吸道黏膜處建立保護(hù)性免疫應(yīng)答，7-，91o陽(yáng)商子聚合物PEI與帶負(fù)電荷的抗原易形成納米復(fù)合物，促進(jìn)抗原的加.和MHCII類分子抗原遞呈,刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗原降解，增強(qiáng)免疫應(yīng)答：2。】。本試驗(yàn)應(yīng)用PE

26、I配合滅活禽流感病毒口服免疫雞,不僅激活局部黏膜免疫應(yīng)答，還能誘導(dǎo)有效的全身免疫反應(yīng)，表現(xiàn)在雞消化道中特異性slgA水平和血清中IgG抗體水平的顯著升高。推測(cè)PEI由于靜電作用可包裹滅活禽流感病毒形成復(fù)合物,促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞如樹(shù)突狀細(xì)胞穿過(guò)黏膜上皮攝取抗原，傳遞給淋巴組織'。而陽(yáng)離子聚合物PEI包裹帶負(fù)電荷的滅活禽流感病毒形成的復(fù)合物帶正電荷，會(huì)粘附在帶負(fù)電荷的消化道黏膜上皮，避免了消化液對(duì)抗原的降解，有效增強(qiáng)免疫應(yīng)答。0.08gPE1配合1AIV免疫的效果沒(méi)有0.02gPEI配合IAIV的效果好，甚至出現(xiàn)0.08gPEI配合1A1V免疫錐雞后,氣管涮洗液中特異性slgA的水平顯著降低

27、的現(xiàn)象。造成這種現(xiàn)象的原因可能是PEI具有細(xì)胞逐性，表現(xiàn)在其對(duì)細(xì)胞膜有較高的親和性,高濃度時(shí)表現(xiàn)出細(xì)胞毒性)。因此,在選用PEI作為黏膜免疫佐劑時(shí)，應(yīng)注意PEI的用量。綜上所述，PEI在低劑最(每只0.02g)使用時(shí)免疫效果更佳。本試驗(yàn)應(yīng)用佐劑PEI配合滅活禽流感病毒口服免疫雞后，H1抗體滴度變化不明顯，可能是此次試驗(yàn)選用的雛雞母源抗體較高，而具有較高母源抗體的雛雞免疫不能顯著提高HI抗體水平。腸絨毛是腸黏膜表面上皮和固有層向腸腔內(nèi)的微小突起，是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的重要功能結(jié)構(gòu)。添加免疫佐劑PEI,小腸絨毛長(zhǎng)度增加，在一定程度上可以增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，有助于機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育。機(jī)體在營(yíng)養(yǎng)適宜的條件

28、下，生長(zhǎng)發(fā)育狀況良好，免疫系統(tǒng)發(fā)育完善，保證疫苗的免疫效果，提高機(jī)體免疫力。參考文獻(xiàn)Reference:1 于康震，崔尚金,付朝陽(yáng)，等.禽流感與養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展和人類健康J.中國(guó)預(yù)防停醫(yī)學(xué)報(bào),2000,22(4):312-315.YuKZ,CuiSJ,FuCY,etal.AvianinfluenzaanddevelopmentofaviculturewithhumanhealthJj.ChineseJournalofPrevenliveVeterinaryMedicine,2000,22(4)：312-315(inChinesewithEnglishabstract).2 李彥伸，戴建君，庾慶華.孫

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