1、·基礎研究·新生大鼠心肌細胞的原代培養及鑒定胡保奎,耿召華,祝善俊,劉玉峰(第三軍醫大學新橋醫院心血管內科,重慶400037摘要目的:探討新生大鼠心肌細胞原代培養的方法,培養存活率高和純度高的心肌細胞。方法:無菌條件下取出出生1 2d 的SD 大鼠心臟,用2.5g /L 胰蛋白酶和2.0g /L 型膠原酶等量混合液在37條件下分次消化心肌組織。以差速貼壁并將時間延長至90min 純化心肌細胞,文獻標識碼:A文章編號:1009-7236(201406-654-03網絡出版地址:http :/wwwcnkinet /kcms /detail /61126820130925183

2、3006html 網絡出版時間:2013-9-2518:33基金項目:國家自然科學基金項目資助(81070093;重慶市科技攻關計劃項目資助(CSTC ,2011AC5031通訊作者:耿召華,副教授,主要從事ad 蛋白相關研究Email :gengzhhtomcom作者簡介:胡保奎,碩士生Email :641117506qqcomCulture and identification of cardiomyocytes in neonatal ratsHU Bao-kui ,GENG Zhao-hua ,ZHU Shan-jun ,LIU Yu-feng(Department of Cardio

3、logy ,Xinqiao Hospital ,Third Military Medical University ,Chongqing 400037,China AbstractAIM :To develop a method of primary culture of neonatal rat cardiomyocytes with high survival肌細胞生長所需的營養,使之穩定生長,但原代心肌細胞一般易受外界條件因素的影響存活率往往較低。心肌細胞培養技術已廣泛應用于心血管領域分子水平的研究,有助于從細胞和分子水平研究心血管系統疾病的發病機制和治療方法1,2。本研究的目的在于建立

4、一種簡單穩定、可靠的心肌細胞培養方法,以為心血管系統疾病的基礎和臨床研究奠定基礎。1材料和方法11材料新生SD 大鼠由第三軍醫大學動物實驗室提供。小牛血清和DMEM 培養基(Hyclone 公司,胰蛋白酶、型膠原酶、青霉素、磷酸鹽緩沖液及5溴-25-溴脫氧核苷尿嘧啶(Brdu ,Sigma 公司,臺盼藍(Gibco 公司。IX70型倒置顯微鏡(Olympas 株式會社。·456·心臟雜志(Chin Heart J 2013,12方法121心肌細胞的體外培養1 2d的SD大鼠,每次取10 20只,無菌操作取出心臟并剪成1mm3組織塊,以磷酸鹽緩沖液洗1次,棄帶血的上清液。用2

5、.5g/L胰蛋白酶和2.0g/L型膠原酶等量混合液在37條件下分次消化(每次10min,共7次,首次消化液棄去。收集細胞懸液,以1000g 離心10min,吸出上清液,加入含100ml/L小牛血清、100g/ml青霉素的DMEM培養液,吹打均勻后,經200目篩網過濾,于37、50ml/L CO2孵箱中差速貼壁90min。取上清液,細胞計數以1105個/ml的密度接種于6孔板中,加入0.1mmol/LBrdu抑制成纖維細胞生長,置37、50ml/L CO2孵箱中培養,48h后換液首次換液,以后隔天換液,培養7d。122心肌細胞的形態學觀察取培養不同時間的心肌細胞,在倒置顯微鏡下用光鏡觀察心肌細胞

6、隨著培養時間的不同其形態特征的變化。123心肌細胞的純度鑒定在倒置顯微鏡下觀察并計算差速貼壁純化后的心肌細胞。心肌細胞的純度以心肌細胞的陽性率(%表示,即心肌細胞數/(心肌細胞數+成纖維細胞數100%。124心肌細胞的存活率測定取培養第3天的心肌細胞懸液和4g/L臺盼藍溶液各100l并混勻。取少量細胞懸液滴在血球計數板,覆上蓋玻片,其中呈藍色的細胞為死亡細胞,未染色的細胞為活細胞。細胞存活率(%=(總心肌細胞數藍染細胞數/總心肌細胞數100%。125心肌細胞的活力分析心肌細胞培養的第3天,在倒置顯微鏡下,6孔板中每孔任意選取5個視野,每個視野任選10個細胞,于低倍鏡下計數搏動的細胞每分鐘搏動次

7、數,計算心肌細胞平均搏動頻率。2結果21心肌細胞的形態學觀察心肌細胞消化后呈圓形,培養24h后基本貼壁生長,可見少數細胞開始搏動,節律不規則,搏動微弱,細胞呈梭形或多角形,核多為1個或兩個,核仁清楚。培養48h后心肌細胞搏動增強,立體感明顯,折光性強。培養3d 后,細胞伸出偽足交織成網,形成放射狀排列的細胞簇(圖1,呈同步性收縮,搏動細胞百分率約為80% 90%。圖1培養3d的心肌細胞(200表1心肌細胞純度的測定視野1000個細胞中心肌細胞(個陽性率(% 19359352948948391291249069065895895 23心肌細胞的存活率測定任選5孔,每孔任選1個視野,于低倍鏡下計數

8、1000個細胞,計算心肌細胞的存活率(%,即平均存活率(%為(93.928%(表2。表2心肌細胞存活率培養孔1000個細胞中未染色的細胞(個存活率(% 19489482957957391591549049045970970 24心肌細胞的活力分析心肌細胞培養第3天,在倒置顯微鏡下觀察心肌細胞的平均搏動率為80 130次/min,搏動同步,收縮有力。 3討論心臟主要由心肌細胞和成纖維細胞組成,心肌細胞占心臟細胞總數的33%左右。成功地分離心肌細胞是體外培養的關鍵步驟,本實驗采用2.5g/L 胰蛋白酶和2.0g/L型膠原酶等量混合液,消化時間明顯縮短,胰蛋白酶可使細胞間的蛋白質水解,切斷細胞間的連

9、接,使細胞脫落,但其也能消化細胞膜上的蛋白成分,心肌細胞比較脆弱,容易被損傷死亡。型膠原酶主要消化細胞間質中的膠原纖維,對心肌細胞損傷小,兩者混合使用,既能減少對心肌細胞的損傷作用,又能提供消化效率,縮短消化時間。在常規消化的基礎上,本實驗進行分次消化,每次消化后,棄上清,加入含100ml/L小牛血清、100g/ml青霉素的DMEM培養液終止消化酶消化,避免酶液對細胞的持續損傷,對心肌細胞具有保護作用。第一管消化液中組織成分較多,應舍棄,可以明顯提供心肌細胞的純度。混合酶消化往往比單一酶消化能獲得好的效果,發現膠原酶和DNA酶組合使用,能達到很好的消化效果3。在消化過程中,注意控制適宜的溫度,

10、在37酶的活性較高,能獲得很好的消化效果。每次消化時間應控制在10min以內,以避免長時間消化酶對細胞的損傷作用。避免產生氣泡,因為氣泡表面的張力作用可牽拉損傷細胞。用吸管反復吹打,使細胞脫落,可縮短消化時間。心肌細胞和成纖維細胞在培養板中的貼壁速度不同,成纖維細胞比心肌細胞更容易貼壁,采用差速貼壁可純化心肌細胞,適當延長貼壁時間可提高心肌細胞分離的純度。本實驗將貼壁時間延長至90 min,獲得高純度的心肌細胞,同有關報道相一致4,5。但此種方法只適合短期培養,不適合細胞的長期培養。0.1mmol/L的Brdu可以抑制成纖維細胞,提高培養的心肌細胞純度,因其濃度過高會抑制心肌細胞生長。本實驗將

11、貼壁時間和加用Brdu 方法適當結合,獲得了很好的結果。心肌細胞培養結果受多種因素的影響,一般乳鼠出生時間越短,細胞成活率越高,本實驗選擇1 2d內的乳鼠心肌細胞培養的成活率很高。培養過程中應嚴格無菌,盡量縮短操作時間,培養液的pH 值一般應控制在7.0 7.2之間,首次換液為48h 后,以后隔天換液。共換液6次,培養7天,總之,本實驗通過改良后的培養方法,不僅操作簡單,而且心肌細胞的純度和存活率高,較以往方法不同的是,采用兩種消化酶協同分次消化,消化完立即終止消化,避免一種消化酶長時間對細胞的損傷作用,培養周期長,可動態觀察細胞生長形態變化,是一種較理想的心肌細胞原代培養方法。參考文獻:1S

12、hkryl VM,Maxwell JT,Domeier TL,et alefractoriness of sarco-plasmic reticulum Ca2+release determines Ca2+alternans in atrial myocytesJAm J Physiol Heart Circ Physiol,2012,302(11: 231023202Marshall GE,ussell JA,Tellez JO,et alemodelling of humanatrial K+currents but not ion channel expression by chronic-blockadeJPfluger Arch,2012,463(4:5375483李博,吳慧穎,樸虎林,等新生大鼠心肌細胞原代培養方法的改良J中國實驗診斷學,2012,16(2:2002034劉嘉祺,孫云云乳鼠心肌細胞原代培養方法J微量元素與健康研究,2012,29(4:465Bes S