1、慢病毒轉(zhuǎn)染人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞研究         08-07-05 15:58:00     作者：ZHANG Xu,     編輯：studa0714【摘要】  目的： 分離培養(yǎng)人骨髓來源間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)并進(jìn)行慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染研究。方法： 采取全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人骨髓MSCs。利用脂質(zhì)體法進(jìn)行慢病毒感染人骨髓MSCs。結(jié)果： 分離培養(yǎng)出人骨髓來源的MSCs，并用

2、攜帶綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的慢病毒成功感染人骨髓MSCs。結(jié)論： 獲得人骨髓MSCs并進(jìn)行慢病毒載體介導(dǎo)的基因修飾，為間質(zhì)干細(xì)胞基因工程和組織工程研究奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  間質(zhì)干細(xì)胞; 慢病毒; 轉(zhuǎn)染Abstract  Objective: To isolate and culture mesenchymal stem cells（MSCs） derived from human bone marrow and transfect the cells by lentiviral vectors.Methods： The tissue adherent cul

3、ture method was used to isolate MSCs from human bone marrow. The MSCs were transfected by lentiviral vectors using lipofectamine 2000. Results： Human bone marrow MSCs were successfully isolated and efficiently transfected by EGFP-expressing lentiviral vectors. Conclusion： Human bone marrow MSCs have

4、 been  transfected by lentivirus, which will play a role in researching on the function of MSCs in gene and tissue engineering.Key words  mesenchymal stem cells； lentiviral vector;  transfection間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于多種組織，主要包括骨髓、脂肪組織、骨骼肌、肝臟、臍血及外周血等，骨髓是最常用的MSCs體外分離培養(yǎng)的組織來源

5、。MSCs增殖能力強，體內(nèi)外均具有多向分化潛能，基因修飾后保持原有多潛能性的同時可持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)外源基因；體外轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)一段時間移植至體內(nèi)仍可存活，并能夠遷移至病變部位,因而其成為基因治療研究領(lǐng)域令人關(guān)注的靶細(xì)胞1。因此，本研究從人骨髓組織中分離培養(yǎng)出MSCs并體外擴(kuò)增用于慢病毒轉(zhuǎn)染，為進(jìn)一步利用MSCs進(jìn)行基因治療奠定基礎(chǔ)。1  材料與方法1.1  標(biāo)本和主要試劑  成人骨髓（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院），慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)FUGW，pCMVR-delta8.9和VSVG（上海醫(yī)學(xué)遺傳所惠贈），人胚腎293 T（本實驗室保存），胎牛血清和L-DMEM（Gibco公司），胰蛋白

6、酶（Sigma公司），lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司），Polybrene（Sigma公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），RT-PCR試劑盒（Toyobo公司），PCR試劑（Takara公司），質(zhì)粒提取試劑盒（Axygen公司），限制性內(nèi)切酶BamH和EcoR（NEB公司）。引物設(shè)計采用primer premier 5.0軟件，由上海生物工程有限公司合成。1.2  主要儀器  二氧化碳培養(yǎng)箱（Forma公司），Beckman SW28 Rotor超速離心機(jī)（Beckman公司），PCR儀（Thermo Hybaid

7、公司），流式細(xì)胞儀(FACS Calibur, BD公司)，倒置式生物顯微鏡(TE300, Nikon公司)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿（Corning公司）。1.3  方法表1  PCR引物序列（略）Tab 1  Primer sequences for PCR2  結(jié)果2.1  人骨髓MSCs分離培養(yǎng)和表面標(biāo)志  全骨髓組織原代貼壁培養(yǎng)5 d后，倒置顯微鏡下觀察見單個或少量集落生長的貼壁細(xì)胞，呈短梭形或針尖狀。隨細(xì)胞培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞集落不斷地擴(kuò)大并形成融合單層，細(xì)胞形態(tài)大多呈長梭形或多角形(圖1)。流式分析顯示CD13，CD29， CD44，CD105，HLA-表達(dá)陽性，CD31，CD34，HLA-DR陰性表達(dá)(圖2)，表明獲得人骨髓來源的MSCs。(a) 骨髓組織原代培養(yǎng)第7天(×100)   (b) 骨髓組織原代培養(yǎng)第7天(×200)圖1  人骨髓MSCs的形態(tài)學(xué)特征（略）Fig 1  Morphological characteristic of humanbone marrow MSCs依次為CD13，CD29，