1、DNA芯片技術的原理與應用 主要內容 DNA芯片技術的概況DNA芯片技術的應用概況存在的一些問題及展望1 DNA芯片技術的一些概況 DNA芯片也稱DNA微陣列,是生物芯片的一種。基因芯片原理最初是由核酸的分子雜交衍生而來的,即應用已知序列的核酸探針對未知序列的核酸序列進行雜交檢測1.1 DNA芯片技術的概念和基本原理 DNA芯片技術，實際上就是一種大規模集成的固相雜交，是指在固相支持物上原位合成( situ synthesis)寡核苷酸或者直接將大量預先制備的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標記的樣品雜交。通過計算機對雜交信號的檢測分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表

2、達的信息)。由于常計算機硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。 基因芯片制備及檢測流程是利用原位合成法或將已合成好的一系列寡核苷酸以預先設定的排列方式固定在固相支持介質表面,形成高密度的寡核苷酸的陣列,樣品與探針雜交后,由特殊的裝置檢出信號,并由計算機進行分析得到結果。原理如下圖：基因芯片電子芯片集成電子線路集成分子線路近7(2011.9前)年來公開發表的與基因芯片相關的學術論文1.2 DNA芯片分類 據不同分類標準,DNA芯片的分類如下: v(1)根據固相支持物的不同,DNA芯片分為無機無機(玻璃、硅片、 陶瓷等)和有機有機(聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等)芯片。v(2)根據芯片上所用

3、探針不同分為寡核苷酸芯片寡核苷酸芯片和cDNA 芯片芯片。v(3)根據芯片點樣方式不同,可分為原位合成芯片原位合成芯片、微矩陣芯微矩陣芯片片(分噴點和針點)和電定位芯片電定位芯片3類。v(4)根據用途的不同分類為基因表達芯片基因表達芯片和基因測序芯片基因測序芯片。1.3 DNA芯片的優點 作為新一代基因診斷技術，DNA芯片的突出特點在于快速、高效、敏感、經濟，平行化、自動化等，與傳統基因診斷技術相比，DNA芯片技術具有明顯的優勢： （1）快速準確 （2） 檢測效率高 （3）基因診斷的成本降低。 （4）自動化程度高 （5） 避免了交叉感染 （6）多功能 （7）高度的平行性DNA芯片技術的步驟DN

4、A芯片的制備光蝕刻合成法 電壓印刷法 點樣法 樣品的制備 雜交 雜交圖譜的檢測和讀出 為了提高結果的準確性，來自血液或組織中的DNA/mRNA樣本須先行擴增，然后再被熒光素或同位素標記成為探針。雜交條件的選擇要根據芯片上核酸片段的長短及其本身的用途來定。激光共聚焦熒光檢測系統 CCD攝像原理 檢測系統質譜法 1.4 DNA芯片的制備過程1.4.1 DNA芯片的制備 原位合成法原位合成法(in situ synthesis)借鑒半導體照相借鑒半導體照相平版印刷技術平版印刷技術,在固相載體上原位合成寡核苷酸探在固相載體上原位合成寡核苷酸探針序列。主要有光蝕刻法及壓電印刷法。針序列。主要有光蝕刻法及

5、壓電印刷法。 光蝕刻法基本過程為光蝕刻法基本過程為:光有選擇地照射到有光掩蔽光有選擇地照射到有光掩蔽劑保護的玻璃片上劑保護的玻璃片上,以去掉玻璃片上的光敏集團以去掉玻璃片上的光敏集團,激激活活DNA合成過程合成過程,在去掉光敏集團的特定部位偶聯在去掉光敏集團的特定部位偶聯一個光保護堿基一個光保護堿基,再將第二個光掩蔽劑置于這個受再將第二個光掩蔽劑置于這個受光保護的堿基上光保護的堿基上,如此不斷地去保護和偶聯如此不斷地去保護和偶聯,就可以就可以得到寡核苷酸片斷得到寡核苷酸片斷,許多這樣的不同序列的片段就許多這樣的不同序列的片段就構成了構成了DNA方陣。方陣。 原位合成原位合成(In Situ S

6、ynthesis)Light directed oligonucleotide synthesis.A s o l i d s u p p o r t i s derivatized with a covalent linker molecule terminated w i t h a p h o t o l a b i l e protecting group. Light is directed through a mask to deprotect and activate s e l e c t e d s i t e s , a n d protected nucleotides

7、couple to the activated sites. The process is repeated, activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be constructed at each site.光定向合成寡核苷酸 壓電印刷法的基本原理類似于目前采用壓電印刷法的基本原理類似于目前采用的噴墨打印機的噴墨打印機:打印頭在方陣上移動打印頭在方陣上移動,在方在方陣每點上電流使噴頭放大陣每點上電流使噴頭放大,并將裝有機某并將裝有機某種堿基的

8、試劑滴在晶片表面種堿基的試劑滴在晶片表面,然后固定然后固定,在在洗脫和去保護后另一輪寡核苷酸的延伸洗脫和去保護后另一輪寡核苷酸的延伸就可以繼續進行。壓片印刷法由于不需就可以繼續進行。壓片印刷法由于不需要與載體表面直接接觸要與載體表面直接接觸,故有很高的效率故有很高的效率,但制造工藝還不太成熟。但制造工藝還不太成熟。噴墨打印技術噴墨打印技術離片合成法離片合成法(off-chip synthesis)首先利用各種方首先利用各種方法制備出寡核苷酸探針，再由具有多個微細加樣法制備出寡核苷酸探針，再由具有多個微細加樣孔的陣列復制器孔的陣列復制器(arraying and replicating devi

9、ce,ARD)及由電腦控制的機器將探針按一定的及由電腦控制的機器將探針按一定的順序固定在固相載體表面，再由紫外交線交聯固順序固定在固相載體表面，再由紫外交線交聯固定后得到定后得到DNA方陣。方陣。該方法優點是芯片制造速度快該方法優點是芯片制造速度快,成本低成本低,而且芯片之而且芯片之間制造誤差小。其缺點是與原位合成法相比間制造誤差小。其缺點是與原位合成法相比,構成構成方陣的方陣的DNA片段需要先合成、純化，以及在制造片段需要先合成、純化，以及在制造DNA芯片前必須將如此大量具有微小差別的片段芯片前必須將如此大量具有微小差別的片段分別保存分別保存,并且需要特制的自動點樣裝置。并且需要特制的自動點

10、樣裝置。 點樣法 即預先合成寡核苷酸，肽核苷酸或分離得到cDNA，再通過點樣機直接將其點到芯片上。寡核苷酸或肽核苷酸的合成主要是通過多孔玻璃合成法。肽核苷酸雖然在制備上比較復雜，但是它與DNA探針相比，由于PNA（肽核酸）與DNA結合的復合物更加穩定和特異，因而更加有利于單堿基錯配基因的檢測。 來自某一細胞的cDNA必須進行預處理，純化，擴增以及分類，然后再利用機械手把它們準確地固定在基板的相應位置上，為了保證cDNA芯片檢測的準確性，在制備cDNA芯片以前必須提高低表達基因cDNA的豐度，降低高表達基因cDNA的豐度。1.4.2 樣品的制備 樣品的制備包括：樣品的分離純化，擴增，標樣品的制備

11、包括：樣品的分離純化，擴增，標記記 分離純化：樣品來源于活的細胞，使用一定方分離純化：樣品來源于活的細胞，使用一定方法分離并純化法分離并純化DNA或或RNA（特別是（特別是mRNA）。）。只有達到一定純度的樣品，才能保證后續操作只有達到一定純度的樣品，才能保證后續操作的正確。的正確。 樣品的擴增：擴增的目的在于獲得足夠的樣品的擴增：擴增的目的在于獲得足夠的樣品量。現已發展出固相樣品量。現已發展出固相PCR系統。系統。樣品的標記：主要采用熒光標記法，也可樣品的標記：主要采用熒光標記法，也可用生物素，或放射性核標記。標記的方式用生物素，或放射性核標記。標記的方式采用采用PCR或或RT-PCR。常用

12、的熒光色素為。常用的熒光色素為Cy3、Cy5。用。用Cy3、Cy5標記標記dNTP，經，經PCR后，產物即可被標記。待測樣品和對后，產物即可被標記。待測樣品和對照可采用雙色熒光標記。照可采用雙色熒光標記。1.4.3 分子雜交分子雜交芯片的雜交：將已知序列的芯片的雜交：將已知序列的DNA探探針顯微固化于支持物表面，將已標記針顯微固化于支持物表面，將已標記好的樣品與之進行雜交，雜交過程一好的樣品與之進行雜交，雜交過程一般在般在30分鐘完成。分鐘完成。電子基因芯片：雜交速度更快。電子基因芯片：雜交速度更快。采用肽核酸（采用肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）探針可消除）探針可消

13、除DNA二級結構的二級結構的影響。影響。1.4.4 遺傳信息檢測原理：待測樣品與支持物上探針列陣雜交后，熒光標原理：待測樣品與支持物上探針列陣雜交后，熒光標記的樣品結合在芯片的特定位置，未結合的探針被除記的樣品結合在芯片的特定位置，未結合的探針被除去；樣品與探針嚴格配對的雜交分子，熱力學穩定性去；樣品與探針嚴格配對的雜交分子，熱力學穩定性高，產生的熒光信號強，不完全配對的，熒光信號弱；高，產生的熒光信號強，不完全配對的，熒光信號弱；不能雜交不產生熒光信號。不能雜交不產生熒光信號。分析：采用激光掃描或激光共聚焦顯微鏡采集雜交信分析：采用激光掃描或激光共聚焦顯微鏡采集雜交信號（位置、強度、顏色），

14、并與對照比較，經相關軟號（位置、強度、顏色），并與對照比較，經相關軟件進行圖像和數據處理。即可得也待測樣品的信息。件進行圖像和數據處理。即可得也待測樣品的信息。經以上獲得的數據十分龐大，還需進行分析，比較，經以上獲得的數據十分龐大，還需進行分析，比較，歸納，才能得出明晰的結論。歸納，才能得出明晰的結論。 DNA芯片的應用領域科學研究臨床疾病診斷環境檢測藥物研究開發法醫學鑒定動植物檢疫食品檢測軍事應用健康管理運動醫學2 DNA芯片的應用概況2.1 基因表達的分析與檢測 將不同條件下某生物體中轉錄出的mRNA標記后與代表它所有基因而制成的DNA芯片雜交,通過分析雜交位點及其信號強弱,就可得出不同條

15、件下各基因的表達情況,還可鑒定出某些未知功能基因,發現新基因,這一應用目前已成為DNA芯片研究中的一個重點和熱點。 DNA芯片具有高度的敏感性和特異性，可自動、快速地同時檢測成千上萬個基因的表達，基因表達的分析研究有利于揭示不同層次上多基因協同作用的生命過程。應用cDNA表達譜芯片對大鼠心臟生長發育及損傷過程中基因表達的改變進行了研究。心臟從胚胎到成年的發育過程中基因表達發生了明顯的變化，在1075點芯片上，以成年心臟作為對照，胚胎期的差異表達基因多于初生期的差異表達基因，而在胚胎期中的第13天差異表達最明顯，然而當出現心肌肥厚和心力衰竭時，有些在心臟發育期才表達的基因重新被表達，這說明壓力負

16、荷誘發的基因表現型與心臟生長發育的基因表現型有某種關聯。 2.2 基因突變及多態性的檢測 將DNA芯片技術用于檢測分子突變，能準確地確定突變位點和突變類型，檢測多個基因乃至整個基因組的突變。Hacia等采用含有96000個寡核苷酸探針芯片研究遺傳性乳腺癌和卵巢癌易感基因BRCA1外顯子11位點可能發生的突變，結果在15例患者樣品中檢測到14例患者存在不同的突變（包括點突變、插入、缺失等突變），而在20個對照樣品中均沒出現假陽性，同時還檢測出了8個單核苷酸多態（SNP）。在多態性研究方面，Kozal等應用基因芯片研究未曾接觸蛋白質酶抑制劑的HIV患者中HIVlclade蛋白質酶多態，總共分析了1

17、14例樣本，發現蛋白質酶基因存在很大程度的多態性，所示結果與sanger法檢測結果一致性達98%。 2.3 測序通過與一組已知序列的寡核苷酸探針雜交，利用雜交譜來重建待測DNA序列，該技術為大規模測序提供了方便、快捷、準確的手段，同時也有助于了解基因表達模式、基因突變和多態性，發現新基因以及克隆特異性基因。利用固定的探針與生物樣品的靶序列進行分子雜交,得到特定的雜交圖譜,進而分析出待測樣品的序列,稱為雜交測序(Sequencing by hybridization, SBH)。Chee等人用含135000個核苷酸探針（每個探針的長度為25個核苷）的陣列測定了全長為16.6kb的人線粒體基因序列

18、，準確率達99%。采取樣本核酸提取樣品標記反轉錄擴增放大雜交反應洗脫讀取信息，診斷結果2.4 在臨床上的應用2.4.1疾病診斷人類的疾病與遺傳基因密切相關，通過分析比較正常人和病人的基因表達圖譜的差異可以得出病變的基因信息，大規模篩查出由基因突變引起的疾病，目前DNA芯片已被廣泛應用于癌癥相關基因突變的快速檢測。Moch等用532個腎癌組織標本構建了5184點cDNA表達譜芯片，通過與正常腎組織進行比較，在癌細胞中篩選出89條基因差異表達，其中有一條編碼波形蛋白基因，利用免疫組織化學技術對這條波形蛋白基因表達進行研究，發現它與患者的預后呈顯著的負相關，而與腫瘤的分級和分期無關。 基因芯片藥物篩

19、選是指通過用藥前后表達譜的變化找出靶基因及受靶基因調控的基因是否恢復到正常狀態,并且用基因芯片作大規模的藥物篩選研究可以省略大量的動物試驗,縮短藥物篩選所用的時間。現代藥物篩選中,對藥物篩選影響更直接的是藥物作用新靶的發現,而這些新靶一般是由新發現的基因編碼的,因而目前大部分研究人員以基因為基礎的藥物研究過程是:基因組-新靶點篩選。先導物-藥物,即基因-受體-藥物。2.4.2 藥物篩選藥物篩選 近年來,根據組合化學理論設計的各種化合物文庫開始用于藥物篩選,其中可放大的生物文庫的建立和應用,以及高通量自動化藥物篩選技術的出現,意味著大批量的化合物可以在很短時間內快速地進行篩選。應用芯片技術對生物

20、文庫進行藥物篩選,其基本原理是在芯片或合成珠等固相表面上進行原位文庫合成和篩選。 2.4.3 DNA芯片在乙型肝炎病毒基因突變分芯片在乙型肝炎病毒基因突變分析中的應用析中的應用 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒(HBV)為一部分雙鏈為一部分雙鏈DNA病毒，主要引起病毒，主要引起急、慢性肝炎急、慢性肝炎,部分反復感染的患者可發展成肝炎、肝硬部分反復感染的患者可發展成肝炎、肝硬化或肝癌。化或肝癌。HBV在復制過程中由于有逆轉錄過程的參與，在復制過程中由于有逆轉錄過程的參與，因而較其他因而較其他DNA病毒更容易發生突變，目前研究較多且病毒更容易發生突變，目前研究較多且臨床意義較為明確的突變是臨床意義較為明確

21、的突變是HBV前前C區區1 896位、基本核位、基本核心啟動子心啟動子(BCP)區區1 762、1 764位以及聚合酶基因位以及聚合酶基因P區區528位、位、552位突變。位突變。 王永忠等應用膜顯色王永忠等應用膜顯色DNA芯片法同時檢測這些位芯片法同時檢測這些位點突變點突變,實驗結果顯示，實驗結果顯示，HBsAg+、HBeAg+、HBeAb-的患者病毒沒有變異；的患者病毒沒有變異；HBsAg+、HBeAg-、HBeAb+的患者的患者HBV前前C區區1 896位、位、BCP區區1 762、1 764位變異較多；位變異較多；HBsAg+、HBeAg+、HBeAb+的患者的患者HBV前前C區區1

22、896位變位變異低于異低于“小三陽小三陽”患者，而患者，而BCP區區1 762、1 764全部發生了變異。接受拉米夫定治療全部發生了變異。接受拉米夫定治療48周后周后HBVDNA陽性患者中，陽性患者中，HBV P區基因變異較多區基因變異較多,實驗結果表明實驗結果表明,膜顯色膜顯色DNA芯片法用于乙型肝炎芯片法用于乙型肝炎病毒基因突變分析，簡便、快速、特異性好。病毒基因突變分析，簡便、快速、特異性好。2.4.4 DNA芯片用于腫瘤基因表達的芯片用于腫瘤基因表達的研究研究 DNA芯片為研究腫瘤發生發展中的基因芯片為研究腫瘤發生發展中的基因開關及表達程度提供了強有力的工具，開關及表達程度提供了強有力

23、的工具，利用它可隨時獲取腫瘤細胞生長各期與利用它可隨時獲取腫瘤細胞生長各期與腫瘤生長相關基因的表達模式腫瘤生長相關基因的表達模式,因此基因因此基因芯片技術被大量用于腫瘤基因表達的研芯片技術被大量用于腫瘤基因表達的研究。究。Derisi等應用等應用DNA芯片技術檢測了芯片技術檢測了腫瘤抑制相關基因的表達腫瘤抑制相關基因的表達,把人把人6號染色號染色體轉導入人黑色素瘤細胞株體轉導入人黑色素瘤細胞株,該瘤的致病該瘤的致病性被抑制。性被抑制。 2.4.5 DNA芯片在人白細胞抗原芯片在人白細胞抗原A19組基組基因快速分型中的應用研究因快速分型中的應用研究 血清學分型是人白細胞抗原血清學分型是人白細胞抗

24、原A位點位點(HLA-A)的經的經典分型方法，而此方法的交叉反應，尤其是典分型方法，而此方法的交叉反應，尤其是HLA-A19分裂子之間較強的交叉反應分裂子之間較強的交叉反應,及淋巴細及淋巴細胞膜抗原的弱表達，常常產生分型技術難點和胞膜抗原的弱表達，常常產生分型技術難點和判斷誤差，并直接影響器官移植效果。李成濤判斷誤差，并直接影響器官移植效果。李成濤等利用等利用DNA芯片技術芯片技術,根據根據HLA-A位點不同基因位點不同基因亞型的獨特序列設計探針亞型的獨特序列設計探針,制成分型芯片；待檢制成分型芯片；待檢測樣品經聚合酶鏈反應測樣品經聚合酶鏈反應(PCR)標記上熒光之后標記上熒光之后,與芯片進行

25、雜交與芯片進行雜交,根據雜交產生的熒光信號值，根據雜交產生的熒光信號值，分析確定樣品分析確定樣品A位點的基因亞型。位點的基因亞型。 2.4.6 DNA芯片用于細菌分型芯片用于細菌分型v利用基因芯片技術對致病菌基因組利用基因芯片技術對致病菌基因組DNA、rRNA進行遺傳分析進行遺傳分析,從而能夠計算出細菌種屬從而能夠計算出細菌種屬間的遺傳距離或者分析和判斷菌體的毒性等。間的遺傳距離或者分析和判斷菌體的毒性等。有研究者建立了一張空腸彎曲菌基因組芯片有研究者建立了一張空腸彎曲菌基因組芯片,與與不同的致病菌基因組不同的致病菌基因組DNA雜交雜交,結果顯示被檢結果顯示被檢測的測的11種致病菌基因組種致病

26、菌基因組DNA中中21%基因沒有雜基因沒有雜交信號交信號,說明這些基因在被檢細菌基因組中存在說明這些基因在被檢細菌基因組中存在高度的差異性。高度的差異性。2.4.7 DNA芯片在男科學研究中的應用芯片在男科學研究中的應用 睪丸是合成雄激素和產生精子的主要器官睪丸是合成雄激素和產生精子的主要器官,但是睪丸組但是睪丸組織的不同發育階段及其內在的生精過程所表達基因的織的不同發育階段及其內在的生精過程所表達基因的研究目前還知之甚少。研究目前還知之甚少。Sha等利用人睪丸等利用人睪丸cDNA文庫構文庫構建了含有建了含有9 216個克隆的人睪丸個克隆的人睪丸cDNA芯片芯片,用于鑒別人用于鑒別人胚胎睪丸和

27、成人睪丸組織差異表達的基因譜胚胎睪丸和成人睪丸組織差異表達的基因譜,得到得到731個個在人胚胎睪丸和成人睪丸中差異表達的基因在人胚胎睪丸和成人睪丸中差異表達的基因,其中已知其中已知的基因是的基因是54個個,在這在這54個基因中個基因中18. 52%已被以前的研究已被以前的研究證實為精子發生所特有。這個結果也證實了用睪丸芯證實為精子發生所特有。這個結果也證實了用睪丸芯片鑒別睪丸功能相關基因的可行性。片鑒別睪丸功能相關基因的可行性。 2.4.8 DNA芯片在法醫學的應用芯片在法醫學的應用 法醫檢驗中可以用DNA芯片分析SNPs位點,從而鑒定親子關系和個人識別。美國Nanogen公司研制出SNPs分析的主動式電磁DNA芯片,可以在幾分鐘內完成檢測,能適應法醫檢驗的要求。Gabriel等用27條探針的DNA芯