1、實(shí)驗(yàn)七 測定細(xì)菌生長曲線一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解細(xì)菌生長曲線特征，測定細(xì)菌繁殖的代時；2. 學(xué)習(xí)液體培養(yǎng)基的配制以及接種方法；3. 反復(fù)練習(xí)無菌操作技術(shù)；4. 了解不同細(xì)菌，不同接種方法在同一培養(yǎng)基上生長速度的不同；5. 掌握利用細(xì)菌懸液混濁度間接測定細(xì)菌生長的方法二、 實(shí)驗(yàn)原理將一定量的細(xì)菌接種在液體培養(yǎng)基內(nèi)，在一定條件下培養(yǎng)，可觀察到細(xì)菌的生長繁殖有一定的規(guī)律性，如以細(xì)菌的活菌數(shù)的對數(shù)作縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間作橫坐標(biāo)，可繪成一條曲線，成為生長曲線（如圖一）。 圖一 微生物生長曲線示意圖單細(xì)胞微生物的發(fā)酵具有四個階段，即調(diào)整期（延滯期）、對數(shù)期（生長旺盛期）、平衡期（穩(wěn)定期）、死亡期（衰亡期）。

2、生長曲線可表示細(xì)菌從開始生長到死亡的全過程的動態(tài)。不同的微生物有不同的生長曲線，同一種微生物在不同的培養(yǎng)條件下，其生長曲線也不一樣。因此，測定微生物的生長曲線對于了解和掌握微生物的生長規(guī)律是很有幫助的。測定微生物生長曲線的方法很多，有血球計(jì)數(shù)板法、平板菌落計(jì)數(shù)法、稱重法和比濁法等。本實(shí)驗(yàn)采用比濁法測定，由于細(xì)菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用分光光度計(jì)測定細(xì)菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。將所測得的光密度值（OD600）與其對應(yīng)的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。注意，由于光密度表示的是培養(yǎng)液中的總菌數(shù)，包括活菌與死菌，因此所測定的生長曲線的衰亡期不明顯。從生長曲線我們可

3、以算出細(xì)胞每分裂一次所需要的時間，即代時，以G表示。其計(jì)算公式為： 式中t1和t2為所取對數(shù)期兩點(diǎn)的時間；W1和W2分別為相應(yīng)時間測得的細(xì)胞含量（g/L）或OD。三、 實(shí)驗(yàn)儀器、材料和用具1. 實(shí)驗(yàn)材料:大腸桿菌，枯草桿菌菌液及平板；2. 培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基3. 實(shí)驗(yàn)儀器:取液器(5000ul, 1000ul 各一支);培養(yǎng)箱, 搖床，722s分光光度計(jì)；4. 實(shí)驗(yàn)用具:無菌1000ul吸頭80個;無菌5000ul吸頭2個;比色皿9個+共用參比杯一個.四、 實(shí)驗(yàn)步驟1. 準(zhǔn)備菌種：將細(xì)菌接種到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)18h，另外準(zhǔn)備單菌落平板各1塊2. 分為

4、三個小組： 第（1）小組取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基, 37 200rpm取3.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37 200rpm取5.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37 200rpm第（2）小組 取一個大腸桿菌菌落接種到100ml培養(yǎng)基， 37 200rpm取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37 110rpm取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培養(yǎng)基， 30 200rpm第（3）小組 取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基， 37 200rpm取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基， 30 200rpm取1.0ml枯草桿菌接種到1

5、00ml培養(yǎng)基， 37 110rpm每培養(yǎng)一小時取樣一次(2.5h,3.5h加測1次). 對照組測量起始pH,所有瓶子測量發(fā)酵9h結(jié)束測pH. 3. 測量：選用600nm波長，以蒸餾水作為參比，開始培養(yǎng)前測定每組培養(yǎng)液的OD值作為起始點(diǎn)。開始培養(yǎng)后，每小時吸取測定一次OD值。 五、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：表一 三個小組時間-OD數(shù)據(jù)開始取樣時間10:5512:0112:3913:1713:53結(jié)束取樣時間9:5511:0112:0912:4713:2313:59發(fā)酵時間0122.533.5ODt大腸桿菌單菌落0.0040.0240.0270.0270.0250.03637110rpm-

6、0.0100.0490.1640.2550.3120.32730200rpm-0.0100.0430.0880.1580.2420.3611.0mL0.0100.0700.1580.2660.3720.4363.0mL0.0390.0960.2570.3730.4200.4515.0mL0.0670.1340.3020.3610.3340.456枯草桿菌37200rpm0.0080.0230.0760.1320.1840.25430200rpm0.0130.0320.0520.0880.0910.12537110rpm0.0070.0170.0980.1300.2300.253OD=ODt-O

7、D0大腸桿菌單菌落0.0040.0200.0230.0230.0210.03237110rpm-0.0100.0590.1740.2650.3220.33730200rpm-0.0100.0530.0980.1680.2520.3711.0mL0.0100.0600.1480.2560.3620.4263.0mL0.0390.0570.2180.3340.3810.4125.0mL0.0670.0670.2350.2940.2670.389枯草桿菌37200rpm0.0080.0150.0680.1240.1760.24630200rpm0.0130.0190.0390.0750.0780.1

8、1237110rpm0.0070.0100.0910.1230.2230.246開始取樣時間14:2915:3516:4317:5018:5719:0720:12結(jié)束取樣時間14:3515:4316:5017:5719:0920:0721:12發(fā)酵時間45678910ODt大腸桿菌單菌落0.0650.2670.3950.4540.45737110rpm0.3330.3400.3420.3600.36230200rpm0.4390.5660.5700.5880.5861.0mL0.4640.4460.4460.4580.4403.0mL0.4870.4700.4570.4830.4585.0mL

9、0.4690.4570.4640.4820.478枯草桿菌37200rpm0.3370.4280.5170.5900.6860.7110.71130200rpm0.1710.2610.3700.5400.6280.6060.65237110rpm0.2950.3020.3050.3050.3520.3520.378OD=ODt-OD0大腸桿菌單菌落0.0610.2630.3910.4500.45337110rpm0.3430.3500.3520.3700.37230200rpm0.4490.5760.5800.5980.5961.0mL0.4540.4360.4360.4480.4303.0m

10、L0.4480.4310.4180.4440.4195.0mL0.4020.3900.3970.4150.411枯草桿菌37200rpm0.3290.4200.5090.5820.6780.7030.70330200rpm0.1580.2480.3570.5270.6150.5930.63937110rpm0.2880.2950.2980.2980.3450.3450.3712. 作圖、簡要分析及代時計(jì)算：1） 取一個大腸桿菌菌落接種到100ml培養(yǎng)基， 37 200rpm圖一 單菌落大腸桿菌生長曲線 這條曲線屬于比較標(biāo)準(zhǔn)的“S”形曲線，很容易看出調(diào)整期和對數(shù)期，由于單菌落菌較少，而且從固體培

11、養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基環(huán)境變化較大，所以出現(xiàn)了長達(dá)4小時的調(diào)整期，但可以看出，調(diào)整期之后這瓶菌都生長良好。計(jì)算代時：取培養(yǎng)4小時到5小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計(jì)算代時。由代時計(jì)算公式，t2t1=1h W1=0.061 W2=0.263代時 2） 取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37 110rpm 圖二 大腸桿菌菌生長曲線（取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，37 110rpm）接種后幾乎沒有調(diào)整期出現(xiàn)，大腸桿菌很快適應(yīng)了新的環(huán)境并開始呈指數(shù)增長，估計(jì)是新的培養(yǎng)環(huán)境和原有環(huán)境較一致，而且在培養(yǎng)最初的時候溶氧和酸堿度都較為適宜，但是這瓶菌是穩(wěn)定期OD最小的，估計(jì)是培養(yǎng)基最

12、初分裝不均產(chǎn)生的。計(jì)算代時：取培養(yǎng)2小時到2.5小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計(jì)算代時。由代時計(jì)算公式，t2t1=0.5h W1=0.174 W2=0.265代時 3） 取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，30 200rpm圖三 大腸桿菌生長曲線（取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，30 200rpm）可以看出溫度對大腸桿菌適應(yīng)環(huán)境產(chǎn)生了一定的影響，使它在調(diào)整期滯留了較長的時間，且在對數(shù)期增長較慢，應(yīng)該是酶活性對細(xì)胞復(fù)制的影響所致。計(jì)算代時：取培養(yǎng)2.5小時到3.5小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計(jì)算代時。由代時計(jì)算公式，t2t1=1h W1=0.168 W2=0.371代時

13、 4） 取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基, 37 200rpm圖四 大腸桿菌生長曲線（取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培養(yǎng)基, 37 200rpm）這是大腸桿菌培養(yǎng)的最適調(diào)節(jié)，可以看出其生長良好，調(diào)整期較短，對數(shù)期較長。計(jì)算代時：取培養(yǎng)2小時到3小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計(jì)算代時。由代時計(jì)算公式，t2t1=1h W1=0.148 W2=0.362代時 5） 取3.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37 200rpm 圖五 大腸桿菌生長曲線（取3.0ml大腸桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，37 200rpm）接種量的增加沒有產(chǎn)生太大的影響，生長曲線沒有太大變化。計(jì)算代時

14、：取培養(yǎng)2小時到2.5小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計(jì)算代時。由代時計(jì)算公式，t2t1=0.5h W1=0.218 W2=0.334代時 6） 取5.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37 200rpm圖六 大腸桿菌生長曲線（取5.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37 200rpm）3小時出現(xiàn)了一次明顯的波動，應(yīng)該是測量過程中沒有搖勻的結(jié)果，忽略它之后，這條生長曲線屬于正常形態(tài)，比較前兩天生長曲線，發(fā)現(xiàn)5mL得到的最大OD反而減小了，說明在一定量的培養(yǎng)基下，初始接種量對最后結(jié)果影響不大。最大OD應(yīng)該是受到了最初添加培養(yǎng)基的影響。計(jì)算代時：取培養(yǎng)1小時到2小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生

15、長期）來計(jì)算代時。由代時計(jì)算公式，t2t1=1h W1=0.067 W2=0.235代時 7） 取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基， 37 200rpm圖七 枯草桿菌生長曲線（取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基， 37 200rpm）枯草桿菌的生長曲線包含了調(diào)整期、對數(shù)期和很小一部分穩(wěn)定期，雖然穩(wěn)定期很短，但是已經(jīng)可以看出停止生長的趨勢，說明枯草桿菌的代時較長。計(jì)算代時：取培養(yǎng)3小時到4小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計(jì)算代時。由代時計(jì)算公式，t2t1=1h W1=0.176 W2=0.246代時 8） 取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基， 30 200rpm圖八 枯草桿

16、菌生長曲線（取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基， 30 200rpm）溫度降低后，生長變得緩慢了，最后達(dá)到的最大OD也更小了，代時加長。計(jì)算代時：取培養(yǎng)4小時到5小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計(jì)算代時。由代時計(jì)算公式，t2t1=1h W1=0.158 W2=0.248代時 9） 取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基， 37 110rpm圖九 枯草桿菌生長曲線（取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基， 37 110rpm）4小時時，似乎由對數(shù)期進(jìn)入了穩(wěn)定期，但是對比前兩組數(shù)據(jù)，此時的OD值明顯偏小，所以分析，可能此時突然有外因影響，使細(xì)胞進(jìn)入了調(diào)整期，可以看到后來7、8小時左右

17、細(xì)菌又有增長趨勢。計(jì)算代時：取培養(yǎng)2.5小時到3小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計(jì)算代時。由代時計(jì)算公式，t2t1=1h W1=0.123 W2=0.223代時 3. 發(fā)酵結(jié)束pH對照組pH=7.5實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有瓶pH均小于6.4pH全部降低，說明大腸桿菌和枯草桿菌發(fā)酵均產(chǎn)生了酸。4. 分析表二 不同環(huán)境和菌種生長比較培養(yǎng)菌接種量培養(yǎng)溫度/ 搖床轉(zhuǎn)速/rpm生長曲線狀態(tài)代時/min調(diào)整期/h對數(shù)期/h穩(wěn)定期OD(取8小時OD）大腸桿菌單菌落37200430.45328.5 1.0mL37110130.37249.4 1.0mL30200230.59652.5 1.0mL37200130.4304

18、6.5 3.0mL37200120.41948.7 5.0mL37200120.41133.1 枯草桿菌1.0mL37200260.67866.5 30200350.61592.2 37110130.34534.9 1） 接種量對微生物的影響：預(yù)期：接種量大，調(diào)整期縮短，對數(shù)期增長，穩(wěn)定期OD增大，代時縮短。原因：接種量大的細(xì)胞基數(shù)大，因而更快適應(yīng)環(huán)境。實(shí)際：調(diào)整期影響不大，對數(shù)期稍有縮短，穩(wěn)定期OD減小，代時規(guī)律不明顯。分析：生長曲線受各種因素調(diào)節(jié)，這里實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同于預(yù)期應(yīng)該是受到培養(yǎng)基的限制，接種量大對氧氣和原料需求更多，而且產(chǎn)生酸的速度也快，也許對后來的細(xì)胞生長造成了一定的影響。2） 培

19、養(yǎng)溫度對微生物的影響預(yù)期：最適溫度下細(xì)胞生長應(yīng)該最快，調(diào)整期最短，穩(wěn)定期OD最大，代時最短原因：溫度影響細(xì)菌內(nèi)酶活力和細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而影響新陳代謝，從而影響細(xì)菌的生長繁殖。最適溫度下，細(xì)菌酶活性最強(qiáng)，因而能最快適應(yīng)環(huán)境，并取得生長增殖的最高效率。實(shí)際：大腸桿菌37穩(wěn)定期OD最大，調(diào)整期更短，但代時更長。枯草桿菌37調(diào)整期更短，對數(shù)期更長，穩(wěn)定期OD更大，代時更短。分析：大腸桿菌代時的問題應(yīng)該來自實(shí)驗(yàn)誤差，如取樣未搖勻、計(jì)算時取點(diǎn)不夠準(zhǔn)確，或?qū)嶒?yàn)過程中某些操作導(dǎo)致生長和理論不一致。3） 搖床轉(zhuǎn)速對微生物的影響預(yù)期：轉(zhuǎn)速高，調(diào)整期短，對數(shù)期長，穩(wěn)定期OD大，代時短原因：轉(zhuǎn)速影響溶氧，溶氧高，生

20、長情況應(yīng)該越好實(shí)際：大腸桿菌與預(yù)期符合；枯草桿菌轉(zhuǎn)速快的調(diào)整期長，代時長。分析：原因可能有兩點(diǎn)，一是枯草桿菌在溶氧高的環(huán)境下生長沒有那么好，說明它是微好氧生物，但這與實(shí)際不符；二是其他條件限制，雖然說兩個培養(yǎng)瓶進(jìn)行對照要求其他條件一致，但是由于培養(yǎng)基分配及其其他各種原因，其他條件可能并不一致而且還產(chǎn)生了比對照條件還要大的影響。4） 生長曲線分析兩個菌的生長曲線都包括了調(diào)整期、對數(shù)期和穩(wěn)定期，實(shí)驗(yàn)沒有進(jìn)行到衰亡期因?yàn)槎鴽]有觀察到后來的OD值下降。5） 大腸桿菌和枯草桿菌比較大腸桿菌：代時要短一些，溫度對代時的影響比溶氧對代時的影響要大，估計(jì)是因?yàn)槿芤褐屑?xì)胞不多，所以溶氧的限制作用沒有溫度明顯。枯

21、草桿菌：代時較長，溶氧比溫度對代時的影響要大，但這也可能是實(shí)驗(yàn)操作中其他因素影響而得出的表觀結(jié)果。六、 實(shí)驗(yàn)小結(jié)這是一個大組合作、小組分工的實(shí)驗(yàn)，每一組的結(jié)果都影響了整個大組隊(duì)結(jié)果的分析，這就要求我們的合作。和暑期實(shí)驗(yàn)不同，這次實(shí)驗(yàn)在時間上縮短了，但是在內(nèi)容上卻增多了，由于有很多組的平行比較，所以得到的信息量也相應(yīng)加大，這些信息中又包含了這種各樣的誤差，所以要求我們自己在處理別人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也加入自己的分析。總的來說，這是個很有意思也很有意義的實(shí)驗(yàn)。七、 思考1. 計(jì)算出大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基中對數(shù)生長期中的代時(min)（繁殖一代的時間），為什么比理論時間長好多？代

22、時見表二。經(jīng)查資料得：大腸桿菌理論代時為37度時18分鐘，而枯草桿菌一般是給30度下的理論代時為31分鐘，實(shí)驗(yàn)測得代時長于理論值的原因： 理論代時是在理想的培養(yǎng)條件下測得，糖分、氧氣等營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)充足，細(xì)菌生長狀況良好，之前的分裂次數(shù)較少。實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件與理論值條件存在差距。如培養(yǎng)過程中不補(bǔ)料，營養(yǎng)物質(zhì)有限。單純的振蕩不能保證體系中有足夠的溶氧。對培養(yǎng)液的pH值，氧化還原電勢也未加控制，測量過程中溫度不能保持穩(wěn)定等等。2. 為什么可用比濁法來表示細(xì)菌的相對生長狀況？培養(yǎng)液的渾濁度與細(xì)菌的濃度與成正比，可以利用分光光度計(jì)測定細(xì)菌濁液的光密度來推知菌液的濃度。濁度的變化代表體系細(xì)菌數(shù)量的變化。其原理是：一個細(xì)胞懸浮液用肉