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文檔簡介

1、免疫組化操作流程試劑預備1. PBS緩沖液（pH7.27.4）： NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。2. 0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g。即抗原修復液3.PBST: PBS+吐溫-20（1000:1）洗液可全部運用PBST4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。5. 封片劑：中性樹脂+二甲苯。操作流程免疫組織化學染色SP法：1. 脫蠟、水化： 脫蠟前，應將切片在60恒溫箱中烘烤60120分鐘，觀看石蠟

2、應溶解。從烤箱拿出切片后盡快置于二甲苯中浸泡30分鐘，更換二甲苯后再浸泡30分鐘；無水乙醇中浸泡3分鐘；95%乙醇中浸泡3分鐘；70%乙醇中浸泡3分鐘（我用80%）；50%乙醇中浸泡3分鐘；自來水中浸泡3分鐘；梯度脫蠟2. 抗原修復：（用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片）高壓熱修復 高壓鍋里放少許水，用一量杯或容器（大小能容納玻片架為宜）裝抗原修復液放入高壓鍋里一起煮沸，再放入玻片架，蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，將排氣閥門套上，待聽到閥門冒氣時，即可倒計時2min，之后將玻片杯一起放入涼水中，靜置15min，平衡至室溫。電磁爐1000W 2min。3.丟棄抗原修復液，將玻片浸泡在去離子水中（時間不

3、限）可省略4.用組織筆沿組織邊緣畫線（可與組織邊緣留適當間隙），畫完馬上放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三個容器，每個容器3min，時間不限制）。5. 3%H2O2滴加在切片上，室溫靜置15分鐘(3%的H2O2用30%的H2O2加雙蒸水稀釋10倍，現配現用。目的為阻斷內源性過氧化物酶)；6. PBST洗3次各3分鐘(過三缸)7. 滴加正常山羊血清封閉液,室溫30分鐘。用與一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封閉液。8. 甩去封閉液（注：不要沖洗），滴加一抗50ul（至少50ul否則易干片），4孵育過夜。4過夜后需在37復溫45分鐘（未驗證：室溫靜置1小時或者4過夜或者371小時。）。9. PBST洗3次各3分鐘；10. 滴加兔或鼠二抗一滴，先滴幫助劑，再滴二抗，之間用PBST洗三次，每次3min，每次室溫各靜置15分鐘；所用試劑盒為中杉金橋的超敏二步法免疫組化檢測試劑。11. PBST洗3次各3分鐘；12. DAB顯色幾秒至幾分鐘，在顯微鏡下把握染色程度；DAB為福州邁新試劑，先配現用。13. PBST或自來水沖洗10分鐘；14. 蘇木精復染20秒，自來水分化

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