1、1. 目的建立無菌檢查的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。2. 適用范圍本規(guī)程適用于本公司質(zhì)管部對本廠生產(chǎn)的一次性微波消融針的無菌檢測。3. 職責(zé)質(zhì)量部負(fù)責(zé)實(shí)施。4. 內(nèi)容檢驗依據(jù)產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國藥典 2015 年版 無菌檢查法 儀器、設(shè)備超凈工作臺、電熱干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱、壓力蒸汽滅菌器、集菌儀、電子天 平、PH計、冰箱、恒溫水浴鍋、酒精燈、三角燒瓶，接種環(huán)、鑷子，試管架， 大試管若干等。培養(yǎng)基及稀釋液需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基；霉菌培養(yǎng)基：大豆酪蛋白肉湯培養(yǎng)基；培養(yǎng)基 的無菌性檢查每批配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行無菌性檢查 （可與產(chǎn)品無菌檢驗同步進(jìn)行） 查時，每批培養(yǎng)基

2、隨機(jī)取不少于 5 支（瓶）培養(yǎng) 14 天，應(yīng)無菌生長； 稀釋液氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液， 9g/L 無菌氯化鈉溶液；無菌檢驗室的環(huán)境要求 （1）無菌檢驗應(yīng)在環(huán)境潔凈度 10000 級下的局部百級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。（2）緩沖區(qū)與外界環(huán)境、無菌檢驗室與緩沖區(qū)之間空氣應(yīng)保持正壓，陽性對照 室與緩沖區(qū)之間空氣應(yīng)保持負(fù)壓。無菌檢驗室與室外大氣之間靜壓差應(yīng)大于10Pa無菌檢驗室的室溫應(yīng)保持 1826C,相對濕度：4565%（3）無菌檢驗室的單向流空氣區(qū)、 工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行懸浮粒子、 浮游菌和沉降菌的監(jiān)測。（4） 無菌檢驗

3、過程中應(yīng)同時檢查超凈工作臺單向流空氣中的菌落數(shù)： 每次操作 時在層流空氣所及臺面的左中右置 3個TSA瓊脂平板，暴露30min,于3035C 培養(yǎng)48小時，菌落數(shù)平均應(yīng)不超過1CFU平板。無菌檢驗前的準(zhǔn)備器具滅菌、消毒可經(jīng)壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121T蒸汽滅菌30分鐘后使用。人員、物料進(jìn)入無菌檢驗室開啟紫外線燈或臭氧發(fā)生器進(jìn)行空間滅菌處理，消毒時間不得少于30min。物料進(jìn)入無菌檢驗室流程進(jìn)入無菌操作室的所有培養(yǎng)基、 供試品等的外表都應(yīng)采用適用的方法進(jìn)行消毒處理，以避免將外包裝污染的微生物帶入無菌檢驗室。人員進(jìn)入無菌檢驗室流程（1）更鞋脫衣：在一更區(qū)脫去一般區(qū)工作鞋，穿上無菌檢驗室工作鞋；脫去一 般

4、區(qū)工作服。（2）洗手：首先用洗手液在手上揉擦出泡沫，再用流水連續(xù)沖洗20 秒，洗凈泡沫。（3）更衣：在二更區(qū)按照要求穿衣，要求褲子掖在上衣里，口罩掩住口鼻，帽 子包裹所有頭發(fā)。（4）手消毒：用消毒液浸泡雙手 5 秒以上或用浸過消毒液的棉球擦拭雙手。消 毒液可用洗必泰、新潔爾滅、碘伏、 75%酒精等。（5）人員進(jìn)入：經(jīng)緩沖間進(jìn)入無菌檢驗室。無菌檢驗操作要求（1）全過程必須嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，防止微生物污染。（2）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放，避免破損，以防培養(yǎng)物擴(kuò)散。（3）所有操作不得有大幅度或快速動作，以免攪動空氣中的塵埃微粒。（ 4） 使用金屬接種器具時，用前、用后均需灼燒滅菌。（ 5） 在接種培養(yǎng)

5、物時，動作應(yīng)輕、準(zhǔn)，防止培養(yǎng)物濺出，產(chǎn)生汽溶膠，造成污 染。（6）操作過程中所有的帶菌物品，用后均應(yīng)作消毒、滅菌處理。在檢驗完成后 經(jīng)傳遞窗傳至一般區(qū)，立即用壓力蒸汽滅菌鍋121C滅菌30分鐘。對照菌液制備無菌檢驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過 5 代。取金黃色葡萄球的普通瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種金黃色葡萄球至TSA瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，在3035 C培養(yǎng)1824h后備用，同時制備氯化鈉溶液加入在6支小試管 內(nèi)，每支試管內(nèi)加的氯化鈉溶液，在壓力鍋內(nèi)經(jīng)121C滅菌30min備用。將已 配好的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)菌液取加入第一支小試管內(nèi)，稀釋成濃度 1:10 的菌 液；取第一支試管內(nèi) l 菌液加入第二支小試管內(nèi)，稀

6、釋成濃度 1:100 的菌液， 同法稀釋成濃度1:10-6 （每ml含菌量w 100CFU即可。采用平皿計數(shù)法測定活菌數(shù)。. 試驗方法供試液準(zhǔn)備優(yōu)先采用將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的方法， 如供試品不適宜直接投放， 可按下列方法制備供試液， 應(yīng)使浸提介質(zhì)充分洗提供 試品的浸提表面，供試液制備應(yīng)按無菌操作法進(jìn)行，在制備后 2 小時內(nèi)使用。根據(jù)供試品具體特性選擇下列方法：a）管類器具：按管內(nèi)表面積每10cm2 流過管內(nèi)腔 1ml 浸提介質(zhì)，流量約為10ml/min ，收集到無菌的容器內(nèi)。b）容器類器具：按容器內(nèi)表面積每 10cm2 加入浸提介質(zhì) 1ml 的比例，振搖數(shù)次。c）

7、實(shí)體類器具：實(shí)體類器具按表面及每 10cm2加入浸提介質(zhì)1ml,振搖數(shù)次。收集上述沖洗液或浸提介質(zhì)于無菌容器中。接種薄膜過濾法：優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器（集菌器） ，也可使用開放式薄膜 過濾器。濾膜孔經(jīng)不大于 ym。a、如采用封閉式薄膜過濾器，取一副三聯(lián)式集菌器，將供試液通過集菌儀過濾，使通過每只培養(yǎng)管的量基本均勻。然后通過集菌儀一只加 50ml TSB 培養(yǎng)基，另 兩只分別加入 50ml 硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（其中一只做陽性對照，內(nèi)加金黃色葡萄 球菌液1ml）。另取一副二聯(lián)集菌器，用同批的沖洗液或浸提介質(zhì)50ml通過集菌儀過濾（每只約50ml），同法一只加硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基 50ml，另一只加TS

8、B培養(yǎng) 基 120ml 分別作陰性對照。b、 如用一般薄膜過濾器，將供試液過濾后取出濾膜，將其剪成3等份，分別置 于含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及 TSB培養(yǎng)基的容器中，其中兩份作檢驗，一 份作陽性對照。直接接種法： 適用于一次性使用注射針、 一次性使用靜脈輸液針 （包括輸液 器、輸血器、注射器配套使用注射針） 。a、敷料供試品：取規(guī)定數(shù)量，每個包裝以無菌操作拆開，于不同部位剪取約120mg 或1cmx 3cm的供試品，接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。b、無菌針頭：直接投入含15ml以上硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及 TSB培養(yǎng)基的容器 中。c、一次性使用的材料：拆散或切成小碎斷，接種于各管足以浸沒供試品的適量 培養(yǎng)基中。培養(yǎng)、觀察（1）上述含培養(yǎng)基的容器分別置規(guī)定溫度的恒溫培養(yǎng)箱中，其中硫乙醇酸鹽 流體培養(yǎng)基，置3035C培養(yǎng)；TSB培養(yǎng)基，置2025C培養(yǎng)。除陽性對照管 培養(yǎng)4872小時外，其余管培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生 長。（2） 如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14 天后， 不能從外觀上判斷有無微生物生產(chǎn)， 可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中 或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上， 細(xì)菌培養(yǎng) 2 天，真菌培養(yǎng) 3 天，觀察是否再出現(xiàn)渾 濁或斜面有無菌生長。結(jié)果判斷（1）培養(yǎng)結(jié)束后，陽性對照管應(yīng)有菌