1、基于CRISPR-Cas9系統的基因組編輯技術 摘要 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）系統成功被改造為第三代人工核酸內切酶，與鋅指核酸內切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)一樣可用于各種復雜基因組的編輯。該系統在crRNA的指導下，使核酸酶Cas識別并降解外源DNA，其中，型CRISPR-Cas系統最為簡單，僅包括一個核酸酶Cas9與t

2、racrRNA ：crRNA二聚體便可完成其生物功能。基于CRISPR-Cas9 的基因編輯技術的核心為將tracrRNA ： crRNA設計為引導RNA，在引導RNA的指導下Cas9定位于特定的DNA序列上，進行DNA雙鏈的切割，實現基因組的定向編輯。目前該技術成功應用于人類細胞、斑馬魚和小鼠以及細菌的基因組精確修飾，修飾類型包括基因定點 InDel 突變、基因定點敲入、兩位點同時突變和小片段的缺失由于其突變效率高、制作簡單及成本低的特點，被認為是一種具有廣闊應用前景的基因組定點改造分子工具。關鍵詞: CRISPR-Cas9系統；基因組編輯技術；核酸內切酶簡介近年來，基因組編輯技術(geno

3、me engineering technologies)的快速發展為生物學研究帶來了新紀元。與傳統的基因克隆技術不同，基因組編輯技術可直接在基因組上進行序列的敲除、插 入、定點突變以及組合編輯等，實現基因功能與調控元件的系統研究，在工業生物工程等方面具有廣闊的應用前景。早期，基因組編輯技術主要利用同源重組介導的打靶技術，但由于效率較低 (1010)，極大地限制了其應用。為解決這一難題，一系列人工核酸內切酶介導的基因組編輯技術被開發，可通過在基因組特定位置上形成DNA雙鏈斷裂（DNA double strand break，DSB)，借助于細胞自身的修復系統如非同源末端連接（non-homolo

4、gous end joining, NHRJ）或同源重組（homology directed repair，HDR），從而實現在不同生物與細胞類型中有效的定點基因組編輯。目前，已有種不同的人工核酸內切酶應用于基因組編輯:巨核酶技術(Meganucleases)、鋅指核酸內切酶 (zinc finger endonuclease，ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，ZFN）與RNA 靶向DNA內切酶Cas9。1CRISPR 研究歷史1987 年，日本課題組在 K12 大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發現串

5、聯間隔重復序列2，隨后的 研究發現這種間隔重復序列廣泛存在于細菌和古細 菌的基因組中，2002 年，科學家將其正式命名為 clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)3-5因為缺乏病毒和質粒的序列信息，初期對 CRISPR 的研究進展緩慢，其行使的確切功能一直未能闡明2005 年，三個研究小組均發現 CRISPR 的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物質高度同源，推測其功能可能與細菌抵抗外源遺傳物質入侵的免疫系統有關。2006 年，美國研究小組通過生物信息分析預測， CRISPR 系統可能以類似

6、于真核生物的 RNAi 方式行使其免疫功能6但這些都只是假設2007 年， Barrangou 等 7首次發現并證明細菌可能利用 CRSPR 系統對抵抗噬菌體入侵2008 年 ， Marraffini 等8又發現細菌 CRISPR 系統能阻止外源質粒的轉移，首次利用實驗驗證了CRISPR 系統的功能，由此科學家們揭開了研究 CRISPR 系統作用機制的序幕。之后研究人員很快發現 CRISPR 系統在食品發酵工業和醫學中的潛在價值，使其成為研究的熱點。9CRISPR-Cas9系統的作用機制Crispr/cas系統是很多細菌和古生菌的一種獲得性免疫系統，在已經完成測序的細菌中占40%古生菌中占90

7、%，它通過CRISPR對入侵的外源核酸分子或者病毒進行特異性地識別并用 CAS 蛋白對其切割消化，從而達到對自身的免疫性保護。CRISPR是一段特殊的 DNA 重復序列，長度通常為 2147 個堿基，可變的間隔序列為 2672 個堿基。Cas存在于 CRISPR 位點附近，是一種雙鏈 DNA 核酸酶。它與 folk 酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體就能發揮作用。在細菌和古生菌中 Crispr/cas 系統主要分為三種類型，根據核心元件和序列的不同又分為約 10 種亞型。菌體通過攝取，表達以及干涉三個基本過程發揮免疫過程。簡單地說就是病毒或核酸分子入侵細菌，細菌將其編輯插入到自身的基因組 C

8、RISPR 位點附近，在轉錄表達階段，CRISPR 間隔重復序列被轉錄成不成熟的前體 crRNA(pre-crRNAs)。pre-crRNAs 被進一步剪接加工形成成熟的小的 crRNAs， 有一段間隔序列兩邊被重復序列包圍。在干涉階段，crRNA 和 CAS 蛋白結合形成 一個大的效應復合物，當病毒或核酸再次入侵時，crRNAs 就會通過堿基配對將 CAS蛋白帶到互補區，誘導基因發生位點特異性的斷裂，從而阻斷了病毒在細胞內的擴增。在不同類型的 Crispr/cas 系統中，效應核蛋白體（RNP）的組裝和功能不同，I 型系統中 crRNAs 被組裝到一個稱為 Cascade的復合物中，由 CA

9、S3 引起 DNA 雙鏈斷裂。三型系統中 RNP 復合物中包括 Cas RAMP(Cmr 或者 Csm) 蛋白，在體外 crRNAs 識別和切割合成的 RNA，也可在體內切割雙鏈 DNA。現在應用最廣的是 II 型 Crispr/cas 系統，它的組裝簡單僅僅需要一個 Cas9 核酶。最近 Cas9 和 sgRNA 組成的復合物的晶體結 構已經被解析出來，其造成 DNA 雙鏈斷裂的機制進一步得到證實。CRISPR-Cas9系統工作原理模式圖最近 Mali et al.改造了釀膿鏈球菌 II 型 Crispr/cas 系統稱之為 Crispr/cas9 系統， 該系統由gRNA 和人類編碼子最優

10、的 Cas9 核酶形成 RNA 和 Cas9 蛋白的復合物，在應用中我們將靶序列插入到 Crispr 位點中，它被進一步轉錄加工形成 sgRNA， sgRNA識別并結合靶位點將Cas9蛋白帶到PAM位點上游的DNA片段上，由Cas9 蛋白的兩個亞基分別切割互補鏈和非互補鏈，引起雙鏈斷裂。CRISPR/Cas9 系統可通過簡單的轉染技術將其轉進各種不同的細胞系中從而改造不同的細胞。其應用簡單便捷，易于操作，成為一種強大的基因修飾工具7。Crispr-cas9 系統的應用展望 和TALEN 和 ZFN 相比，Crispr-cas9 系統有很多優點也有一些缺點。和 TALEN 和 ZFNs 不同，C

11、rispr/cas9 系統是利用堿基配對來識別靶點，而 Cas9 核酶是一致的，因此只需要設計出靶基因的 gRNA 就可以了。因此 Crispr-cas9系統的設計簡單便捷，易于篩選。Crispr-cas9 系統的應用也更加廣泛，它可用于各種細胞還可同時靶向多個基因或者同一基因的不同位點。而且通過突變 Cas9 的一個酶切活性位點可以提高細胞的同源重組率，提高 target in 效率。如果將 Cas9 的酶切活性位點全部缺失突變， 融合表達 cas9 和某些轉錄因子，可以誘導或抑制靶基因的轉錄表達，該技術被稱 為 CRISPR 干擾技術(CRISPRi)。衡量一項技術的研究應用前景時，效率和

12、脫靶率是一項重要指標，在已發表的應用Crispr-cas9系統的文獻中，Crispr-cas9系統和ZFN以及TALEN的效率相近， 但是 Cas9 對堿基錯配有很大的包容性，造成了該系統的高脫靶率。由于該技術研究發展的時間還比較短，進一步的研究很可能會提高它的打靶效率降低其脫靶效率。在接下來的研究中該系統的轉運載體的研究也會進一步提高其應用。10-11參考文獻1 Capercchi M R. Altering the genome by homologous recombination J. Science,1989,244(4910)：1288-1292.2 Ishino Y, Shina

13、gawa H, Makino K, et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol, 1987, 169(12): 5429-5433.3 Jansen R, van Embden J D, Gaastra W, et al. Identification of a novel family of s

14、equence repeats among prokaryotes. Omics: a Journal of Integrative Biology, 2002, 6(1): 23-33. 4 Mojica F J, Ferrer C, Juez G, et al. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in repl

15、icon partitioning. Mol Microbiol, 1995, 17(1): 85-93. 5 Jansen R, Embden J D, Gaastra W, et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol, 2002, 43(6): 1565-1575 .6 Makarova K S, Grishin N V, Shabalina S A, et al. A putative RNA-interference-based imm

16、une system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol Direct, 2006, 1: 7. 7 Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science, 2007, 315(5819): 1709-1712.8 Marraffini L A, Sontheimer E J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science, 2008, 3