1、泡菜純種發酵優良乳酸菌的篩選及菌株特性研究張冬梅,于康寧,涂 強,艾 方,彭麗桃*(華中農業大學食品科技學院,湖北武漢430070摘 要:從不同時期的新鮮泡菜汁中分離得到18株乳酸菌,篩選出2株發酵蘿卜產酸能力強、風味好、亞硝酸鹽含量低的菌株,經鑒定分別為腸膜明串珠菌腸膜亞種和戊糖乳桿菌。對這2株菌生長特性的測試結果表明:2株菌的生長溫度范圍較寬,最適生長溫度均為37e ,最適生長p H 值均為68,腸膜明串珠菌對酸度和鹽度的耐受性比戊糖乳桿菌差,腸膜明串珠菌在p H 值<4和鹽濃度>8%時生長停滯,戊糖乳桿菌能夠耐受p H 值<3和鹽濃度>8%的生長條件。腸膜明串珠菌

2、和戊糖乳桿菌在MRS 培養基中對初始亞硝酸鹽的降解率分別為84196%和93117%。關 鍵 詞:泡菜;腸膜明串珠菌;戊糖乳桿菌;篩選;特性中圖分類號:TS20113 文獻標識碼:A 文章編號:0254-5071(200816-0022-04Isolati o n ,i d entification and characteristics of lactic acid bacteria from picklesZ HANG Dongme,i YU K angni ng ,TU Q i ang ,A I Fang ,PENG L itao *(Colle ge of Food Science a

3、nd T echnology,H uazhong Agr icultural Uni versit y,Wuhan 430070,China Abstract :18Strai ns o f lacti c aci d bacteri a were isolated and i dentifi ed fro m pickli ng cabbage and radi sh duri ng vari ous fer m ent ati on stages 1Two strai ns were se l ected f or havi ng excellent character i stics i

4、 n aci d producti on ,fer mentati on flavor and lo w nitrite concentra ti on when pickli ng radis h 1These t wo stra i ns were i dentifi ed as Leuconostocmese nteroi des subsp 1M ese nteroi des and Lactobacill us pent osus 1The characteristi cs of strai nswere a l so i nvesti gated 1The stra i ns co

5、uld tolorate a w i de range o f te mperat ure ,t he optm i al gro w th situati on f or t he m were at37e and at p H 6-81Lact obacillus pent osus had better ability o f aci d and sa lt y tolerance than Leuconost ocm esenteroi des ,Le uconostoc mese nteroi des coul d grow when p H val ue i s under 3or

6、 cont ent of salts i s up to 8%,while Lact obacillus p e ntosus coul d not grow when p H va l ue under 4or content of salt up t o 8%1Leuconost ocmesenteroi des and Lact obacillus pentosus depl eted 84196%and 93117%of the ini ti a l nitrite present i n deM an ,Rogosa and Sharpe brot h culturalmedi u

7、m ,respective l y 1K ey words :pi ck l es ;Le uconostocm esente roi des ;L actobac ill us pent osus ;i solati on ;characteristics收稿日期:2008-06-17作者簡介:張冬梅(1984-,女,碩士,研究方向為食品加工;彭麗桃*,通訊作者,E-m ai:l penglt 12m ail 1h z au 1edu 1cn 。泡菜是一種傳統的乳酸發酵蔬菜制品,富含乳酸菌活菌和乳酸,對人體的健康有益,不僅能有效抑制腸道中腐敗菌的生長和減弱腐敗菌在腸道的產毒作用,同時有降低膽

8、固醇等保健和醫療作用,深受人們的喜愛1。傳統的泡菜制作方式都是采用自然發酵法,但由于乳酸發酵緩慢,發酵周期較長,酸味較弱,受環境因素影響大,產品質量不穩定,同時,在泡菜加工過程中極易積累亞硝酸鹽、亞硝胺、亞硝基化合物等有害物質,給產品帶來較大的安全性問題。乳酸菌是泡菜中主要起作用的菌群,在發酵過程中,乳酸菌產生大量的乳酸,使環境p H 降低,抑制有害微生物的生長。同時有些乳酸菌還有亞硝酸鹽降解能力。YAN P M 等2(2008年研究發現,在發酵泡菜中分離出的戊糖乳桿菌、植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、短乳桿菌和發酵乳桿菌在MR S 培養基中可以分別降解9916%、9913%、9912%、9710%

9、、9815%和9818%的初始亞硝酸鹽含量。GENCCELEP H 等3(2007年認為,添加了乳酸菌的發酵過程和自然發酵相比,腐胺,尸胺和蘇胺等生物胺含量均有所降低4。乳酸菌生長代謝所產生的許多物質如乳酸、醋酸、甘露醇、2-庚酮等又可增強產品風味5。因此,為實現泡菜工業化生產,純種發酵是一種較佳的選擇。不僅可以克服自然發酵的諸多不足,而且可以提高泡菜生產的技術水平和產品質量檔次。本試驗以蘿卜,甘藍等為原料進行自然發酵制作泡菜,從中篩選出適宜純種發酵蘿卜的乳酸菌,為泡菜工業化生產提供參考。1材料與方法111試驗材料蘿卜、甘藍等購于華中農業大學農貿市場(蘿卜為白蘿卜,甘藍為普通甘藍,洗凈,切分。

10、112乳酸菌的分離以蘿卜,甘藍等為原料,5%的鹽水制作自然發酵泡菜,在發酵的前期、中期、后期分別取泡菜汁進行梯度稀釋,用加有1%Ca CO 3滅菌的MRS 培養基傾倒深層平板,30e 恒溫培養2d3d ,挑取有溶鈣圈的菌落,平板劃線純化至單菌落6。對分離純化所得的菌株分別進行革蘭氏染色,接觸酶試驗,發酵葡萄糖產酸產氣試驗,乳酸紙層析試驗和氨基酸脫羧酶試驗7;對革蘭氏染色陽性,接觸酶陰性,發酵葡萄糖產酸陽性,乳酸紙層析陽性,氨基酸脫羧酶陰性的菌株4e 下保存,棄去不符合條件的菌株。113乳酸菌的篩選發酵蘿卜工藝路線:蘿卜y洗凈y晾干y切分y用5%的鹽水浸泡y25e發酵3%接種量接種11311發酵

11、產酸情況用酸度計于24h、48h、72h測定發酵液p H值。11312發酵產品亞硝酸鹽的測定72h發酵成熟后,用鹽酸萘乙二胺法8測定發酵蘿卜中亞硝酸鹽的含量。11313感官評價根據發酵蘿卜的色澤、香味、味覺和口感,參照表1的標準,組成5人評定小組評定發酵成品。表1感官評分標準Tabl e11St andards of sensory evaluation感官項目好較好一般差色澤(20分白色透明(1820分顏色微黃(1417分色澤偏黃(1113分顏色混濁(810分香味(25分濃郁的發酵清香(2225分蘿卜的清香味(1821分芳香較淡(1417分無芳香,有刺激氣味(1013味覺(25分酸咸味適中(

12、2125分酸咸味較濃或較淡(1720分酸咸味偏高或偏低(1416分過酸過咸(1013分口感(30分脆嫩,細膩(2530分較脆,較細膩(2024分軟脆適中,沒有質感(1519分軟,粗糙(15分以下114篩選菌株的鑒定11411形態特征鑒定菌落形態:觀察分離培養基平板上菌落形態。菌體形態:將所分離的菌株進行革蘭氏染色,于油鏡下觀察菌體形態,記錄觀察結果。11412生理生化特征鑒定測試菌種各種碳源發酵情況,是否產生H2S等特殊生理特征試驗,進行菌株15e、37e生長試驗并記錄結果。115篩選菌株的特性11511生長曲線的測定以不接菌的空白培養基為對照,30e恒溫培養,每隔2h在波長600n m處測定

13、M RS培養液的OD值。11512耐酸和耐鹽的測定分別將M RS培養基調不同的p H值(2、3、4、5、6、7、8、9和鹽濃度(0%、2%、4%、6%、8%、10%,接入已經活化好的菌株,30e恒溫培養14h后在波長600n m處測定其OD值。11513最適生長溫度測定將活化好的菌株接種于MR S培養基中,分別于25e、30e、35e、37e、40e培養10h后在波長600n m處測定其OD值。11514降解亞硝酸鹽能力測定以無菌水代替亞硝酸鈉溶液為空白對照,將2株乳酸菌活化培養后,接種到裝有1mL1000L g/mL亞硝酸鈉溶液和9mL液體培養基的試管中,30e恒溫培養72h。按上述方法測定

14、培養基中殘存的亞硝酸鹽。2結果與分析211乳酸菌的分離在不同發酵時期的新鮮泡菜汁中分離出有溶鈣圈的菌株32株,其中篩選出革蘭氏染色陽性、接觸酶陰性,發酵葡萄糖產酸陽性,乳酸紙層析陽性,氨基酸脫羧酶陰性的菌株18株,編號為1#18#。212乳酸菌的篩選通過發酵產酸情況,發酵蘿卜中亞硝酸鹽含量及感官評定,依次對所分離的乳酸菌進行篩選。21211發酵產酸情況乳酸菌的產酸速度對得到優質安全的泡菜非常重要,特別是在發酵初期,p H值的迅速降低能有效抑制其他不耐酸雜菌的繁殖,從而減少有害代謝產物的積累。將所篩選的18株乳酸菌進行純種發酵蘿卜試驗,24h、48h、72h后測定其發酵液的p H值,結果見表2。

15、篩選出1#、2#、6#、7#、8#、9#、10#、13#、18#共9株乳酸菌,在單獨發酵蘿卜泡菜48h內p H值均降到3150以下,產酸速度快,適合純種發酵泡菜。表2不同菌株發酵時pH值隨時間變化Table21changes of pH value i n cult ural mediu m duri n g f er ment ation w ith vari o us strains21212發酵產品亞硝酸鹽含量亞硝酸鹽的產生主要是由于發酵初期雜菌(腸桿科細菌和真菌等的硝酸還原作用,大量硝酸鹽被還原成亞硝酸鹽1乳酸菌可以抑制硝酸還原雜菌的生長,另外,乳酸菌代謝產生的乳酸和自身的酶系統,可以

16、使相當一部分亞硝酸鹽被降解9。發酵72h后,測定所篩選出的9株產酸快的乳酸菌純種發酵蘿卜中的亞硝酸鹽含量,結果見圖1。篩選出6#、7#、8#、10#共4株亞硝酸鹽含量低的乳酸菌株。21213感官評價(見表3通過色澤、香味、味覺和口感的感官評價,最終篩選出7#和10#2株乳酸菌。這2株菌純種發酵蘿卜時,質地脆嫩,酸味適中,口感好。 圖1不同菌株發酵蘿卜中亞硝酸鹽含量F i g ure 11N itrite concentrations in pick ling radishs f er ment edw it h vari o us strains表3蘿卜泡菜感官評定結果Table 31Sens

17、ory evaluati o n of rad ish pickle感官項目6#7#8#10#色澤18?0101617?0131813?0131817?013香味2117?01323?0161617?01922?112味覺20?0162017?0171617?0192117?013口感23?0162613?0191717?1122613?113總分8217?1128617?1156914?2178816?217213篩選菌株的鑒定21311形態特征鑒定對篩選出的7#、10#菌株進行形態特征鑒定的結果見圖2。由圖2可知,7#菌株菌落形態為圓形,乳白色,扁平,光滑圓整,直徑015mm 215mm,

18、菌體形態為球形,單個、成對或成鏈。10#菌株菌落圓形,乳白色,突起,光滑圓整,直徑015mm 2mm, 菌體形態為桿狀。圖27#(A和10#(B菌株細胞形態觀察結果F i g ure 21Morphol o g ical f eatures of No 17and No 110strains21312生理生化試驗2株菌的精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸脫氫酶試驗均為陰 性,均不產生H 2S ,7#菌在15e 和37e 下均生長,10#菌在15e 下不生長,37e 下生長。各種碳源發酵情況見表4。表4碳源利用情況Tab l e 41M et abolism of carbohydrat es by No

19、7and No 10strains 碳源7#10#碳源7#10#L -阿拉伯糖-+麥芽糖+蔗糖+蜜二糖-+乳糖-+半乳糖-+葡萄糖+海藻糖+果糖+鼠李糖+甘露醇-+核糖-+甘露糖+D -木糖-+參考5伯杰氏細菌鑒定手冊610和5乳酸細菌-基礎、技術和應用611,初步鑒定7#為腸膜明串珠菌腸膜亞種,10#為戊糖乳桿菌。其中7#腸膜明串珠菌來自發酵初期泡菜汁,10#戊糖乳桿菌來自發酵末期。214篩選菌株的特性21411菌株生長曲線及p H 值變化曲線(見圖3圖3接種菌液OD 600值(A和pH 值(B隨培養時間的變化F i g ure 31Changes in O D 600value(Aan d

20、 pH va l u e (B of MRS cult uralmediu m duri n g f er menti o n w it h No 17and No 110strains2株菌均具有良好的生長特性和產酸能力,7#腸膜明串珠菌的生長周期較短,培養12h 后進入穩定期,在波長600nm 處培養液的OD 值達到11534。培養液初始產酸速度較快,但是產酸量低,培養24h 后p H 值降低到4150左右,48h 后降低到4140,之后不再降低。10#戊糖乳桿菌培養18h 后進入穩定期,波長600nm 下培養液的OD 值可達到11875,而且產酸速度快,產酸量大,培養24h 后培養液p

21、H值降低到3190左右,繼續培養p H 值最低可降低到3170。21412菌株對不同鹽濃度和p H 值的適應性由2株菌在不同p H 值培養基的生長情況(圖4可以看出,7#腸膜明串珠菌和10# 戊糖乳桿菌的最適生長p H 值均為68,7#腸膜明串珠菌的生長受p H 值限制較大,在p H 值低于4時不生長。所以腸膜明串珠菌只能在發酵初期的泡菜汁中分離獲得,隨著發酵液p H 值的降低,腸膜明串珠菌迅速減少直至全部死亡。10#戊糖乳桿菌耐酸性強,在p H 值低于3時也能生長。該菌從屬于植物乳桿菌,是發酵后期的優勢菌種,在較低的p H 值下能夠繼續生長產酸,使泡菜發酵成熟。 圖4不同p H 值條件對菌株

22、生長的影響F igure 41E ff ec t s of diff erent initi a l pH value in MRS cultural med-iu m on gro w th o fNo 17and No 110strains由圖5可以看出,7#腸膜明串珠菌的生長受鹽濃度限制較大,鹽濃度越高,菌株生長速度越慢。而對于10#戊糖乳桿菌菌,低濃度(2%的N a C l 反而有利于菌株的生長,隨著鹽濃度的增加,菌株的生長同樣受到限制。當鹽濃度在4%時,2株菌仍能良好生長,當鹽濃度達到8%時,7#腸膜明串珠菌生長停滯,10#戊糖乳桿菌生長緩慢(圖5。 圖5不同鹽濃度對菌株生長的影響F

23、 i g ure 51Eff ects of diff erent concentration o fNa C l inMRS cult ur -al mediu m on gro w th ofNo 17and No 110strains21413溫度對菌株生長的影響2株菌的生長溫度范圍較寬,最適生長溫度均為37e ,在所選的25e 40e 的測試范圍內,2株乳酸菌均能良好的生長。2株菌在不同溫度下的產酸能力不同,由圖6可見,2株菌的產酸能力和生長速度相一致,在最適生長溫度時產酸也最強。盡管如此,在實際生產中并不提倡在菌株的最適溫度下發酵,因為產酸過快使發酵過程不易控制,容易導致過酸,一般采

24、用25e 左右發酵較合適12。圖6不同培養溫度下7#和10#菌株培養基OD 600值(A和pH 值(B的變化Figure 61The OD 600val u e(A an d pH va l u e(B in MRS cultural med i u msw ith No 17and No 110strains under diff erent t e mperat ure21414菌株對亞硝酸鹽的降解能力試驗測得所篩選的腸膜明串珠菌和戊糖乳桿菌對初始含量為100L g /mL 的亞硝酸鹽溶液的降解率分別為84196%和93117%,所篩選的菌株對亞硝酸鹽的降解能力較高,適合純種發酵,對提高發

25、酵產品的安全性有重要意義。3結論以蘿卜、甘藍等為原料自制泡菜,在不同發酵時期的新鮮泡菜汁中分離出18株乳酸菌,通過產酸速度、發酵產品的亞硝酸鹽含量和發酵風味進行篩選,得到2株適合純種發酵的乳酸菌,經鑒定為腸膜明串珠菌腸膜亞種和戊糖乳桿菌。2株菌均具有良好的生長特性和產酸能力,最適生長p H 值均為68,最適生長溫度均為37e 。所篩選的腸膜明串珠菌生長受p H 值和鹽濃度限制較大,在p H 值<4和鹽濃度>8%時不生長,戊糖乳桿菌能夠耐受p H 值<3和鹽濃度>8%,2株菌對初始亞硝酸鹽的降解降解率分別為84196%和93117%,其中戊糖乳桿菌對亞硝酸鹽的降解能力更強

26、。參考文獻:1CAPL I CE E ,FI TZ GERALD G F 1Food fer m entations :ro l e ofm i croorgan-i s m s i n food producti on and Pres ervati on J1Internati onal Journ al of Food M icrob iol ogy ,1999,50(1-2:131-14912YAN P M,X UE W T,TAN S S ,et al 1E ffect of i noc u lati ng l actic aci dbacteria starter c u ltur

27、es on the n i trite con centrati on of f er m enti ng Ch i nes e牛肉風味強化肽(B M P在畢赤酵母中的高效分泌表達白小佳,高文,王艷萍*(天津科技大學食品工程與生物技術學院天津食品營養與安全重點實驗室,天津300457摘要:牛肉風味強化肽(Beefy M eaty Pepti de,B MP是從牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分離得到的一種風味強化八肽,與食鹽、M S G有較好的協同呈味的作用,能增強鮮味。將B M P串聯基因整合在畢赤酵母GS115基因組中,獲得工程菌株P1past oris GS115-4B M P、P1pastor

28、is GS115-8B M P、P1pastoris GS115-12B M P和P1pastoris GS115-16B MP。將工程菌在B MMY培養基中誘導表達后的蛋白抽提物利用T ri c i ne-S DS-PAGE 電泳檢測,結果表明:構建的工程菌可以高效表達4拷貝、8拷貝、12拷貝和16拷貝的B M P,為B M P的高效表達和制備奠定了良好的基礎。關鍵詞:牛肉風味強化肽;畢赤酵母;串聯基因;表達中圖分類號:TS20113文獻標識碼:A文章編號:0254-5071(200816-0026-03H igh Level Secretion Expression of Beefy M

29、eat y Peptide Gene i n P1pastorisBa iX iao jia,G ao W en,W ang Y anping*(D e p ar t m ent of Food Eng i neering&B iotechnology,T i anj i n K ey Laboratory of Food nutrition&safet y,T ianjin University of Science&T echnology,Chi na,300457Abstract:Beef y M eaty Peptide(B MPi s an octapepti

30、 de w i th delici ous taste and w as i solated fi rst from beef di gested by Papa i n1There were s ynerg isti c effects of salt andM S G on B M P and B M P can be us ed as a nat ura l fl avor enhancer li keM S G1I n t hiswork,tande m genes of B M P were s uccessf ull y i ntegra-t ed i nt o the geno

31、m e of P1past oris GS1151R eco mbi nants we got w ere denoted as P1past oris GS115-4B M P,P1past oris GS115-8B MP,P1pastoris GS115-12B M P and P1past oris GS115-16B MP,res pecti vely1These strai nswere i ncubated and t hen i nd uced i n B MMY f or expressi on of B M P and total protei n i n t he s u

32、pernatantwere extracted and analysised by Tr i c i ne-S DS-PAGE,res ults s hown t hat a ll the stra i n constracted coul d expressB MP of4copy,8copy,12cop-y and16copy effi c i entl y1Th i s work lai d t he f oundati on for effective l y expressi on and preparati on of t h i s flavor enhancer1K ey wo

33、rds:beef y meaty peptide;P1past oris;t ande m genes;expression牛肉風味肽(Beefy M eaty Pept i de,B M P最初是由YA-M ASAK I Y等1從牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分離出來的,其一級結構為:N-Lys-G l y-A sp-G l u-G l u-Ser-le u-A la-C,分子量為847Da,通過ExPasy軟件預測等電點為411。B M P 是牛肉風味的主要成分之一,能產生類似/美味肽0的風味和閾值2。WANG K等3研究表明BM P與食鹽、M SG有較好地協同呈味的作用,能增強鮮味。WANG K等4報道化學合成的B M P在p H615的條件下,經過121e、20m i n的熱處理表現出很好的熱穩定性,僅有10%變性,適合于食品工業生產中的熱處理要求,并推測可能由于BM P是一種線性短肽,不存在高級結構,而其組成的氨基酸具有耐熱性。目前,風味肽