1、文獻速覽人偏肺病毒疫苗研究最新進展人偏肺病毒(Humanmetapneumovirus,hMPV)和它相近的同病毒科成員呼吸道合胞病毒一樣，是兒童下呼吸道感染的主要病因。hMPV也是世界范圍內(nèi)引起免疫功能低下者和老年人發(fā)病及死亡的常見原因。感染的反復(fù)發(fā)生也加重了醫(yī)療負(fù)擔(dān)。然而，目前并沒有針對hMPV的特異性預(yù)防措施。本文著重概述目前關(guān)于闡述hMPV疫苗的研究進展的文獻。我們認(rèn)為對宿主應(yīng)答中病毒蛋白的作用更好的認(rèn)識有利于有效預(yù)防性疫苗的研發(fā)。1人偏肺病毒hMPV是一種負(fù)義單鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科，該科還包括了呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytialvirus,RSV)和副流

2、感病毒°hMPV在2001年被發(fā)現(xiàn)不久,就很快被認(rèn)為是幼兒、免疫功能低下者和老年人下呼吸道感染的常見病因。雖然hMPV是重要的臨床病原體，但目前卻沒有疫苗。hMPV包含兩個基因群體：A和每個基因群體乂有兩個基因亞群，分別是A1和A2.B1和B2。目前,hMPV共有5個當(dāng)代流行病毒株，它們已經(jīng)存在了數(shù)十年°hMPV的反基因組包括表達病毒蛋白的九個開放閱讀框：3'NPMFM2-1-M2-2-SH-G-L-5，。其中核蛋白N,磷蛋白P和大蛋白L是RNA合成所必需的。RNA合成由兩個獨立的過程組成:病毒復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄。首先由蛋白L和蛋白P組成的RNA依賴性病毒RNA聚合酶(

3、RdRp)結(jié)合在N.殼體化基因組的前導(dǎo)區(qū)，然后通過識別起始和終止信號沿病毒基因的一側(cè)依次轉(zhuǎn)錄每段基因。在合成階段mRNA被帽化和聚腺苜酸化。當(dāng)有足夠的核蛋白來殼化反基因組和基因組時，復(fù)制開始。首先負(fù)鏈基因復(fù)制成正鏈反基因，然后正鏈反基因作為模板復(fù)制成病毒基因的多個拷貝。除了蛋白P和L,M2.2蛋白對病毒RNA合成也是重要的。與RSV的M2.2蛋白一樣，從病毒基因的轉(zhuǎn)錄到病毒基因的復(fù)制過程中，hMPV的M2-2蛋白是否是病毒RNA聚合酶開關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子仍存在爭議。磷蛋白P、糖蛋白G、疏水蛋白SH和M2.2蛋白都顯示出調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答的作用。分別缺乏或組合缺乏G、SH和M.2的重組hMPVs以及

4、用禽類病毒蛋白P替換人類病毒蛋白P的重組hMPVs都是減毒的。融合蛋白F對hMPV的入侵是必要的，并且還能誘導(dǎo)強的體液免疫反應(yīng)。在本文概述中，討論了基于上述蛋白功能的hMPV疫苗研發(fā)的現(xiàn)狀和進展。2滅活疫苗福爾馬林滅活流感疫苗因其優(yōu)良的穩(wěn)定性，易于規(guī)模生產(chǎn)，無病毒復(fù)制方面的生物安全性等原因，通常被用來進行大規(guī)模免疫接種。然而，福爾馬林滅活的人RSV疫苗(Formalin-inactivatedhumanRSVvaccine,FI-hRSV)接種會導(dǎo)致自然感染后疾病加重。疾病加重可能因為：(1)Th2型的T細(xì)胞記憶應(yīng)答；(2)甲醛過敏;和/或(3)產(chǎn)生未成熟抗體及其對自然感染hRSV表位的輕微識

5、別。最近有報道說RSV糖蛋白G肽鏈接種后FI-hRSV接種引起的疾病加重減少了，這說明抗RSVG蛋白的特異性抗體對RSV傳染病控制是至關(guān)重要的。同樣，在實撿動物接種福爾馬林滅活hMPV后也出現(xiàn)與疫苗相關(guān)聯(lián)的肺部疾病加重和hMPV感染后的Th2應(yīng)答。這說明福爾馬林滅活hMPV不是一個合適的候選疫苗。研究用其他的滅活方式來研發(fā)安全疫苗。例如，用納米乳劑輔佐的滅活RSV也顯示出可以誘導(dǎo)產(chǎn)生持久的RSV特異性體液免疫應(yīng)答，可以降低黏液的產(chǎn)生，增加病毒的去除,同時沒有伴隨Th2免疫介導(dǎo)的病理作用。同時，疫苗接種小鼠呈現(xiàn)出加強的Thl/Thl7應(yīng)答。雖然納米乳劑輔佐的滅活RSV候選疫苗仍需要進一步研究，但

6、是如果納米乳劑滅活hMPV具有免疫原性和保護性且有平衡的免疫應(yīng)答,那么納米乳劑就可以應(yīng)用到hMPV。3病毒蛋白疫苗亞單位疫苗是一種經(jīng)過純化的、通過全基因序列或部分基因序列表達而成的病毒蛋白。這種疫苗經(jīng)常以VLP、納米顆粒或輔以免疫增強佐劑的形式存在。在副黏科病毒中具有最優(yōu)的免疫原性的蛋白是融合蛋白F。例如，種與hMPV相近的同家族成員RSV,由Novavax以其F蛋白研發(fā)的納米顆粒疫苗正在進行U期臨床的評估c近年來，一些利用hMPV蛋白研發(fā)的亞單位候選疫帶正在進行動物試驗。以逆轉(zhuǎn)錄病毒的核心顆粒作為載體，腹腔注射hMPVF蛋白能夠引起抗同源和異源病毒株強烈的體液免疫應(yīng)答。此外，誘導(dǎo)的中和抗體能

7、降低隨后因肺部感染同源和異源病毒株而導(dǎo)致的死亡率,而接種hMPV糖蛋白G后卻不能引起中和活性。在以w病毒復(fù)制子和3型副流感病毒(Parainfluenzavirustype3,PIV3)為載體的hMPVF蛋白疫苗也存在類似的結(jié)果。研究表明,動物肌肉注射含有佐劑的可溶性hMPVF蛋白能夠引起體液免疫應(yīng)答，但這種應(yīng)答會隨著時間很快消失。最近，Williams團隊研究表明，用懸浮培養(yǎng)的人胚腎上皮細(xì)胞(293-F)表達基質(zhì)蛋白(M)和F蛋白形成hMPVVLPs,它提供的免疫保護能夠抑制hMPV在小鼠肺部的復(fù)制，而這種保護與Th2失衡的細(xì)胞因子無關(guān)。小鼠免疫接種F-M-VLPs能夠增強F蛋白特異性抗體應(yīng)

8、答和增加識別F蛋白表位的CD8+T細(xì)胞。通過添加TiterMaxGold佐劑或a-半乳糖神經(jīng)酰胺佐劑來加強VLP誘導(dǎo)的中和抗體應(yīng)答。以上結(jié)果表明，融合蛋白疫苗是hMPV疫苗研發(fā)的一個潛在候選者。其他用于蛋白疫苗研發(fā)的hMPV蛋白還有P蛋白和G蛋白。重組桿菌Calmette.Guerin(一種能夠促進抗其他細(xì)菌、寄生蟲和病原體抗原免疫應(yīng)答的載體)表達的hMPVP蛋白賦予了CD4'和CD8*T細(xì)胞強大的表型效應(yīng)，其表現(xiàn)出的hMPV保護性免疫力與動物的主動免疫相當(dāng)。然而，也有團隊研究表明hMPVG亞單位蛋白不能夠誘導(dǎo)保護性抗體應(yīng)答，說明hMPVG蛋白對病毒的免疫原性不重要。對缺乏G蛋白的重組

9、hMPV(rhMPV-AG)的研究發(fā)現(xiàn)G蛋白在誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答方面起重要作用。盡管G蛋白在免疫原性上扮演的角色仍存在爭議,但是在單蛋白免疫過程中，導(dǎo)致G蛋白出現(xiàn)不良的免疫原性有幾種可能性:一種可能性是像之前研究的RSVF蛋白一樣,在單蛋白免疫過程中，hMPVG蛋白在基因和/或蛋白質(zhì)水平上經(jīng)過了某些修飾;另一種可能性是與F蛋白相比，相同的載體攜帶G蛋白的能力降低。總之,G蛋白是否具有良好的免疫原性仍需繼續(xù)研究闡明。用以hMPVF蛋白為基礎(chǔ)的亞單位疫苗進行免疫接種是有前途的，但是疫苗的接種途徑和載體類型的組合形式以及為了誘導(dǎo)更加持久和有效的免疫效力所需要F蛋白的長度仍需更多的實驗來確定。由于hM

10、PV其他蛋白在免疫原性和免疫平衡方面仍有重要作用，因此，需要更多研究來闡明亞單位疫苗免疫接種對Thl/Th2/Thl7平衡的影響。4減毒活疫苗減毒活疫苗可以分為兩類:非重組和重組疫苗。非重組減毒病毒通常通過自然突變以及病毒在細(xì)胞上傳代過程中由于添加或去除實驗壓力導(dǎo)致的缺失來產(chǎn)生，實驗壓力包括比如化學(xué)突變劑和低溫傳代等。非重組減毒活疫苗主要的風(fēng)險是病毒毒力逆轉(zhuǎn)和病毒致病性恢復(fù)進而引起疾病。一些非重組RSV減毒活疫苗在進行臨床試驗評價，但顯示出一些副反應(yīng)和減毒不充分的情況。最近研制出溫度敏感型hMPV病毒株，免疫倉鼠后顯示出保護性免疫應(yīng)答。重組減毒活病毒通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染hMPVcDNA基因組獲得,進行

11、或不進行基因修飾或基因剔除，用質(zhì)粒編碼組成RdPp復(fù)合體的每一個必須蛋白。重組減毒hMPV病毒株已經(jīng)通過剔除特定附屬基因的方法獲得。分別是rhMPV-AG,缺乏G和SH的重組hMPV(rhMPV-AG/SII),缺乏M2-2的重組hMPV(rhMPV-AM2-2)o在感染的倉鼠中，相比rhMPV野毒株感染,rhMPV-AG和rhMPV-AG/SH在下呼吸道和上呼吸道分別抑制了至少40倍和600倍的病毒復(fù)制。然而在嚙齒類動物模型中，相比rhMPV野毒株，缺乏SH的重組hMPV(rhMPVASH)有時能更有效地感染倉鼠肺部，這說明SH對于病毒體內(nèi)感染完全沒必要，它的剔除沒有減毒效果。在感染的非洲綠

12、猴中，突變的rhMPV-AM2-2相比rhMPV-AG達到了一個更高的水平，并且誘導(dǎo)了可比擬的免疫原性和保護效力。還有另一種減毒重組hMPV,它的P蛋白被禽類MPV的P蛋白(rhMPV-Pavian)取代。最近，在人感染實驗中發(fā)現(xiàn)一個重組的hMPV野毒株適合做hMPV減毒活疫苗候選株的母本病毒。雖然rhMPV-Pavian對健康成人的感染力比較弱，但是rhMPV-Pavian這種弱感染力的機制以及是否其他重組減毒病毒對人有相似感染的問題需要將來進一步的研究。5未來設(shè)計疫苗需要考慮的其他因素雖然F蛋白被認(rèn)為是決定hMPV免疫原性的一個主要因素，但是識別能激活保護性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytoto

13、nicT-lymphocytes,CTL)和體液免疫的病毒抗原對制定成功的疫苗接種策略來說還是必要的。已經(jīng)證明幾個CTL的肽段在對hMPV感染后的CD8+CTL應(yīng)答中起作用。這些肽段是H-2b小鼠的N蛋白VGALIFTKL172,H-2d小鼠的M2-2蛋白CYLEINIEII64,HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠的SH蛋白KLILALLTFL44和G蛋白32SLILIGTTTL4io小鼠免疫接種hMPVCTL表位肽后，上調(diào)了hMPV攻擊小鼠的肺部和支氣管淋巴結(jié)的Thl型細(xì)胞因子的表達，進而降低了小鼠模型的病毒滴度和疾病的發(fā)生。最近,hMPVH-2d的顯性和次顯性表位被發(fā)現(xiàn)和鑒別出來。在12個選擇

14、的預(yù)測表位中，M2.l蛋白白勺幻GYIDDNQSI'9和村蛋白白勺3°7spkaGLLSI?”認(rèn)為是首次感染時H-2h的顯性和次顯性表位。另外，還發(fā)現(xiàn)了第二次、第三次感染后記憶性CTL應(yīng)答中H-2d限制性表位的多樣性，包括對抗M2-2蛋白的"CYLENIEII64的記憶性CTL應(yīng)答的次顯性作用。通過減毒活病毒rhMPV全基因刪除而導(dǎo)致的表位缺陷會降低rhMPV誘導(dǎo)免疫原性的能力，這說明CTL表位免疫原性的重要性。為了延長以F蛋白為基礎(chǔ)的疫苗接種的免疫原性或加強刪除突變rhMPV的免疫原性,對宿主同時接種包含CTL表位的肽段可能是一個好的選擇。由于N蛋白和M2-2蛋白

15、的抗原表位完全保守，所以CTL表位疫苗提供的保護有望覆蓋兩種hMPV病毒株°對抗病毒信號調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵病毒蛋白的識別對疫苗設(shè)計來說也是至關(guān)重要的。最近,識別了一些病毒蛋白,比如G和M2.2蛋白，它們在抑制宿主的自然免疫力方面起重要角色。我們和其他研究者都發(fā)現(xiàn)M2.2蛋白是一個具有多種功能的蛋白。它不僅調(diào)節(jié)病毒基因轉(zhuǎn)錄和病毒RNA復(fù)制,而且還包含一個CTL表位以及維甲酸誘導(dǎo)基因I和Toll樣受體的靶向中心配體。此外,M2.2蛋白也在調(diào)節(jié)miRNAs表達方面起重要角色，其中某些miR-NAs對免疫相關(guān)基因的表達起重要作用。對于多功能病毒蛋白來說,就更需要識別它們的功能區(qū)，因為這對合理設(shè)計重

16、組減毒活病毒來說很重要。最近,我們也識別了M2-2蛋白中負(fù)責(zé)抑制抗病毒信號的基序。所有這些關(guān)于M22的信息或許可以給以M2.2為基礎(chǔ)的候選減毒活疫苗的設(shè)計提供一個基礎(chǔ)信息。例如，包含以下突變的突變體：（l）M2.2，s病毒復(fù)制區(qū)域，可用作復(fù)制突變；（2）為了加強免疫原性，用蛋白的交互序列終止M22s對抗病毒信號的抑制。另一方面，為了盡可能減少病毒其他蛋白突變的概率，防止打破Thl/Th2平衡以及保持CTL表位的原始免疫原性，對病毒基因轉(zhuǎn)錄起重要作用的區(qū)域不應(yīng)該被修改。總之，解析病毒蛋白的功能區(qū)域?qū)σ呙缪邪l(fā)是大有益處的。6討論一個有效的理想候選疫苗應(yīng)該是安全的，能比自然hMPV感染誘導(dǎo)出更強的免疫力和保護力，而自然hMPV感染只能引起不完全的免疫保護。研究發(fā)現(xiàn)FI-hMPV免疫接種棉鼠會加重動物感染hMPV后其肺部的病理變化，除此以外,FI-hMPV仍是一個有希望的候選疫苗。亞單位疫苗看似僅能對初次感染誘導(dǎo)出短期保護性應(yīng)答。然而，亞單位疫苗卻可能利于增強曾暴露于hMPV個體的免疫應(yīng)答。此外,亞單位疫苗有希望給早產(chǎn)兒、免疫功能低下者和老年人等高風(fēng)險群體提供一個持續(xù)一定時間的安全有效的保護,特別是以非感染載體的形式接種。目前