1、功能性矯治器引導大鼠下頜前伸后咀嚼肌基質金屬蛋白酶mRNA的表達【關鍵詞】 咀嚼肌 摘要：目的 研究功能性矯治器引導大鼠下頜前伸后咀嚼肌中基質金屬蛋白酶(MMPs)mRNA的表達，探討功能性頜骨矯形過程中咀嚼肌適應性變化的生物學機制，為矯形治療提供新的理論依據。方法 分別采用RTPCR法、實時熒光定量PCR方法觀察戴矯治器(實驗組)和不戴矯治器(對照組)3、7、14、21d大鼠二腹肌前腹中MMP2、MMP9 mRNA表達和表達差異。結果 實驗組和對照組大鼠二腹肌前腹中MMP2、MMP9 mRNA均有表達。MMP2mRNA、 MMP9 mRNA表達差異：實驗組3、21d后表達增加，其中21d較1

2、4、7d表達明顯增加；而對照組21d較14、3d表達明顯增加。結論 MMP2、MMP9在mRNA水平參與了咀嚼肌正常的生長發育過程；功能性矯治器引導大鼠下頜前伸后咀嚼肌中MMPs在mRNA水平參與了咀嚼肌的適應性變化。關鍵詞：咀嚼肌；基質金屬蛋白酶；mRNA；下頜前伸；RTPCRABSTRACT: Objective To investigate molecular changes in growing rats masticatory muscle after functional mandibular protrusion. Methods SD rats were randomly di

3、vided into eight groups as control 3d, 7d,14d, 21d and experimental 3d,7d,14d,21d. The RTPCR and qPCR methods were used to find expression and any differences of mRNA of MMPs in growing rats masticatory muscle after functional mandibular protrusion. Results Expression of MMP2, MMP9 mRNA expressed in

4、 all growing rats masticatory muscle. Expression differences of MMP2 and MMP9 mRNA in 3d, 21d were found between control and experimental groups after functional mandibular protrusion. Conclusion MMP2 and MMP9 mRNA participate in masticatory muscle normal development. MMPs mRNA involve changes in gr

5、owing rats masticatory muscle after functional mandibular protrusion.KEY WORDS:masticatory muscle; MMPs; mRNA; mandibular protrusion; RTPCR下頜骨的功能性矯形治療是在生長發育期通過刺激患者的下頜骨生長達到矯治下頜骨發育不足畸形目的。在引導下頜前伸的過程中，除了骨組織在肌張力的作用下發生改建和生長外，咀嚼肌也會發生相應的變化和改建，以保持和穩定下頜骨生長的結果。近些年來，功能性矯治器的研究多集中在下頜骨的改建和生長上，特別是髁狀突的適應性改建及其影響因素，而對

6、咀嚼肌功能的適應性變化研究較少，對咀嚼肌適應性改變的生物學機制尚不清楚。本研究通過檢測功能性矯治器引導大鼠下頜前伸后咀嚼肌中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)mRNA的表達和表達差異，探討功能性頜骨矯形過程中咀嚼肌適應性變化的生物學機制，為矯形治療提供新的理論依據。1 材料與方法1.1 實驗動物及分組 選用健康的雄性SD大鼠40只，4周齡，體質量(70土5)g。隨機分為8組：不戴矯治器的對照3、7、14、21d組，戴矯治器的實驗3、7、14、 21d組，每組5只。自由飲水，定時攝食。1.2 主要試劑 RNA提取試劑(Trizol)、反轉錄試劑盒(Re

7、vertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)：MBI Fermentas公司；PCRMasterMix：北京天為時代科技有限公司；DyNamo SYBR Green qPCR Kit(Finnezyme)：東盛創新生物公司贈。1.3 矯治器的設計 參照Petrovic1使用的矯治器并加以改良。矯治器由塑料底板、斜面導板和口外固位臂三部分組成。斜面導板為6mm8mm的帶環片，斜面導板與上頜咬合平面成20-25，矯治器戴于大鼠上切牙。當大鼠閉口進行功能運動時，下切牙咬在斜面導板上，下頜被引導前伸。1.4 標本制備 分別于戴矯治器3，7，14，21d后斷頸處死。取

8、實驗組和對照組大鼠二腹肌前腹置于有RNALater液的DEPC處理的EP管中，迅速置于液氮罐中，于每次標本收集結束時移于-80冰箱保存。1.5 二步法RTPCR 提取總RNA，逆轉錄合成cDNA第一鏈，分別按說明書進行。引物設計合成：MMP2上游引物：5CTA TTC TGT CAG CAC TTT GG3，下游引物：5CAG ACT TTG GTT CTC CAA CTT3，產物長度310bp；MMP9上游引物：5TTG GCT TCC TCC GTG ATT3，下游引物：5TGT ATG GTC GTG GCT CAT A3，產物長度293bp； actin上游引物：5TCC TTC CT

9、G GGT ATG GAA TC3，下游引物：5ACT CAT CGT ACT CCT GCT TG3，產物長度300bp。PCR DNA擴增按說明書進行。MMP2擴增反應條件為：95預變性5min，95變性30s，55退火30s，72延伸2min，共35個循環，最后72再延伸7min。MMP9擴增反應條件為：MMP9的退火溫度為60，其余條件同MMP2。1.6 實時熒光定量PCR 提取總RNA，逆轉錄合成cDNA第一鏈同上。在進行DNA擴增時按DyNamo SYBR Green qPCR Kit說明書進行。MMP9，MMP2反應條件除反應為40個循環外，其余同PCR DNA擴增。2 結果2.

10、1 MMP2、MMP9 mRNA的表達 RTPCR產物經20g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴增片斷特異性強，MMP2條帶大小約310bp(圖1)，MMP9條帶大小約293bp(圖2)，actin條帶大小約300bp(圖3)，均與預期大小相符。MMP2，MMP9 mRNA在各實驗組和對照組均有表達。圖1 MMP2 RTPCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果（略）Fig.1 MMP2 agarose gel electrophoresis results of RTPCR production1,2,3,4,5,6,7,8, represent 21dT, 21dC, 7dC, 7dT, 14dC, 14

11、dT, 3dC, 3dT, respectively. T: test group; C: control group圖2 MMP9 RTPCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果（略）Fig.2 MMP9 agarose gel electrophoresis results of RTPCR production1,2,3,4,5,6,7,8, represent 21dT, 21dC, 7dC,7dT,14dC,14dT,3dC, 3dT, respectively. M: marker圖3 actin RTPCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果（略）Fig.3 actin agarose gel

12、electrophoresis results of RTPCR production1,2,3,4,5,6,7,8, represent 21dT, 21dC, 7dC, 7dT,14dC,14dT, 3dC, 3dT, respectively2.2 MMP2、MMP9 mRNA的表達差異2.2.1 MMP2 mRNA在實驗組和對照組的表達差異 見表1。MMP2 mRNA 21d實驗組的表達是對照組的2.8849倍，3d實驗組的表達是對照組的31.6435倍，而7d、14d實驗組的表達與對照組的表達雖然在量上有所減少，但倍數關系不具有統計學意義。MMP2 mRNA 3d、21d組實驗組與對

13、照組比較表達均增加。MMP2 mRNA實驗組各時間點比較：實驗組21d是14d的3.65倍、7d的3.43倍；對照組各時間點比較：對照組21d是3d的14.29倍，14d是3d的21.57倍，7d是3d的21.14倍。表明mRNA水平實驗組21d比14d、7d增加；對照組21d比3d、14d比3d增加。表1 MMP2mRNA的表達差異（略）Table 1 Difference expression of MMP2mRNA2.2.2 MMP9mRNA在實驗組和對照組的表達差異 見表2。MMP9 mRNA 21d實驗組的表達是對照組的2.999倍，3d實驗組是對照組9.009倍，而7d、14d實驗

14、組的表達與對照組雖然在量上有所減少，但倍數關系不具有統計學意義。MMP9 mRNA實驗組21d是14d的2.24倍、7d的3.84倍；對照組21d是3d的5.46倍，14d是3d的12.27倍，7d是3d的6.37倍。表明mRNA水平實驗組21d比14d、7d增加；對照組21d比3d、14d比3d增加。表2 MMP9 mRNA表達差異（略）Table 2 Difference expression of MMP9 mRNA3 討論本研究RTPCR產物凝膠電泳結果顯示正常生長期大鼠二腹肌前腹MMP2和 MMP9的mRNA均表達，這與Schoser等1發現人的正常骨胳肌中存在MMP2, MMP7，

15、MMP9一致。Singh等2用免疫組織化學的方法顯示正常人咀嚼肌中MMP9染色較弱，RTPCR法MMP2 mRNA可測到但MMP2不表達。Balcerzak等3發現牛骨胳肌中存在多種MMPs，MMP1、MMP 2、MMP 9、MMP 14、MMP 16及TIMP1、TIMP2、TIMP3。Kherif等4研究發現在成年小鼠MMP2和 MMP9的酶原和活性形式均表達。Kherif等5發現正常小鼠肌肉組織中MMP9見于神經肌肉接頭處、雪旺氏細胞、肌內神經的神經束膜。免疫標記顯示MMP2見于神經肌肉接頭處但神經處降低，表明的正常骨胳肌中測到的MMPs mRNA的結果與上述文獻報道相似；且在mRNA不

16、同的觀察時間里MMP2和MMP9的mRNA表達量處于動態變化中。由此可推論MMP2和MMP9存在于不同種屬正常骨胳肌中，不同生長發育時間表達不同。說明MMPs在mRNA水平參與了正常骨胳肌生長發育過程中細胞外基質的重塑改建。本研究實時熒光定量PCR結果顯示，大鼠二腹肌前腹中3、21d實驗組MMP2和MMP9的mRNA明顯高于對照組，而7、14d MMP2和MMP9的mRNA表達稍降低，但不具有統計學意義。說明大鼠在下頜功能性前伸后 MMP2、MMP9mRNA水平發生變化，這與Hargreaves等6報道骨胳肌具有對各種生理刺激，包括對運動反應具有顯著適應性的結果一致。運動引起骨胳肌中多種基因m

17、RNA水平升高，這是由于轉錄激活和(或)mRNA穩定性升高。細胞對運動訓練的適應性似乎是單次運動后基因轉錄水平瞬時升高的累積效應。與運動相關，潛在的刺激包括肌肉的伸張和肌張力，運動神經的活動類型，肌肉初期鈣變化，細胞的能量負荷和作用底物的存在，氧張力和循環激素。這些是通過不同的細胞信號機制，作用于廣泛的下游目標和廣泛的轉錄因子?；虮磉_，雖然代表調控的特異位點，但僅僅是從刺激的開始到表現型的適應以及最終的生理反應的復雜過程的一步。 Koskinen等7 在大鼠跑步造成肌肉損傷的模型觀察到，肱四頭肌MMP2、TIMP2在mRNA水平與蛋白水平均升高。 Ahtikoski等8 在大鼠制動模型增長和

18、減少的位置觀察到比目魚肌、腓腸肌IV型膠原mRNA水平降低，表明膠原蛋白的合成下調。MMP2酶原mRNA水平和活性在比目魚肌、腓腸肌和趾長伸肌升高。BarShai等9觀察大鼠骨胳肌制動后，幼年(6月齡)動物制動屈肌中MMP2和MMP9的活性明顯增加。Lo 等10用RTPCR方法研究發現肩部回旋肌撕裂肌肉中MMP3 mRNA水平明顯升高，TIMP2、TIMP3、TIMP4 mRNA水平降低。上述文獻說明運動及各種不同外界因素可引起骨骼肌肌肉MMPs mRNA水平發生變化，表明下頜前伸引起了咀嚼肌中MMPs mRNA變化，MMPs mRNA參與了下頜前伸肌肉的適應性變化過程。另外，本實驗結果顯示M

19、MP2和MMP9 mRNA在7d、14d差異無意義，這可能是組織處于適應階段。MMP2和MMP9 mRNA實驗組21d比14d、7d表達增強，且有統計學意義。說明大鼠在戴矯治器后21d時MMP2和MMP9 mRNA明顯參與了下頜前伸運動。MMP2和MMP9 mRNA在對照組3d、7d、14d隨時間變化表達逐漸增加，而在21d時(相對于14d)增加不明顯，說明MMP2和MMP9 mRNA在生長期大鼠咀嚼肌正常發育過程中有其生理規律。參考文獻：1Schoser BG, Blottner D. Matrix metalloproteinases MMP2, MMP7 and MMP9 in dene

20、rvated human muscle J. Neuroreport, 1999,10(13):27952797. 2Singh A, NelsonMoon ZL, Thomas GJ, et al. Identification of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors type 1 and 2 in human masseter muscle J. Arch Oral Biol, 2000, 45(6):431440. 3Balcerzak D, Querengesser L, Dixon WT, et al. Coo

21、rdinate expression of matrix degrading proteinases and their activators and inhibitors in bovine skeletal muscle J. J Anim Sci, 2001,79(1):94107. 4Kherif S, Lafuma C, Dehaupas M, et al. Expression of matrix metalloproteinases 2 and 9 in regenerating skeletal muscle: a study in experimentally injured

22、 and mdx muscles J. Dev Biol, 1999, 205(1):158170. 5Kherif S, Dehaupas M, Lafuma C, et al. Matrix metalloproteinases MMP2 and MMP9 in denervated muscle and injured nerve J. Neuropathol Appl Neurobiol, 1998,24(4):309319. 6Hargreaves M, CameronSmith D. Exercise, diet, and skeletal muscle gene expression J. Med Sci Sports Exerc, 2002,34(9):15051508. 7Koskinen SO, Kjaer M, Mohr T, et al. Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle