1、脾細(xì)胞保存方法（一）短期保存技術(shù)適用范圍：術(shù)后1周PRT反應(yīng)。保存方法：將分離到的細(xì)胞用適量含10%20%滅活小牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液稀釋重懸。置4C保存較好，可減低細(xì)胞代謝活動。要注意不要迅速改 變細(xì)胞所處的溫度，以免造成細(xì)胞“溫度”休克。保存 1 管即可。（二）長期冷凍保存技術(shù)適用范圍：術(shù)后2周以后的PRT反應(yīng)。保存方法：利用液氮深低溫（-196C）環(huán)境保存細(xì)胞，冷凍時的降溫速度 和細(xì)胞解凍時的升溫速度對細(xì)胞活力的保存有很大影響。低速離心后，取沉積 細(xì)胞用含 10%二甲亞砜的小牛血清配制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管 內(nèi)（保存 3 管），速即放入降溫過渡站中，避免二甲亞砜對細(xì)

2、胞的損傷。用兩 步降溫法，即迅速降溫至-80C低溫冰箱過夜，或在液氮罐液面以上的一層空 間放置片刻，然后再放入液氮中。如需復(fù)蘇細(xì)胞，則需迅速解凍以恢復(fù)細(xì)胞的 活力，要求在20s以內(nèi)完全融化。將凍存管自液氮中取出，立即放入40C溫水中，融化后即從水中取出，吸出細(xì)胞懸液，加入 10倍的培養(yǎng)液中混勻，繼而低 速離心，盡快洗去保護劑，再懸于新培養(yǎng)液中，計數(shù)并檢查細(xì)胞活力，然后置 37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。相關(guān)試劑的配制（一）PBS 800ml 蒸餾水中，溶解 8 克 NaCI、2 克 KCI、1.44 克 Na2HPO和 0.24 克KH2PO4用HCI調(diào)節(jié)PH到7.4，加水定容到1升，高壓蒸

3、汽滅菌20分，室 溫保存?；颍?克Nacl、0.2克KCl、1.44克KH2PO4用HCI調(diào)整PH到到7.4，加水定容到 1升，高壓蒸汽滅菌 20分，室溫保存?；颍涸?800ml 蒸餾水中溶解8g NaCI、0.2g KCI、1.44g Na2HPO4和 0.24g KH2PO4,用 HCI 調(diào)溶液的 pH值至7.4 加水定容至 1L。（二）PHA 10 卩 g/mL （終濃度）。（三）絲裂霉素（mitomycin c,MMC : 50 口 g/mL,for 20 minutes,and then three washes in PBS 。（四）PBLs： 300000 個細(xì)胞加入含 10%F

4、CS勺 100 口 lRPMI，終體積 200 口 l。 ELISPOT操作步驟（一）ELISPOT式驗基本步驟 將適量捕獲性抗體預(yù)先包被于 96孔ELISPOT板上 ,用膠帶封板并在4C孵 育過夜。將板用PBS洗3遍，再用含體積比10%胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)基封閉，室溫 下孵育至少1h0 FCS可以封閉所包被抗體的FC受體以降低非特異性反應(yīng)。 將細(xì)胞樣品，如外周血單核細(xì)胞（PBMC）,用含10%FC的培養(yǎng)基稀釋，分裝 于ELISPOT板孔中，再加入特異的刺激物，陰性對照孔中只加入培養(yǎng)基，陽性對 照孔加入植物血凝素（PHA,10卩g/mL）,37 C ,體積比為5 % CO2培養(yǎng)24h。 用

5、含體積比0.01%Tween2啲PBS洗6次，以棄去細(xì)胞，加入生物素化抗細(xì)胞 因子的檢測抗體 , 孵育3 h0 再洗6次后，加入AKP或HR標(biāo)記的鏈親和素，室溫孵育23ho 用PBSTween2再洗5次，加入BCIP/NBT底物，室溫下顯色，待出現(xiàn)紫色（AKP 和底物的產(chǎn)物）或紅色（HRF和底物的產(chǎn)物）斑點時，即可用立體解剖顯微鏡或計 算機輔助成像分析系統(tǒng)計算斑點數(shù) , 并用斑點形成單位 （ sfu/ L 百萬加入細(xì)胞 ）記錄結(jié)果。每一個斑點代表一個特異分泌 CK的細(xì)胞。若預(yù)先包被抗原，則可用于ASC測定,這時,每一個斑點代表一個分泌特異抗體的細(xì)胞。細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞數(shù)就是：四大格總數(shù) /4*10

6、4/ml ，再乘以稀釋倍數(shù)。 ELISPOT操作注意事項（一）背景顏色過強可通過下列方法解決可增加12次PBSTween-20清洗；顯色反應(yīng)前用PBS洗板，因為Wash Buffer的Tween-20可導(dǎo)致背景過強； 適當(dāng)延長風(fēng)干時間；實驗前洗細(xì)胞要完全。（二）實驗后，微板要置 37 度以下，否則會損壞微板。設(shè)計好試驗 , 把每個孔 要加入的內(nèi)容做成卡片。（三）次日，傾倒包被液，用 PBS 洗滌 3 次。最后一次，在滅菌的吸水紙上摳 干。（四）整個實驗設(shè)置1組正對照（PHA刺激），每一個細(xì)胞樣品（同一個捐獻者 或?qū)嶒瀯游铮?要設(shè) 1 組負(fù)對照 （不加刺激物） ，整塊板還要加 1 組背景對照 （

7、不 含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基和所有檢測試劑），均設(shè)復(fù)孔。這步加完所有樣品之后，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，37C培養(yǎng)18-24h，注意：碰撞會引起細(xì)胞移位，造成斑 點模糊，拖尾。在整個培養(yǎng)過程中應(yīng)避免移動、碰撞培養(yǎng)板，并盡量減少開關(guān) 培養(yǎng)箱的次數(shù)。（五） protocol（一）用coati ng buffer 稀釋捕捉抗體，每孔100 口 l稀釋抗體，蓋上板蓋，4度過夜。（二）甩干，每孔 200 口 IBIocking Solution洗 1 次，每孔 200 口 IBIockingSolution ，蓋板，室溫培養(yǎng) 2h。（三）棄去 Blocking Solution ，用完全 1640 （RPMI164

8、0 FBS 青霉素和 L 谷氨酰胺）稀釋絲裂原或抗原，100 口 I加入每孔。（四）1X 105cells/ml 2X 106cells/ml 細(xì)胞懸液每孔 100 口 I，加蓋，5 % CO2 濕盒培養(yǎng)（時間224h不等）。（五）吸出細(xì)胞懸液，去離子水洗 35分鐘，共2次。每孔200卩IWash BufferI，3次，棄液，加稀釋檢測抗體（Dilution Buffer ），每孔100卩I，加蓋室 溫培養(yǎng) 2h。（六）棄去檢測抗體，每孔200 口 IWash Buffer I ，3次，每次12分鐘。（七）Dilution Buffer稀釋酶聚合物（Streptavidin-HRP ），每孔

9、100 口 I 稀釋酶。加蓋，室溫培養(yǎng) 1h。（八）棄去酶聚合物，每孔200 口 IWash Buffer I ，4次，每次12分鐘。每孔 200 口 IWash Buffer II ， 2 次。每孔 100 口 I 顯色 Substrate Solution ，觀測 反應(yīng) 5 60 分鐘，不要反應(yīng)顯色過度，以免背景色過強。去離子水洗終止顯色 反應(yīng)。（九）室溫 2h 風(fēng)干或過夜，去除底部塑料托盤將有助于風(fēng)干，分析前置塑料密 閉袋內(nèi)避光。相關(guān)試劑的配制（一） Coati ng Buffer : 1 X PBS 800ml 蒸餾水中，溶解 8 克 NaCI、0.2 克 KCI、1.44克Na2HP

10、O4和0.24克KH2PO4用HCI調(diào)節(jié)PH到7.2，加水定容到1 升, 高壓蒸汽滅菌 20 分，室溫保存二） Blocking Solution ：細(xì)胞完全培養(yǎng)基（ RPMI1640）， 10 FBS、 1青鏈酶素和 L谷氨酰胺（Gibco-BRL No. 10378-016 ）。（三）Wash Buffer I : 1 x PBS包含0.05% Tween-20 （0.5 ml Tween-20 per 1 LPBS）。（四）Wash Buffer II : 1xPBS。（五）Dilution Buffer : 1 x PBS包含 10% FBS（六）Substrate Solution : AEC（ 3-氨基-9-乙基咔唑，Sigma A-5754）儲存 溶液：100mgAECn 10ml DMF（N,N二甲基甲酰胺，sigma D-4551）,儲存在玻璃瓶內(nèi)；0.1M醋酸鹽溶液：將0.2M的（冰）醋酸148ml加入352ml0.2M醋酸鈉溶液中， 加入水調(diào)整至1 升, PH5.0；333.3卩l(xiāng) of AEC儲存溶液加入10ml0.1M醋酸溶液中，0.45卩m filter 濾過，加入5卩l(xiāng) H2O2 （30%），即刻使用。試劑保存（1） 如果短時間內(nèi)不用，溶解的檢測抗體應(yīng)分裝和保存于一20C，在這種條件下，