1、熒光光譜教程一、化學發光反應的類型1直接化學發光和間接化學發光化學發光反應可分直接發光和間接發光。直接發光是被測物作為反應物直接參加化學發光反應，生成電子激發態產物分子，此初始激發態能輻射光子。表示如下：式中A或B是被測物，通過反應生成電子激發態產物C*，當C*躍遷回基態時，輻射出光子hv。 間接發光是被測物A或B通過化學反應后生成初始態C*，C*不直接發光，而是將其能量轉移給F，使F處于激發態，當F*躍遷回基態時，產生發光。如下式表示 式中C*為能量給予體，而F為能量接受體。例如，用羅丹明B沒食子酸的乙醇溶液測定大氣的O3，其化學發光反應就屬這一類型。 沒食子酸被O3氧化時吸收反應所產生的化

2、學能，形成受激中間體A*，而A*又迅速將能量轉給羅丹明B，并使羅丹明B分子激發，處于激發態的羅丹明B分子回到基態時，發射出光子。該光輻射的最大發射波長為584nm。2. 氣相化學發光和液相化學發光按反應體系的狀態來分類，如化學發光反應在氣相中進行稱氣相化學發光，在液相或固相中進行稱液相或固相化學發光，在兩個不同相中進行則稱為異相化學發光。本節主要討論氣相和液相化學發光，其中液相化學發光在痕量分析中更為重要。（1）氣相化學分光主要有O3、NO、S的化學發光反應，可用于監測空氣中的O3、NO、NO2、H2S、SO2和CO等。 臭氧與乙烯的化學發光反應機理是O3氧化乙烯生成羰基化合物的同時產生化學發

3、光，發光物質是激發態的甲醛。這個氣相化學發光的最大波長為435nm，發光反應對O是特效的，線性響應范圍為1ng·mL-11g·mL-1。 一氧化氮與臭氧的氣相化學發光反應有較高的化學發光效率，其反應機理為：這個反應的發射光譜范圍為600875nm，靈敏度可達1ng·mL-1。若需同時測定大氣中的NO2時，可先將NO2還原為NO，測得NO總量后，從總量中減去原試樣中NO的含量，即為NO2 的含量。 SO2、NO、CO等都能與氧原子進行氣相化學光反應，他們的反應分別為：此反應的最大發射波長為200nm，測定靈敏度可達1ng·mL-1。 發射光譜范圍為4001

4、400nm，測量靈敏度可達1ng·mL-1。 發射光譜范圍為300500nm，測定靈敏度可達1ng·mL-1。這些反應的關鍵是要求有一個穩定的氧原子源，一般可由O3在1000的石英管中分解為O2和O而獲得。 火焰化學發光，氮的氧化物（如NO2、NO等）及揮發性的硫化物（如SO2、H2S、CH3SH等）富氫火焰中燃燒都會發生化學發光。（2）液相化學發光用于這一類化學發光分析的發光物質有魯米諾、光澤精、洛粉堿等，其中魯米諾（Lominol）化學發光反應機理研究得最久，其化學發光體系已用于分析化學測量痕量的H2O2以及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg和Th等金屬離子。

5、魯米諾是3-氨基苯二甲酰肼，它產生化學發光反應的 為0.010.05。魯米諾在堿性溶液中形成疊氮醌（a），疊氮醌在堿性溶液中與氧化劑如H2O2作用生成不穩定的橋式六員環過氧化物中間體（b）。然后再轉化為激發態的氨基鄰苯二甲酸根離子（c），其價電子從第一電子激發態的最低振動能級層躍遷回基態中各個不同振動能級層時，產生最大發射波長為425nm的光輻射，整個反應歷程可表示如下：以上的化學發光反應的速率很慢，但某些金屬離子（如在本節開始所提到的金屬離子）會催化這一反應，增強發光強度。利用這一現象可以測定這些金屬離子。還可將分析物通過酶的轉化，生成化學發光反應物，然后再進行化學發光反應，根據化學發光強度

6、間接測定被分析物。例如，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下進行氧化反應，反應產物H2O2可通過魯米諾化學發光反應進行測定，從而間接測定葡萄糖。 氨基酸的測定也一樣：H2O2使魯米諾發光。如果使酶促反應的底物濃度一定，則上述反應可用于酶測定或酶動力學研究。下表中給出其他用于液相化學發光反應的發光試劑： 俗名洛粉堿（Lophine）光澤精（Lucigenin）沒食子酸（）系統命名2,4,5三苯基咪唑N,N二甲基二丫啶硝酸鹽焦性沒食子酸（）結構式二、化學發光的基本原理某些物質在進行化學反應時，由于吸收了反應時產生的化學能，而使反應產物分子激發到激發態，受激分子由激發態去激化躍遷回基態時以輻射形式發射出一定

7、波長的光。這種吸收化學能使分子激發并發光的過程，稱為化學發光。利用化學發光建立起來的分析方法稱為化學發光分析法。化學發光也發生在某些生物體系內，稱為生物發光。化學發光分析法的特點是，靈敏度高，選擇性好，儀器設備簡單，分析速度快。但是目前可供發光用的試劑還不多，應用還有限，發光機理有待進一步研究。化學發光是基于化學反應所提供的化學能使分子激發而發射光的，任何一個化學發光反應都包含有化學激發和發光兩個關鍵過程，它必須滿足下列條件：1化學反應必須提供足夠的激發能，激發能的主要來源是反應焓，能在可見光范圍內發生化學發光的物質，其激發能E通常是在150400KJ·mol1范圍。許多氧化還原反應

8、的反應焓與此相當，因此大多數化學發光反應為氧化還原反應。2要有有利的化學反應歷程，使反應產生的化學能用于不斷地產生激發態分子。對于有機化合物的液相化學發光來說，芳香族化合物和羰基化合物更容易生成激發態的產物。3激發態分子躍遷回基態時，要能釋放出光子，或激發態分子能將能量轉移給另一種分子，使該分子受激后發射光子。總之，激發態分子不能以熱的形式損失能量。化學發光反應的化學發光效率，又稱為化學發光的總量子產率。它決定于生成激發態產物分子的化學激發效率和激發態分子的發射效率。定義為：化學反應的發光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由參加反應物質的化學反應所決定。每一個化學發光反應都有其特征的化學

9、發光光譜及不同的化學發光效率。 化學發光反應的發光強度ICl以單位時間內發射的光子數表示，它與化學發光反應的速率有關，而反應速率又與反應分子濃度有關。可以下式表示：式中表示t時刻的化學發光強度，是與分析物有關的化學發光效率，dc/dt是分析物參加反應的速率。如果反應是一級動力學反應，t時刻的化學發光強度與該時刻的分析物濃度成正比，就可以通過檢測化學發光強度來定量測定分析物質。在化學發光分析中通常用峰高表示發光強度，即峰值與被分析物濃度成線性關系。另一種分析方法是利用總發光強度與分析物濃度的定量關系。就是在一定的時間間隔里對化學發光強度進行積分，得到：如果取t1=0，t2為反應結束所需的時間，則

10、得到整個反應產生的總發光強度，它與分析物濃度存在線性關系。三、化學發光分析的應用化學發光分析最大的特點是靈敏度高，對氣體和痕量金屬離子的檢出限都可達ng·mL1級。在環境檢測中化學發光法比吸收光譜法和微庫侖法具有更高的靈敏度，又能進行快速連續分析，因此氣相化學發光反應已廣泛用于空氣中有害物質如O3、氮氧化物、CO、SO2、H2S等的監測。其測定靈敏度可達13ng·mL1。液相化學發光反應，如魯米諾、光澤精、沒食子酸等發光體系可測定天然水和廢水中的金屬離子。在醫學、生物學、生物化學和免疫學研究中，化學發光分析也是一種重要的手段。表4.84.10列舉了一些實例。四、熒光和磷光分

11、析法的基本原理第一次記錄熒光現象的是16世紀西班牙的內科醫生和植物學家N.Monardes，他于1575年提到，在含有一種稱為“Lignum Nephriticum”的木頭切片的水溶液中，呈現出極為可愛的天藍色。以后逐步有一些學者也觀察和描述過熒光現象，但對其本質及含義的認識都沒有明顯的進展。直到1852年，對熒光分析法具有開拓性工作的Stokes在考察奎寧和綠色素的熒光時，用分光計觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍為長些，而不是由光的漫反射引起的，從而導入熒光是光發射的概念，并提出了“熒光”這一術語，他還研究了熒光強度與熒光物質濃度之間的關系，并描述了在高濃度或某些外來物質存在時的熒光猝滅現

12、象。可以說，他是第一個提出應用熒光作為分析手段的人。1867年，Goppelsr?de應用鋁一桑色素配位化合物的熒光測定鋁，這是歷史上首次進行的熒光分析工作。進入二十世紀以來，熒光現象被研究得更多了，在理論和實驗技術上都得到極大的發展。特別是近幾十年來，在其他學科迅速發展的影響下，隨著激光、計算機和電子學的新成就等一些新的科學及技術的引入，大大推動了熒光分析法在理論上及實驗技術上的發展，出現了許多新的理論和新的方法。在我國，二十世紀五十年代初期僅有極少數的分析工作者從事熒光分析方面的研究工作。到了七十年代以后，已逐步形成一支在這個研究領域中的工作隊伍。目前，研究內容已從經典的熒光分析方法擴展到

13、新近發展起來的一些新方法和新技術。磷光也是某些物質在紫外光照射下所發射的光，早期并沒有與熒光明確的區分。1944年Lewis和Kasha提出了磷光與熒光的不同概念，指出磷光是分子從亞穩的激發三重態躍遷回基態所發射出的光，它有別于從激發單重態躍遷回基態所發射的熒光。磷光分析法由于其有某些特點，幾十年來的理論研究及應用也不斷得到發展。五、熒光和磷光的產生在一般溫度下，大多數分子處在基態的最低振動能級。處于基態的分子吸收能量(電能、熱能、化學能或光能等)后被激發為激發態。激發態是很不穩定的，它將很快地釋放出能量又重新躍遷回基態。若分子返回基態時以發射電磁輻射(即光)的形式釋放能量，就稱為“發光”。如

14、果物質的分子吸收了光能而被激發，躍遷回基態所發射的電磁輻射，稱為熒光和磷光。現從分子結構理論來討論熒光和磷光的產生機理。每個分子中都具有一系列嚴格分立相隔的能級，稱為電子能極，而每個電子能級中又包含有一系列的振動能級和轉動能級。分子中電子的運動狀態除了電子所處的能級外，還包含有電子的多重態，用M=2S+1表示，S為各電子自旋量子數的代數和，其數值為0或1 。根據Pauli不相容原理，分子中同一軌道所占據的兩個電子必須具有相反的自旋方向，即自旋配對。若分子中所有電子都是自旋配對的，則S=0，M=1，該分子便處于單重態(或叫單重線)，用符號S表示。大多數有機化合物分子的基態都處于單重態。基態分子吸

15、收能量后，若電子在躍遷過程中，不發生自旋方向的變化，這時仍然是M=1，分子處于激發的單重態；如果電子在躍遷過程中伴隨著自旋方向的變化，這時分子中便具有兩個自旋不配對的電子， 即S=1，M=3，分子處于激發的三重態，用符號T表示。圖14.1為電子重態示意圖。處于分立軌道上的非成對電子，自旋平行要比自旋配對更穩定些(洪特規則)，因此在同一激發態中，三重態能級總是比單重態能級略低。圖14.2為能級及躍遷示意圖，其中S0、S1和S2分別表示分子的基態、第一和第二電子激發的單重態；T1和T2則分別表示分子的第一和第二電子激發的三重態。V=0、1、2、3、表示基態和激發態的振動能級。圖14.1  

16、;   單重態系三重態激發示意圖圖14.2     熒光和磷光體系能級圖處于激發態的分子是很不穩定的，它可能通過輻射躍遷和非輻射躍遷的形式去活化(去激發)釋放出多余的能量而返回基態。輻射躍遷主要涉及到熒光，延遲熒光或磷光的發射；無輻射躍遷是指以熱的形式釋放多余的能量，包括振動弛豫、內部轉移、系間跨越及外部轉移等過程。圖14.2表示分子激發和去活化的能量傳遞過程：1振動弛豫（Vibration relaxation，簡寫為VR）當分子吸收光輻射(為圖14.2中的1、2)后可能從基態的最低振動能級(V=0)躍遷到激發單重態Sn(

17、如圖中S1、S2)的較高振動能級上。然后，在液相或壓力足夠高的氣相中，分子間的碰撞幾率很大，分子可能將過剩的振動能量以熱的形式傳遞給周圍環境，而自身從激發態的高振動能級躍遷至該電子能級的最低振動能級上，這個過程稱為振動弛豫。發生振動弛豫的時間為1012s數量級。2內部轉移（Internal conversion，簡寫為IC）當高電子能級中的低振動能級與低電子能級中的高振動能級發生重疊時，常發生電子從高電子能級以無輻射躍遷形式轉移至低電子能級。如圖14.2中，S2和T2中的低振動能級與S1和T1中的高振動能級重疊，電子可以通過振動能級的重疊從S2躍遷至S1，或從T2躍遷至T1。這個過程稱為內部轉

18、移。內部轉移的時間為1011s1013s數量級。振動弛豫及內部轉移的速率比由高激發態直接發射光子的速率快得多，所以，分子吸收輻射能后不管激發到哪一個激發單重態，都能通過振動弛豫及內部轉移而躍遷到最低(第一)激發單重態的最低振動能級。3熒光發射（Fluorescence emission，FE）處于激發單重態的電子經振動弛豫及內部轉移后到達第一激發單重態(S1)的最低振動能級(V=0)后，以輻射的形式躍遷回基態(S0)的各振動能級，這個過程為熒光發射，發射的熒光波長為。由于經過振動弛豫和內部轉移的能量損失，因此熒光發射的能量比分子吸收的能量要小，熒光發射的波長比分子吸收的波長要長，即。第一激發單

19、重態最低振動能級的平均壽命約為109104s，因此熒光壽命也在這一數量級。4系間跨躍（Intersystem Crossing，ISC）系間跨躍是指不同多重態之間的無輻射躍遷過程，它涉及到受激發電子自旋狀態的改變。如由第一激發單重態S1躍遷至第一激發三重態T1，使原來兩個自旋配對的電子不再配對。這種躍遷是禁阻的(不符合光譜選律)，但如果兩個能態的能層有較大重疊時，如圖14.2中S1的最低振動能級與T1的較高振動能級重疊，就有可能通過自旋一軌道耦合等作用實現這一躍遷。系間跨躍的速度較慢，經歷的時間較長。5磷光發射（Phosphorescence emission，PE）激發態的電子經系間跨躍后到

20、達激發三重態，經過迅速的振動弛豫而躍遷至第一激發三重態的最低振動能級，然后以輻射形式躍遷回基態的各振動能級，這個過程為磷光發射。磷光發射的躍遷仍然是自旋禁阻的，所以發光速度很慢。磷光的壽命為104100s。因此，外光源照射停止后，磷光仍可持續一短時間。由于經過系間跨躍及T1 中振動弛豫丟失了一部分能量，所以磷光波長比熒光波長要長，即必須指出的是，T1還可能通過熱激發而重新躍回S1 即T1S1，然后再由S1經輻射躍遷回S0，即S1S0，發出熒光，這種熒光稱為延遲熒光，其壽命與磷光相近，但波長比磷光短。6外部轉移（External convertion，EC）激發態分子與溶劑分子或其它溶質分子相互

21、碰撞，并發生能量轉移的過程稱為外部轉移。外部轉移能使熒光或磷光的強度減弱甚至消失，這種現象稱為猝滅或熄滅。六、激發光譜和發射光譜熒光和磷光均屬于光致發光，所以都涉及到兩種輻射，即激發光(吸收)和發射光，因而也都具有兩種特征光譜，即激發光譜和發射光譜。它們是熒光和磷光定性和定量分析的基本參數及依據。1. 激發光譜通過測量熒光(或磷光)體的發光通量(即強度)隨激發光波長的變化而獲得的光譜，稱為激發光譜。激發光譜的具體測繪方法是，通過掃描激發單色器，使不同波長的入射光照射激發熒光(磷光)體，發出的熒光(磷光)通過固定波長的發射單色器而照射到檢測器上，檢測其熒光(磷光)強度，最后通過記錄儀記錄光強度對

22、激發光波長的關系曲線，即為激發光譜。通過激發光譜，選擇最佳激發波長發射熒光(磷光)強度最大的激發光波長，常用ex表示。2. 發射光譜，也稱熒光光譜或磷光光譜通過測量熒光(或磷光)體的發光通量(強度)隨發射光波長的變化而獲得的光譜，稱為發射光譜。其測繪方法是，固定激發光的波長，掃描發射光的波長，記錄發射光強度對發射光波長的關系曲線，即為發射光譜。通過發射光譜選擇最佳的發射波長發射熒光(磷光)強度最大的發射波長，常用em表示。磷光發射波長比熒光來得長，圖14.3為萘的激發光譜及熒光和磷光的發射光譜。 圖14.3     萘的激發光譜、熒光和磷光光譜3. 熒光

23、激發光譜和發射光譜的特征 斯托克斯位移在溶液熒光光譜中，所觀察到的熒光發射波長總是大于激發波長，em>ex 。Stokes于1852年首次發現這種波長位移現象，故稱Stokes位移。斯托克斯位移說明了在激發與發射之間存在著一定的能量損失。激發態分子由于振動弛豫及內部轉移的無輻射躍遷而迅速衰變到S1電子激發態的最低振動能級，這是產生其位移的主要原因；其次，熒光發射時，激發態的分子躍遷到基態的各振動能級，此時，不同振動能級也發生振動弛豫至最低振動能級，也造成能量的損失；第三，溶劑效應和激發態分子可能發生的某些反應，也會加大斯托克斯位移。 熒光發射光譜的形狀與激發波長無關由于熒光發射是激發態的

24、分子由第一激發單重態的最低振動能級躍遷回基態的各振動能級所產生的，所以不管激發光的能量多大，能把電子激發到哪種激發態，都將經過迅速的振動弛豫及內部轉移躍遷至第一激發單重態的最低能級，然后發射熒光。因此除了少數特殊情況，如S1與S2的能級間隔比一般分子大(如)及可能受溶液性質影響的物質外，熒光光譜只有一個發射帶，且發射光譜的形狀與激發波長無關。 熒光激發發光譜與吸收光譜的形狀相近似，熒光發射光譜與吸收光譜成鏡像關系 物質的分子只有對光有吸收，才會被激發，所以，從理論上說，某化合物的熒光激發光譜的形狀，應與它的吸收光譜的形狀完全相同。然而實際并非如此，由于存在著測量儀器的因素或測量環境的

25、某些影響，使得絕大多數情況下，“表觀”激發光譜與吸收光譜兩者的形狀有所差別。只有在校正儀器因素后，兩者才非常近似，而如果也校正了環境因素后，兩面的形狀才相同。如果把某種物質的熒光發射光譜和它的吸收光譜相比較低，便會發現兩者之間存在著“鏡像對稱”關系。如圖14.4分別表示苝的苯溶液和硫酸奎寧的稀硫酸溶液的吸收光譜和熒光發射光譜。為什么兩種光譜會互為鏡像關系呢？這不難由熒光發射光譜和吸收光譜的成因來解釋。吸收光譜中的第一吸收帶(波長較長的吸收帶)是由于基態分子吸收光能量被激發到第一電子激發態的各不同振動能級，所以，其形狀取決于第一電子激發態中各振動能級的分布情況(即能量間隔情況)，而熒光光譜是激發

26、態分子從第一電子激發單重態的最低振動能級躍回基態中的各不同振動能級所致，所以熒光光譜的形狀取決于基態中各振動能級的分布情況。一般情況下，基態和第一電了激發單重態中振動能級的分布情況是相同的，所以熒光發射光譜與吸收光譜的形狀是類似的。圖14.5     鏡像對稱規則另一方面，吸收時由基態的最低振動能級躍遷到第一電子激發態的各振動能級，振動能級越高，所吸收的能量越大，即吸收峰的波長越短；而相反，熒光發射是由第一電子激發單重態的最低振動能級躍遷回基態的各振動能級，振動能級越大，所釋放的能量越小，即發射的熒光峰波長越長。另外，由于電子躍遷的速率非常之快，以致于躍

27、遷過程中分子中原子核的相對位置沒有明顯發生變化，其結果是，假如吸收時由S0的V=0與第一激發態S1的V=2 之間的躍遷幾率最大(即強度最大)，那么在熒光發射時，由S1的V=0躍回S0的V=2的幾率也應該最大，如圖14.5所示。基于上述原因，熒光發射光譜與吸收光譜之間顯現鏡像對稱關系。七、有機化合物的熒光在已知大量的有機化合物當中，僅有一小部分會發射強的熒光，這與有機化合物的結構密切相關。能發射強熒光的有機化合物通常具有以下的結構特征：1. 具有電子躍遷類型的結構實驗表明，大多數能發熒光的化合物都是由或躍遷激發，然后經過振動弛豫等無輻射躍遷，再發生或躍遷而產生熒光。而其中吸收時躍遷的摩爾吸光系數

28、比躍遷的大102103倍， 躍遷的壽命(107109)比躍遷的壽命(105107)短，因此熒光發射的速率常數Kf值較大，熒光發射的效率高。因此，躍遷發射熒光的強度大。此外，在躍遷過程中，通過系間跨躍從單重態躍遷至三重態的速率常數KISC也比較小，有利于熒光的發射。總之，躍遷的類型是產生熒光的最主要躍遷類型。2. 具有大的共軛鍵結構發生熒光(或磷光)的物質，其分子都含有共軛雙鍵(鍵)的結構體系。共軛體系越大， 電子的離域性越大，越容易被激發，熒光也就越容易發生，且熒光光譜向長波移動。大部分熒光物質都具有芳環或雜環，芳環越大，其熒光(或磷光)峰越向長波移動，且熒光強度往往也較強。例如苯和萘的熒光位

29、于紫外區，蒽位于藍區，丁省位于綠區，戊省位于紅區,見表14.1。同一共軛環數的芳族化合物，線性環結構者的熒光波長比非線性者要長，如蒽和菲，其共軛環數相同，前者為線性環結構，后者為“角”形結構，前者em為400nm，后者em為350nm。3. 具在剛性平面結構實驗發現，多數具有剛性平面結構的有機化合物分子都具有強烈的熒光，因為這種結構可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其他溶質分子之間的相互作用減少，即可減少能量外部轉移的損失，有利于熒光的發射。而且平面結構可以增大分子的吸光截面，增大摩爾吸光系數，增強熒光強度。酚酞與熒光黃(亦稱熒光素)的結構十分相近(下圖所示)，只是由于熒光黃分子中的氧橋使其具

30、有剛性平面結構，因而在溶液中呈現強烈的熒光，在0.1mol·L-1的NaOH溶液中，熒光效率達0.92，而酚酞卻沒有熒光。又如芴與聯二苯(下圖所示)，由于芴中的亞甲基使分子的剛性平面增加，導致兩者在熒光性質上的顯著差別，前者熒光產率接近于1，后者僅為0.18。萘與維生素A都具有5個共軛鍵(下圖所示)，而前者為平面結構，后者為非剛性結構，因而前者的熒光強度為后者的5倍。八、無機化合物的熒光無機化合物的熒光有無機鹽類的熒光和金屬螯合物的熒光兩種： 某些無機鹽類的熒光無機化合物本身能發熒光(或磷光)的不多，常見的主要有鑭系元素()的化合物，U()化合物，類汞離子化合物Tl()、Sn()、P

31、b()、As()、Sb()、Bi()、Se()、Te()等，以及某些過渡金屬離子，如Cr()等。這些化合物在低溫(液氮)下都有較高的熒光效率和選擇性，因此常用低溫熒光法進行測定。 金屬螯合物的熒光不少不發熒光的無機離子與具有吸光結構的有機試劑發生配合作用，生成會發熒光的螯合物，可以進行熒光測定。這種能發熒光的螯合物可能是螯合物中配位體的發光，也可能是螯合物中金屬離子的發光。 螯合物中配位體的發光。這一類螯合物中金屬離子的外電子層具有與惰性氣體相同的結構，為抗磁性的離子，它與含有芳基的有機配位體形成螯合物時多數會發射較強的熒光。這是因為原來的配位體雖有吸收光構型，但其最低激發單重態的S1是n型，

32、及缺乏剛性平面結構，所以并不發熒光，而與金屬離子配合后，配位體變為最低激發單重態的型，且由于螯合物的形成，而具有剛性平面結構，因此能發射熒光。如下列例子所示 螯合物中金屬離子的熒光。這些金屬離子的次外層中具有未充滿電子的d軌道或f軌道，它們吸收光時，會發生或的吸收躍遷。也會發生或的發光躍遷，但躍遷幾率很小，吸光及發光很弱。當與配位體螯合時，則首先是發生配位體的 吸收躍遷，而通常金屬離子的或能層在配位體激發后最低激發單重態S1能層的下方，因而可以發生能量的轉移，由S1轉移給或，然后發生 或躍遷，使躍遷幾率增大，發光強度增大。九、熒光（或磷光）量子產率激發態分子的去激發包括兩種過程，即無輻射躍遷過

33、程和輻射躍遷過程，輻射躍遷可發射熒光(延遲熒光)或磷光。而有多少比例的激發分子發射出熒光(或磷光)呢。可以用熒光量子產率-有時也叫熒光效率或熒光產率(或磷光量子產率)表示。定義為：熒光物質吸光后所發射熒光的光量子數與所吸光的光量子數之比，即：許多吸光物質并不能發射熒光，這是因為激發態分子的去激發過程中，除發射熒光(磷光)外，還有無輻射躍遷過程與之競爭。所以，熒光量子產率與其他各種過程的速率常數有關。表14.4列出分子吸光及去激發的過程及速率常數。因此，可以表示為：式中，Ki為無輻射躍遷各種過程的速率常數之和，即Ki KICKISCKQQ。從上式可以看出，凡是能使Kf值升高而使其它Ki值降低的因

34、素，都可以提高量子產量，增強熒光。對于高熒光分子(如熒光素)來說，接近于1，說明該分子的Kf較大，Ki相對于Kf可忽略不計。一般熒光物質小于1，不發熒光的物質Kf為0，0。一般說來，Kf主要取決于化學結構(上節已敘述)，Ki則主要取決于化學環境的因素，同時也與化學結構有關。從各種速率常數還可以得到熒光壽命f: 磷光的量子產率與熒光量子產率相似。十、熒光強度與熒光物質濃度的關系熒光強度If正比于吸收的光量(光強)Ia及熒光量子產率：If=Ia吸收的光量(光強)Ia應為入射光的光強I0與透射光的光強 It 之差，即： Ia I0It根據吸收定律(朗伯-比耳定律)： 所以：式中，為摩爾吸光系數，b為

35、樣品溶液的光程(即液池的厚度)，C為樣品的摩爾濃度。而的展開式為：當濃度C很稀，吸收光量不超過總光量的2時，(約為0.02)，則展開式的高次項可忽略，即：所以： 當I0及b一定時：IfKC上式表明，熒光強度與熒光物質的濃度成正比，這是熒光分析法定量分析的依據。但是，應該注意的是，此式只適合于熒光物質的稀溶液。當C較大，時，線性關系將受到破壞。其原因是受激后的激發態分子與體系中的其他分子所碰撞，使其以非輻射擊躍遷的形式去激化，產生熒光猝滅，或者激發態分子所發射的熒光被沒受激發的分子所吸收，而又因一般小于1，所以發生所謂的“自吸收”現象而使熒光減弱。為了減少碰撞去激發的機會，可以用降低溫度，增大溶

36、液粘度或把熒光(磷光)物質附著在固體支撐物測定的方法，以減少猝滅效應。特別要指出的是磷光發射，因其平均壽命較長，碰撞去激發的效應更大，所以常采用低溫磷光或固體磷光方法。十一、影響熒光強度的環境因素影響熒光強度的因素除了熒光物質的本身結構及其濃度以外，環境也是一個很重要的因素，主要是溶劑、溫度、介質酸度、氫鍵的形成及其它的因素。1. 溶劑的影響同一種熒光體在不同的溶劑中，其熒光光譜和熒光強度都可能會有顯著的差別，尤其是那些在芳環上含有極性取代基的熒光體，它們更容易受到溶劑的影響。溶劑的影響一般分為一般的溶劑效應和特殊的溶劑效應。 一般溶劑效應指的是溶劑的折射率和介電常數的影響。這種影響是普遍存在

37、的。一般情況下，折射率加大，將使熒光光譜的Stokes位移減少，而介電常數加大，將使Stokes位移加大，且熒光效率提高。 特殊溶劑效應指的是熒光體與溶劑分子的特殊化學作用，如氫鍵的形成和某些化合作用。特殊溶劑效應對熒光光譜及強度的影響往往大于一般溶劑效應。對于熒光發射的主要電子躍遷類型躍遷來說，電子激發態比基態具有更大的極性，所以隨著溶劑極性的增大，對激發態比對基態產生更大的穩定作用，因此降低了躍遷的能量，熒光光譜發生紅移，而且熒光增強。表14.5為8-巰基喹啉在幾種不同溶劑中熒光特性。但應該注意到一些相反的情況，如苯胺萘磺酸類化合物隨溶劑極性的增大，光譜發生藍移，且強度降低。如果溶劑分子與

38、熒光物質形成氫鍵，將使熒光峰明顯紅移，熒光強度一般增大。如果溶劑分子和熒光物質形成化合物，或溶劑使熒光物質的電離狀態或存在型體發生變化，則熒光峰位置和強度都會發生較大的變化。此外，在含有重原子的溶劑(如碘化乙酯、二碘烷、溴化正丙酯等)中，一般也使熒光體的熒光強度降低，而使磷光強度升高，這種現象稱為“外重原子效應”。溶劑中重原子的高核電荷引起溶質分子的自旋與軌道之間強烈的耦合作用，結果使 的系間跨躍、磷光發射及的系間跨躍等過程的幾率增大。因此熒光削弱，而磷光增強。2. 溫度的影響溫度對于溶液的熒光強度有著顯著的影響。通常，隨著溫度的增高，熒光物質溶液的熒光量子產率及熒光強度將降低，圖14.7為不

39、同溫度下鄰菲啰啉的熒光光譜。圖14.7     不同溫度下鄰菲啰啉的熒光光譜（在鄰二苯中）當溶液不存在猝滅劑時，熒光的量子產率與去激化的輻射躍遷過程及非輻射躍遷過程的相對速率有關。一般認為輻射過程速率不隨溫度變化，因此，熒光量子產率的變化反映了非輻射躍遷過程速率的變化。隨著溶液溫度的升高，介質粘度降低，分子運動速率也變大，從而使熒光分子與溶劑分子或其它分子的碰撞幾率增加，外部能量轉移速率變大。因此，熒光量子產率降低。 溶液溫度上升而使熒光強度降低的另一個主要原因是分子的內部能量轉化作用。多原子分子的基態和激發態的位能曲線可能相交或相切于一點，如圖14.8

40、所示。圖14.8     內部能量轉化的位能曲線當激發態分子接受到額外熱能而沿激發位能曲線AC移動至交點C時，有可能轉換至基態的位能曲線NC，使激發能轉化為基態的振動能，隨后通過振動弛豫而喪失振動能量。3介質酸度的影響帶有酸性基團或堿性基團的大多數芳香族化合物，其熒光特性都與溶液的酸度(pH)有關。這是因為在不同酸度介質條件下，熒光體的存在型體不同，不同的型體(分子與其離子)在電子構型上有所不同，而且基態和激發態所表現出來的酸、堿性也有所差別。因此不同酸度下，熒光光譜和熒光強度都可能發生變化。所以在熒光分析中一般都要較嚴格地控制溶液的pH值。下列為兩個實

41、例：利用金屬離子與有機試劑反應生成螯合物而進行熒光測定時，也受到溶液pH的影響。一方面pH會影響螯合物的生成和穩定性，另一方面還可能影響螯合物的組成，因而影響它們的熒光特性。例如，Ga3+與2，2-二羥基偶氮苯在pH3-4溶液中生成1：1的配合物，它能發射熒光；而在pH6-7溶液中則生成1：2的配合物，它不發射熒光。4. 形成氫鍵的影響熒光物質與溶劑分子或其他溶質分子所形成的分子間氫鍵可能有兩種情況：一種是在激發之前熒光體的基態所形成的氫鍵，這種情況一般使摩爾吸光系數增大，即吸收增強，因此熒光強度增大。同時也可能發生分子極性及共軛程度的變化，因此吸收光譜(熒光激發光譜)及熒光發射光譜都可能發生

42、變化。另一種情況是激發之后熒光體的激發態所形成的氫鍵，所以吸收光譜(激發光譜)不受影響，而熒光發射光譜會發生變化。5. 其他方面影響表面活性劑的存在對熒光光譜及強度都會產生影響。熒光體在由表面活性劑形成膠束的微環境中，不僅可以減少非輻射去激化過程和猝滅過程的速率，提高熒光量子產率，而且由于表面活性劑參與組成配合物而增大分子的有效吸光截面積，導致摩爾吸光系數的增大。因此，在膠束溶液中，熒光強度增強，測定的靈敏度提高。多元配合物的形成通常也可以增強熒光強度，提高熒光測定的靈敏度。十二、熒光的猝滅熒光的猝滅(熄滅)一詞，從廣義上說，指的是任何可使某給定熒光物質的熒光強度降低的作用，或者任何可使熒光強

43、度不與熒光物質的濃度呈線性關系的作用。從狹義上說，指的是熒光物質分子與溶劑分子或其它溶質分子之間的相互作用，導致熒光強度降低的現象。與熒光物質發生相互作用而使熒光強度降低的物質，稱為猝滅劑。熒光猝滅的形式很多，機理也比較復雜。主要有如下幾種類型：1. 碰撞猝滅碰撞猝滅是熒光猝滅的主要類型之一。它指的是處于激發單重態的熒光分子與猝滅劑分子Q相碰撞，使釋放熱量給環境，以無輻射的形式躍遷回基態，產生猝滅作用，這種猝滅也稱動態猝滅。這一過程可以表示如下：根據熒光量子產率的定義，在無Q時的量子產率0及Q存在時的量子產率q 分別為:則無Q時的熒光強度(If)0及Q存在時的熒光強度(If)q之比為: 式中，

44、K稱為猝滅速率常數，可以推得，K與熱力學溫度T成正比，與溶液的粘度成反比。可見，碰撞猝滅效應隨溫度的升高而增強，而隨粘度的增大而降低。2. 生成化合物的猝滅生成化合物的猝滅也稱為靜態猝滅，它指的是基態的熒光物質與猝滅劑反應生成非熒光的化合物，導致熒光的猝滅，可用下式表示：從上式也容易推導出熒光強度與猝滅劑平衡濃度之間的關系：式中(If)0及(If)q分別為加入猝滅劑Q之前及之后的熒光強度，CM為熒光物質的總濃度。上式與動態猝滅的關系式一樣，只是常數K的意義不同。利用上面的關系式可以用于熒光猝滅法的定量分析。3. 能量轉移猝滅當猝滅劑吸收光譜與熒光體的熒光光譜有重疊時，處于激發單重態的熒光體激發

45、分子的能量就可能轉移到猝滅劑分子上，或者猝滅劑吸收了熒光體發射的熒光，使熒光猝滅，而猝滅劑被激發，這種猝滅俗稱“內濾作用”。可用下式表示：4. 氧的猝滅O2可以說是熒光和磷光的最普遍存在的猝滅劑。對于溶液磷光來說，氧的猝滅作用是十分有效的，通常觀察不到溶液的室溫磷光現象。而對于溶液熒光來說，不同的熒光物質或同一熒光物質在不同的溶劑中，對氧的猝滅作用的敏感性有所不同。氧對溶液熒光產生猝滅作用的原因比較復雜，還沒有一個完整的確定說法，可能包含著多種機理。有的認為可能是由于三重態的氧分子和激發單重態的熒光分子相互作用形成激發單重態的氧分子和激發三重態的熒光分子所引起的，如下式表示：也有的認為氧和其它

46、順磁性的物質一樣，它們之所以會使熒光猝滅，是由于它們能夠促進激發單重態的熒光分子的系間跨躍()以及提高熒光物質基態分子的系間吸收躍遷()的幾率；還有的認為熒光猝滅是由于熒光物質受到氧化的緣故。5. 轉入三重態的猝滅在“重原子效應”段落已經敘述，溴化物和碘化物都能產生“重原子效應”，促使熒光分子的激發單重態轉入激發三重態，導致熒光的猝滅。上面也已提及，氧的猝滅作用也可能是O2促使熒光體分子轉入激發三重態所致。6. 熒光物質的自猝滅當熒光物質的濃度較大時，會使熒光強度降低，熒光強度與濃度不成線性關系，稱為熒光物質的自猝滅。自猝滅可能有如下幾個原因： 熒光物質分子之間的碰撞能量損失，這實際上是能量的

47、外部轉移形式。 熒光物質的自吸收，當熒光物質的吸收光譜與熒光發射光譜重疊時，會發生自吸收現象，處于S1激發態的分子發射的熒光被處于基態的分子所吸收，使熒光強度降低。 熒光物質分子的締合。某些熒光體分子處于基態時會形成二聚體或多聚體，或者激發態分子1M*與基態分子M形成激發態二聚體1(M*M)。這些聚合物與熒光單體一般都會具有不同的熒光特性，有的使熒光強度降低甚至不發射熒光，有的使光譜發生變化。此外，還有電荷轉移猝滅，光化學反應猝滅等，不一一敘述。十三、熒光分析儀熒光分析儀器與紫外-可見分光光度計的基本組成部件相同，即有光源、單色器、樣品池、檢測器和記錄顯示裝置五個部分。熒光儀器的單色器有兩個，

48、分別用于選擇激發波長和熒光發射波長。除了基本些部件的性能不同外，熒光儀器與紫外-可見分光光度計的最大不同是，熒光的測量通常在與激發光垂直的方向上進行，以消除透射光和雜散光對熒光測量的影響。其結構示意圖如圖14.9所示。熒光分析儀的各主要部件簡要分述如下：1. 激發光源激發光源應具有足夠的強度、適用波長范圍寬、穩定等特點。常用的光源有高壓汞燈和氙弧燈。 高壓汞燈高壓汞燈是以汞蒸氣放電發光的光源，主要有365、405、436nm 的三條譜線，尤以365nm譜線最強，一般濾光片式的熒光計多采用它為激發光源。 氙弧燈氙弧燈通常就叫氙燈，是目前熒光分光分度計中應用最廣泛的一種光源。它是一種短弧氣體放電燈

49、，外套為石英，內充氙氣，室溫時其壓力為506625Pa，工作時壓力為2026500Pa，具有光強度大，在200800nm 范圍內是連續光源的特點。氙燈的燈內氣壓高，啟動時的電壓高（2040KV），因此使用時一定要注意安全。此外，高功率的可調諧染料激光器是一種新型的熒光激發光源。這種光源不需單色器和濾光片，具有單色性好，強度大，脈沖激光時間短而減少光敏物質的分解等優點。但是儀器設備較復雜，所以應用還不廣泛。2. 單色器熒光分析儀中應用最多的單色器為光柵單色器，稱為熒光分光光度計。光柵有兩塊，第一塊為激發單色器，用于選擇激發光的波長，第二塊為發射單色器，用于選擇熒光發射波長，一般是后者的光柵閃耀波

50、長比前者來得長一些。在比較低檔次的熒光計中，采用濾光片作為單色器，多使用干涉濾光片以獲得純度較好的“單色光”。第一濾光片用以分離出所需用的激發光，第二濾光片用以濾去雜散光、瑞利光、拉曼光和雜質所發射的熒光。3. 樣品池熒光分析的樣品池通常用石英材料做成，它與吸光分析法的液池不同在于，熒光樣品池的四面均為磨光透明面，同時一般僅有一種厚度為1cm的液池。4. 檢測器簡易型的熒光計可用目視檢測，或用硒光電池，光電管檢測。現在的熒光計多采用光電倍增管進行檢測。檢測器的方向應與激發光的方向成直角，以消除樣品池中透射光和雜散光的干擾。 在現代的高級儀器中，光導攝象管用來作為光學多道分析器（簡稱OMA）的檢

51、測器。它具有檢測效率高、動態范圍寬、線性響應好、堅固耐用和壽命長等優點。它的檢測靈敏度雖不如光電倍增管，但卻能同時接受熒光體的整個發射光譜。5. 記錄，顯示裝置熒光儀的讀出裝置有數字電壓表或記錄儀。現代儀器都配上計算機，進行自動控制和顯示熒光光譜及各種參數。十四、熒光儀器的校正及靈敏度1. 儀器的校正人們總希望儀器能記錄熒光物質真實的熒光激發光譜和發射光譜，這種理想化的儀器應該是激發光源、單色器及檢測器等各部分在所需要的整個波段中，性能都一樣，如圖14.10所示。但是這種理想化的光學部件實際上并不存在，因此，對于一些較特殊的測定（如熒光量子產率的測定計算，動力學的某些研究等），需對實際測定的“

52、表觀光譜”進行校正，以獲得真實的光譜。圖14.10     理想化儀器的光譜特性對熒光激發光譜和發射光譜的校正比較復雜，如有需要可參考有關專著。在現代儀器上，不少已在熒光分光光度計上裝配有光譜校正裝置。此外，雜質光對熒光測量也有明顯的影響，必須注意加以清除，在不少儀器中也還有雜質光的校正裝置。2. 熒光儀器的靈敏度熒光分析法的靈敏度包含有兩個部分：一是熒光體的本身因素，即熒光體的吸光系數及熒光量子產率；二是熒光儀器因素，它受到光源強度、穩定性、單色器的雜散光水平、光電倍增管的特性、高壓電源穩定性及放大器的特性諸因素的影響。與紫外可見分光光度法比較，熒光分

53、析法的靈敏度要高出24個數量級，這主要取決于儀器的因素。其一，熒光強度正比于入射光的強度，所以增大光源的強度可以提高靈敏度，降低檢測限；其二，熒光的測量是在激發光的垂直方向檢測的，即在暗背景中檢測，所以只要較好地消除雜散光，采用較靈敏的檢測器，很微弱的熒光都可以檢測，所以檢測限較低。而吸光分析法是在亮背景下檢測透射光與入射光強度的比值，所以當強度較小時，透射光與入射光強度相差很小，因此不能準確的檢測，所以檢測限較高。用檢測限來表示熒光法的靈敏度，在實際工作中是比較直觀和方便的。熒光分析法的檢測限可以有兩種表示方法：一是以喹寧表示，在0.05mol·L1硫酸中，喹寧的熒光峰為450nm

54、，當喹寧溶液很稀（如0.05g·L1）時，溶劑的拉曼峰所造成的對喹寧熒光信號的噪聲已相當顯著。因此人們常以此時喹寧信號與儀器噪聲之比的喹寧濃度定為該儀器的檢測靈敏度。多數儀器的檢測靈敏度為0.05g·L1喹寧，有些靈敏度高的儀器可達0.005g·L1喹寧；二是以水的拉曼光信噪比表示，當水分子被激發時，水分子蒙受暫時的畸變，在極短的時間內（10121015s），會向各個方向發射出與激發光波長相等的瑞利光和波長略長的拉曼光。通過測量拉曼光的信噪比可以衡量儀器的檢測靈敏度。由于純的水易得，用同一波長的光激發水分子所產生的拉曼光波長一樣，便于檢測，所以用拉曼光信噪比表示儀

55、器的靈敏度已為較多的產家所采用。十五、磷光分析儀與熒光分析儀的差別磷光分析儀器與熒光分析儀器同樣由五個基本部件組成，但需要有一些特殊的配件，在比較好的熒光分析儀器上都配有磷光分析的配件，因此兩種方法可以用同一儀器。磷光分析儀器與熒光分析儀器的主要區別有兩點。1. 樣品池需配有冷卻裝置對于溶液磷光的測定，常采用低溫磷光分析法，即試樣溶液需要低溫冷凍。通常把試液裝入內徑約1-3mm的石英細管（液池）中，然后將液池插入盛有液氮的石英杜瓦瓶內，如圖14.11所示。圖14.11     低溫磷光分析的樣品池系統 激發光通過杜瓦瓶的沒有鍍銀的部位照射到試樣上，所產生

56、的磷光經由直角方向上的類似部位投射到發射單色器后加以檢測。2. 磷光鏡有些物質會同時發射熒光和磷光，因此在測定磷光時，必須把熒光分離去。為此目的，可利用磷光壽命比熒光長的特點，在激發單色器和液池之間及在發射單色器和液池之間各裝上一個斬波片，并且由一個同步馬達帶動。這種裝置稱為磷光鏡，它有轉筒式（以圖14.12a）和轉盤式（如圖14.12b）兩種類型，尤以后者更為通用。圖14.12     轉筒式磷光鏡(a)和轉盤式磷光鏡(b)這兩種類型的工作原理是一樣的，現以轉筒式磷光鏡說明之。轉筒式磷光鏡是一個空心圓筒，在其周圍的面上有兩個以上的等向距的狹縫，當馬達帶

57、動圓筒旋轉時，來自激發單色器的入射光斷續交替地射到樣品池，由試樣發射的光也是斷續交替（但與入射光異相）地到達發射單色器的入口狹縫。而在磷光鏡從遮斷激發光轉到磷光鏡的出光狹縫對準發射單色器的入口狹縫的瞬間，由于散射光及熒光隨著激發光被遮斷而消失，檢測器上便只檢測得磷光的信號。此外，通過調節圓筒的轉速，可以測出不同壽命的磷光。十六、熒光分析法的特點1. 靈敏度高前面已述，熒光分析法的靈敏度比吸光分析法高24個數量級，檢測下限在0.10.001g·mL1之間。主要原因有二：一是熒光信號是在暗背景下檢測的，噪聲小，較微弱的信號也能被檢測，且可以高倍放大；二是熒光強度和激發光強度成正比關系，可

58、以提高激發光的光強以增大熒光強度。2. 選擇性好 熒光分析法的光譜比較簡單，特征性強，而且有激發光譜和發射光譜，選擇的余地大。如果某幾種物質的激發光譜相似，就可以從它們發射光譜的差異進行鑒別和分析；相反如果發射光譜相似，可以從它們激發光譜的差異進行鑒別和分析，尤其是有機化合物的分析更是如此。對于金屬離子的分析來說，往往選擇性不太高，這是由于金屬離子的分析往往是通過產生具有熒光特性的配合物或熒光猝滅進行測定。而且熒光特性又往往取決于配位體，不同金屬離子經常與同一配位體形成相似的配合物，具有相似的熒光特性，故會互相干擾。3. 熒光法提供比較多的物理參數可提供包括激發光譜、發射光譜和三維光譜以及熒光強度、熒光效率、熒光壽命等多種物理參數。這些參數反映了分子的各種特性，能從不同角度提供研究對象的分子的信息。熒光分析法的缺點是應用還不夠廣泛，這是因為本身能發射熒光的物質相對較少，用加入某種試劑使非熒光物質轉化為熒光物質來進行分析，其數量也還不多。