1、本 科 畢 業 論 文 （設 計）脫細胞支架的胎兒細胞注射From fetal cells were injected作 者專 業指導教師 講師分 院XX學院二一年五月誠信聲明本人鄭重聲明：本人所呈交的畢業論文，是在導師 指導下獨立研究取得的成果。畢業論文中凡引用他人已經發表的成果、數據、觀點等，均已明確注明出處。除文中已注明引用的內容外，不包含任何其他個人或集體已發表的論文。若有抄襲，愿承擔一切后果。特此聲明完成人簽名： 年 月 日脫細胞支架的胎兒細胞注射 摘要：建立體外心肌細胞分離培養、純化和鑒定方法。方法若干只小鼠分10次采用分離消化法培養心肌細胞,分別用A、B、C、D 4組不同培養液培

2、養,以Ficoll梯度液純化,進行Desmin免疫組化鑒定。結果心肌細胞培養后經臺盼藍檢查成活率達95%以上,在接種后45 d增殖達高峰,A、B、C 3組培養液對心肌細胞的培養效果無差異。Ficoll分離純化的心肌細胞純度較高,有97%的心肌細胞Desmin胞漿呈陽性反應。結果采用Ficoll純化以國產血清培養,可獲得高產量高純度的心肌細胞。關鍵詞：脫細胞；支架；胎兒細胞From fetal cells were injectedAbstract: To establish a practical met hods of t he culture,purification and identi

3、fication of mouse myoblast s in vit ro.Met hods：Muscle samples of 40 mice were minced and digested wit h t rypsin,cul2t ured wit h four kinds of media namely A,B,C,and D,finally purified wit h Ficoll gradient liquid.Myogenesis were dynamically observed,myoblast were tested by Desmin immunohistochemi

4、st ry stains.Result：The my 2 oblast cell viability is up to 95%by Trypan blue,t he cell proliferation arrived climax during 45 day after planted.There is no difference between A,B,and C cult ure liquid.The cell purity is up to 97%by Desmin im 2 munohistochemical stains test.Conclusion：Myoblast s cou

5、ld be purified by Ficoll and cult ured wit h DM EM cul2 t ure liquid contained serum made in our count ry,in high quantity.Key words:Take off， Stents， Fetal cells1 引言目前全世界有2200萬人感染了心臟衰竭。在同種異體移植中，已有腎、肝、心、肺、小腸、骨關節等移植成功的報道。但同種異體組織、器官仍有供者嚴重不足的困難。因此，尋找異種移植源成為現代移植外科研究的前沿。異種移植與同種異體移植一樣，克服排斥反應將是今后研究的重點，但實質器

6、官如心、肝、腎的異種移植一旦失敗，則意味著患者喪失生命。心臟移植仍然是最終確定的治療心臟衰竭階段，但捐贈器官的供應是有限的。一旦心臟移植后，往往需要以交換高血壓，糖尿病和腎衰竭為代價。目前能夠有較完善的方法制取脫細胞的支架，而且現在已有報道美國研究者在實驗室里誘導死亡老鼠心臟再次跳動，這個發現可能會在將來某一天為人類定制組織器官。首先是制作一個脫細胞的可以灌注的血管結構，沖洗存在死亡老鼠心臟的細胞同時使膠原蛋白基本結構保持不變。用新生老鼠的心臟細胞注射給這個像透明膠質，給予脫細胞支架豐富的營養并流他們在實驗室里生長，四天后心臟開始收縮。如今發現的這個新方法，從理論上講，豬心或人捐贈的心臟不再作

7、移植可行的一天，可以去除其細胞，并通過上述過程，幫助需要新的心臟瓣膜或新的心臟的人們。2 簡單脫細胞支架的制備選取經液氮保存3個月的同種生物帶瓣管道"包括同種帶瓣主動脈管道和帶瓣肺動脈管道作為實驗材料!同種帶瓣管道的制備和保存按我們常規方法制備。主要試劑：十二烷基硫酸鈉；Tris緩沖液；D-Hank's；PBS液；乙二胺四乙酸；抑肽酶；青霉素液；鏈霉素液；制霉菌素；復合染色液；亮綠染色液。主要儀器：生物凈化工作臺；程控降溫儀；孵育箱；掃描電子顯微鏡；普通光學顯微鏡。脫細胞的同種帶瓣管道支架的制備：1、 液氮保存的同種帶瓣管道復蘇。將其消毒后去除外層塑料袋，檢查無破裂后，在40

8、無菌生理盆水中快速解凍。在室溫盆水中清洗10 min，用于實驗研究。2、 將復蘇的同種帶瓣管道用D-Hank's液充分漂洗。該混合液中含有:抑膚酶(10KIU/ml) ；青霉素(100 U/ml) ；鏈霉素(100ug/ml)；制霉菌素(100 U/ml)；HEPES液(10 mmol/L，pH 7.6)。3、 漂洗后的同種帶瓣管道貯存于新鮮配制的PBS液中。PBS液中含有:EDTA (0.1 %， W/V)；抑肽酶(10KIU/ml)；青霉素(100 U/ml)；鏈霉素(100ug/ml )；制霉菌素(100 U/ml )。4、 用低滲Tris緩沖液溶解瓣膜細胞，室溫下孵育18-24

9、 h。低滲Tris緩沖液的組成:Tris緩沖液(10mmol/L)；EDTA (0.1%，W/U）；抑膚酶(10 KIU/ml)；青霉素(100 U/ml) ；鏈霉素(100ug/ml)；制霉菌素(100 U/ml)。5、 采用細胞洗滌劑來脫細胞，即將SDS加入低滲Tris、緩沖液中，室溫下孵育24 h 。 SDS的濃度為:質量濃度為0.03 % SDS (W/V)用于脫瓣膜的細胞；質量濃度為0.1 % ，SDS (W/V)用于脫主動脈壁的細胞。6、 用等滲Tris緩沖液充分沖洗。等滲Tris緩沖液的組成：Tris緩沖液(50 mmol/L， pH 8.0)，NaCI( 0.15 mol/L)

10、，EDTA (0.1%，W/U)，抑膚酶(10 KIU/ml)；青霉素(100 U/ml)，鏈霉素(100 ug/ml)，制霉菌素(100 U/ml )。7、 用固定劑進行固定后，分別進行光鏡、掃描電鏡觀察、攝片。 形態學觀察及半定量判斷如下： HE染色:用體積分數為10 %(V/V)中性福爾馬林液作固定，脫水，石蠟包埋，用于觀察大體結構。 改良Van Gieson染色：用于確定彈性纖維(e-lactic fiber ， EF) ， EF被染成深藍色。Masson's trichrome染色法：用來確定膠原纖維(collagen fiber， CF) ， CF被染成綠色。掃描電鏡(SE

11、M)觀察:標本用質量濃度為5%戊二醛固定3一12 h，然后用質量濃度為30 % ，50 % ，70 % ，90%及100%的乙醇逐級脫水，再用醋酸異戊醋固定置換，C02臨界干燥點干燥，種植片表面噴金后，即可于SEM下觀察。結論：用質量濃度為0.03%和0.1 % SDS分別處理同種瓣膜和主動脈壁，光鏡和SEM下觀察兩者的內皮細胞基本被脫去，而中心部位的成纖維細胞有一部分被保留了下來。瓣葉基質中的三種主要成分(膠原纖維、彈力纖維和糖胺聚糖)被完整地保留了下來，瓣膜的形態學結構在脫細胞前后均無明顯改變，其半定量為1級(好)。3 心肌細胞分離培養隨著“人類基因組計劃”完成，功能基因組時代的到來，探索

12、基因的功能則顯得格外重要與緊迫。細胞轉染與轉基因小鼠則是探索基因功能的兩種重要技術。為了探索心肌中功能相關基因的作用，需要獲得高質量與高產量的小鼠心肌細胞。本實驗室為觀測模擬失重小鼠心肌細胞功能的變化，必須建立完善的小鼠心肌細胞分離技術，為后續的實驗打下良好的基礎。以往普遍采用恒壓灌流的Langendorff裝置分離成年大鼠心肌細胞，其分離的產量與質量不穩定，主要原因是對消化終點的判斷不準確；小鼠心臟較小，且個體差異性較大，消化程度更難以掌握。近年來較多研究采用恒流灌流方法分離成年小鼠心肌細胞，可依賴灌流壓力決定消化終點，但細節不甚清楚。因此，本實驗采用恒流灌流的Langendorff裝置分離

13、成年小鼠心肌細胞，以期達到下列目的:(1)確定灌流的初始壓力及其影響因素；(2)掌握灌流壓力變化規律，確定酶消化的客觀終止點；(3)在原有的恒壓灌流大鼠心臟分離心肌細胞的基礎上，改進能獲得高產量與高質量成年小鼠心肌細胞的分離方法。每個心臟分離細胞的總量為3.0×1066.0×106個細胞(n=6)。體視學計數表明，分離即刻，存活心肌細胞為(75.33±10.93)%；復鈣后降至(50.17±4.96)%，與分離即刻具有非常顯著性差別(P<0.01)；靜置4 h后，存活心肌細胞為(40.67±5.79)%，與復鈣后即刻的觀測均值間無顯著性差

14、別(P>0.05)；5.0Hz刺激5 min后，存活心肌細胞進一步降低至(33.83±4.67)%，與復鈣后即刻及靜置4 h的觀測均值間均具有顯著性差別。為了提高分離心肌細胞的收獲量，文獻中報道了多個影響收獲量的因素，包括水的質量，消化酶的種類與純度，灌流液的種類與pH值，灌流液的溫度，以及灌流方式等。本研究表明：灌流方式與消化酶的活性是兩個關鍵環節。常用的恒壓灌流方式，由于對灌流流速的監測較困難，很難判斷消化的終止點，一般是觀測心臟在灌流過程中顏色的變化，然后憑經驗終止消化，因而細胞的收獲量不穩定，質量亦難以保證。國外著名實驗室一般采用恒流灌流，陳吉球報道小鼠酶消化終止壓力為

15、28 mmHg2。本研究觀測進一步證實這是一個可靠的終止酶消化的指標。高于此壓力終止消化則導致消化不足，低于此壓力則導致消化過度。因此，采用恒流灌流分離成年小鼠心肌細胞，可方便地監測灌流壓力的變化，在確保初始灌流壓力與心臟在體舒張壓相近的前提下，經過短期的摸索，即可收獲較高產量的心肌細胞。4 器官培養心肌細胞的培養方法類似于一般細胞。培養液多選用DMEM、Medium 199、William液,并加入10%20%的胎牛血清或小牛血清。關于血清的用途及機制目前尚不十分清楚,可能為提供粘附底物和一些必需的營養物質如生長因子、激素等。培養液的pH值為7.357.45,細胞生長過程中養分的消耗和代謝產

16、物的聚積可導致培養液pH值稍有降低,可利用培養箱中CO2含量(5%)來緩沖培養液的pH值。人們發現對脫細胞支架進行適當處理可增快貼壁速度。為提高培養成活率,可加入明膠、型膠原和型膠原、Laminin、胎牛血清(FCS),及在制作培養瓶時對玻璃或塑料作特殊處理等不同方法。由于心肌細胞較一般細胞如內皮細胞體積大、密度高,故培養1 h左右存活的心肌細胞即可貼壁生長,而破壞嚴重的心肌細胞難于貼壁而懸浮于培養液中并逐漸腫脹、破裂而死。培養24 h后即可分離出存活的心肌細胞。由于心肌組織中含有18種細胞,故培養前的細胞純化很重要,應盡力去除非心肌細胞,尤其是成纖維細胞、白細胞,以免污染心肌細胞,影響其作為

17、一種實驗工具。成年心肌細胞的傳代培養至今未能建立起穩定的方法，而幼年細胞的傳代培養較易。5 培養結果分析原代培養后細胞第12天可見單核的紡錘形、長梭形緩慢生長。第34天心肌細胞生長迅速,呈單核雙極性大量展開,表現出很強的分裂增殖能力（見下圖)。第56天大量增殖的心肌細胞變得細長,呈平行排列走向,相互融合形成中央核的多核性長管狀初生肌管（見下圖)。第78天肌管數量增多,體積增大,核數明顯增多,并見長管狀的心肌細胞互相連接,并出現“節律性收縮”現象。各次形心肌管的時間長短不一,平均67 d,初生肌管與長梭形心肌細胞常平行排列,間隔分布,有時可觀察到心肌細胞胞漿緊貼肌管表面,或肌細胞一端插入肌管胞漿

18、內,顯示肌細胞融合形心肌管不斷發育成熟的形態特征。圖1：心肌細胞培養 培養的細胞經4 g/L臺盼藍染色計數,約有95%以上的細胞不著色,說明二步消化法分離培養的細胞成活率較高。分別用A、B兩組培養液培養純化后的細胞連續計數繪制生長曲線顯示,心肌細胞在培養第46天增殖達高峰,兩組在各時間段均無差異(P>0.05)。 圖2：用不同血清培養純化的心肌細胞的生長曲線 參 考 文 獻1 Harald C Ott， Thomas S Matthiesen， Saik-Kia Goh， Lauren D Black， Stefan M Kren， Theoden I Netoff3 &Dori

19、s A Taylor. Perfusion-decellularized matrix: using natures platform to engineer a bioartificial heart.nature medicine 20082 楊勝利 何作云 張華 馮兵.大鼠心肌細胞培養方法的改進J.中國比較醫學雜志，2003，13(3):128.3董豐 龔開政 張振剛 王波 呂申.原代心肌細胞培養方法的探討J.大連醫科大學學報，2001，23(4):307308.4 劉雨瀟 華進聯 張慧茹 竇忠英.小鼠心肌細胞的體外培養J.西北農林科技大學學報，2005，33(1):5-8.5王鐵征 徐方杰 鄭悅. 組織工程心臟瓣膜的研究進展J . 上