1、IL-10在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者PBMC B細(xì)胞刺激因子表達(dá)中的作用 作者：葉玉津， 梁柳琴， 許韓師， 楊岫巖， 詹鐘平， 連 帆， 尹培達(dá) 【摘要】 【目的】 探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)B細(xì)胞刺激因子(Blys)基因和蛋白在體外的表達(dá)及IL-10對(duì)其表達(dá)的影響。【方法】 梯度密度離心法分離25例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和20名女性健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞，分為2組, IL-10(100 ng/mL)組和培養(yǎng)基組(僅含RPMI1640培養(yǎng)基)，分別于培養(yǎng)0、6、12、24、72 h離心收集PBMCs，RT-PCR法檢測(cè)刺激后024 h細(xì)胞Blys mRNA表達(dá)，

2、流式細(xì)胞儀和直接免疫熒光法檢測(cè)72 h膜結(jié)合型Blys蛋白表達(dá)。【結(jié)果】 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Blys mRNA和蛋白表達(dá)體外高于健康對(duì)照(P<0.001)。IL-10顯著增強(qiáng)健康對(duì)照和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Blys mRNA表達(dá)，12 h作用最強(qiáng)（0.487±0.058 vs 0.251±0.050，P< 0.001；0.638±0.084 vs 0.392±0.059，P< 0.001）。IL-10顯著增強(qiáng)健康對(duì)照和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞膜結(jié)合型Blys蛋白表達(dá)(FACs

3、, 4.53±0.71 vs 3.24±0.57，P< 0.001;5.79±0.91 vs 4.55±0.83，P< 0.001)。 直接免疫熒光法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞膜結(jié)合型Blys蛋白顯示，IL-10刺激后Blys表達(dá)增強(qiáng)。【結(jié)論】 IL-10可上調(diào)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞 Blys基因和蛋白表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】 系統(tǒng)性紅斑狼瘡； B淋巴細(xì)胞刺激因子； IL-10； 外周血單個(gè)核細(xì)胞 Abstract：【Objective】To determine the expression of membrane-bound

4、 B lymphocyte stimulator (Blys) protein and its mRNA in vitro of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from systemic lupus erythematosus (SLE) patients, and to investigate the role of interleukin-10 (IL-10) on the expression of Blys. 【Methods】PBMCs were obtained from 25 SLE patients and 20 heal

5、thy volunteers. They were randomized into IL-10 (100 ng/mL) group and media group. PBMCs were collected at 0, 6, 12, and 24 h for Blys mRNA assessment using semi-quantitative reverse transcription-PCR (RT-PCR). PBMCs were also collected at 72 h for membrane-bound Blys protein detection using flow cy

6、tometry and direct immunofluorescence. 【Results】 The expression of Blys mRNA and membrane-bound protein in PBMCs was significantly higher in SLE patients than healthy controls in vitro(P< 0.001). IL-10 enhanced Blys mRNA expression in PBMCs in both healthy controls and SLE patients, with the

7、greatest effect at 12 h (0.487±0.058 vs 0.251±0.050，P< 0.001；0.638±0.084 vs 0.392±0.059，P< 0.001).IL-10 also increased the expression of membrane-bound Blys protein in both healthy controls and SLE patients (FACs, mean fluorescence intensity, 4.53±0.71 vs 3.24&

8、#177;0.57，P< 0.001; 5.79±0.91 vs 4.55±0.83，P< 0.001).Direct immunofluorescence by con-focus micrography also indicated that IL-10 increase the expression of membrane-bound Blys protein. 【Conclusion】 In vitro, the expression of Blys mRNA and membrane-bound protein was elevated

9、 in SLE patients, and IL-10 had positive effects on its expression. Key words：systemic lupus erythematosus； B lymphocyte stimulator； IL-10； peripheral blood mononuclear cells是近年發(fā)現(xiàn)的一種與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子，屬TNF配體超家族新成員，對(duì)B細(xì)胞具有強(qiáng)的促增殖、分化和分泌抗體作用。研究顯示，Blys轉(zhuǎn)基因鼠可出現(xiàn)狼瘡樣癥狀4； 狼瘡鼠模型(MRL/MP-Lpr/Lpr和NZB/WF1)中5，隨時(shí)間延長(zhǎng)及疾病進(jìn)展，Blys水

10、平進(jìn)行性升高，且與狼瘡鼠腎損害有關(guān)，用可溶性Blys受體治療可顯著延長(zhǎng)狼瘡鼠存活期。除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者也表現(xiàn)出血漿可溶性Blys明顯升高6,7。Blys表達(dá)增強(qiáng)可能引起狼瘡患者體內(nèi)B細(xì)胞過(guò)度增殖，產(chǎn)生大量自身抗體，形成免疫復(fù)合物并沉積，從而導(dǎo)致組織器官損害4，所以Blys在紅斑狼瘡疾病發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。目前關(guān)于Blys作用信號(hào)途徑的研究顯示，Blys主要通過(guò)與受體BR3相結(jié)合8，誘導(dǎo)與NF-kappaB(NF-B)有關(guān)的抗凋亡活性，導(dǎo)致Bcl-2家族蛋白間的比例改變，主要是下調(diào)凋亡前蛋白Bax而上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL，從而減少B細(xì)胞的凋亡，影響其生長(zhǎng)發(fā)育9,

11、10。但調(diào)節(jié)系統(tǒng)性紅斑狼瘡 Blys表達(dá)上游因素的研究罕見(jiàn)。本文在體外檢測(cè)狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Blys基因和蛋白表達(dá)，探討IL-10對(duì)Blys表達(dá)的調(diào)控作用。 1 材料與方法 1.1 研究對(duì)象 25例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，為來(lái)自2003年10月至2004年7月廣州中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院和門(mén)診病人，均符合1982年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，男2例，女23例，年齡(31±14)歲；20名健康志愿者，均為女性，年齡(28±10)歲。兩組年齡、性別無(wú)顯著性差異。 1.2 細(xì)胞處理及分組 抽取系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和健康人靜脈血10 mL注入含50 L肝素的無(wú)菌離心管，梯度密度離

12、心法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞（perpheral blood mononuclear,PBMCs)，用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL待用。 在24孔培養(yǎng)板中加入PBMCs , 每孔1 mL，每份標(biāo)本分2組，每組5孔，37 、5% CO2培養(yǎng)4 h后，第1組加入IL-10(100 ng/mL，Sigma公司)，第2組為對(duì)照組(僅含RPML1640培養(yǎng)基)。分別于培養(yǎng)0、6、12、24 h離心收集第1至第4孔PBMCs用于Blys mRNA的檢測(cè)。于72 h離心收集第5孔PBMCs用于膜結(jié)合型Blys蛋白檢測(cè)。每孔細(xì)胞均進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢

13、測(cè)細(xì)胞活力(活細(xì)胞達(dá)90%)。 1.3 PBMCs Blys mRNA表達(dá) 按照Trizol試劑盒說(shuō)明分別提取培養(yǎng)0、6、12、24 h后PBMCs總RNA。半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：根據(jù)RT試劑盒(MBI公司)說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為PCR模板。RT-PCR引物序列 (Blys正鏈 5-ACA GAA AGG GAG CAG TCA CG-3，負(fù)鏈 5-AAC GGC ACG CTT ATT TCT GCT-3(393 bp)；內(nèi)參照-actin正鏈5-GGA TTC CTA TGT GGG CGA CG-3，負(fù)鏈5-GGA ACC GCT CAT TGC CAA TG

14、-3(617 bp)（上海生物工程公司）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 L)：去離子水15.25 L，10×緩沖液2.5 L，25 mmol/L MgCl2 2.5 L，10 mmol/L dNTP 0.5 L，Blys正負(fù)鏈引物混和液2.5 L，Tag DNA聚合酶0.25 L，DNA模板1.5 L。95 預(yù)變性4 min，94 30 s，52 30 s，72 45 s ，32個(gè)循環(huán)，72 延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)作條帶密度掃描，結(jié)果以Blys與-actin的比值(ABlys/-actin值)表示。 1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PBMCs膜結(jié)合型

15、Blys蛋白表達(dá) 收集培養(yǎng)72 h PBMCs，0.5 g/100 mL多聚甲醛固定10 min，加破膜劑，室溫15 min，加PE標(biāo)記的抗人Blys單抗(R&D公司) 100 L，室溫20 min，PBS洗滌2次后上機(jī)檢測(cè)。 1.5 直接免疫熒光法檢測(cè)Blys蛋白表達(dá) 取1滴PBMCs懸液(1×106/mL)滴于載波片上，均勻涂開(kāi)，風(fēng)干后置于冰丙酮中固定。10 g/100 mL牛血清白蛋白 15 L阻斷30 min。加抗人Blys單抗15 L，避光37 孵育2 h于鏡下檢測(cè)。 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±)表示，采用SPSS13.

16、0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;SLE和對(duì)照組間及不同時(shí)間點(diǎn)間的差異采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析比較。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析比較。 2 結(jié) 果 2.1 培養(yǎng)基組PBMCs Blys mRNA表達(dá) 不加刺激劑的培養(yǎng)基組(只含有培養(yǎng)基)中，PBMCs Blys mRNA在0、6、12和24 h不同時(shí)點(diǎn)的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，狼瘡患者Blys mRNA表達(dá)在不同時(shí)點(diǎn)高于健康對(duì)照（表1，圖1）。 2.2 IL-10刺激組PBMCs Blys mRNA的表達(dá) 不同時(shí)間點(diǎn)間PBMCs Blys mRNA表達(dá)的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-10刺激后，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和健康對(duì)照PBMCs B

17、lys mRNA表達(dá)6 h開(kāi)始升高(6 h vs 0 h，P<0.001)，12 h達(dá)到高峰(12 h vs 0 h, P< 0.001；12 h vs 6 h, P< 0.001；12 h vs 24 h, P< 0.001)，24 h恢復(fù)刺激前水平(24 h vs 0 h，P >0.05)。狼瘡患者Blys mRNA表達(dá)在不同時(shí)點(diǎn)均高于健康對(duì)照（表2，圖1）。 2.3 PBMCs 膜結(jié)合型Blys蛋白的表達(dá)及IL-10對(duì)其表達(dá)的影響 根據(jù)析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者PBMCs膜結(jié)合型

18、Blys蛋白表達(dá)強(qiáng)于健康對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60.54, P< 0.001)；IL-10可增強(qiáng)PBMC膜結(jié)合型Blys蛋白表達(dá)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和健康對(duì)照組間和刺激物(IL-10)之間不存在交互作用。 直接免疫熒光法激光共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)PBMCs Blys蛋白表達(dá)，較直觀(guān)的反應(yīng)了Blys蛋白在細(xì)胞中的分布，Blys主要分布PBMCs的細(xì)胞膜上。同樣的，狼瘡患者Blys蛋白的表達(dá)強(qiáng)于健康對(duì)照組，而IL-10增強(qiáng)其表達(dá)（圖2）。 3 討 論 Blys由骨髓來(lái)源的細(xì)胞分泌，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等，在外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中主

19、要為單核細(xì)胞和活化的T細(xì)胞1。它是型跨膜蛋白，在體內(nèi)以膜結(jié)合型和可溶型兩種形式存在。系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一個(gè)以抗自身抗原的自身抗體產(chǎn)生為特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，但導(dǎo)致B細(xì)胞耐受性缺乏和啟動(dòng)自身抗體產(chǎn)生的原因尚不十分清楚，而內(nèi)源性Blys可能是參與紅斑狼瘡B細(xì)胞過(guò)度活化的重要因素4-7。 本研究前期工作已發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)PBMCs存在Blys mRNA和膜結(jié)合型蛋白表達(dá)增強(qiáng)11。本實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)，與正常對(duì)照相比狼瘡患者PBMCs中Blys存在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的異常。本實(shí)驗(yàn)采用激光共聚焦顯微鏡直接免疫熒光方法檢測(cè)Blys蛋白表達(dá)，顯示Blys主要在單個(gè)核細(xì)胞胞膜上表達(dá)，較直觀(guān)的體現(xiàn)了Blys

20、的定位和分布情況。 目前關(guān)于Blys的研究主要集中在動(dòng)物和B細(xì)胞腫瘤上，且對(duì)Blys作用下游信號(hào)的研究較為透徹，但對(duì)調(diào)節(jié)Blys表達(dá)上游因素的研究罕見(jiàn)，僅有Nardelli12等發(fā)現(xiàn)IL-10可增強(qiáng)正常單核細(xì)胞和單核細(xì)胞來(lái)源的腫瘤細(xì)胞Blys表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了IL-10對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者PBMC Blys基因和蛋白表達(dá)的影響，顯示IL-10在體外可增強(qiáng)狼瘡患者PBMCs Blys mRNA和蛋白表達(dá)。 過(guò)去認(rèn)為抑制性T細(xì)胞(Ts)功能或數(shù)量上的缺陷是導(dǎo)致狼瘡B細(xì)胞過(guò)度活化的原因，而目前則認(rèn)為T(mén)輔助細(xì)胞(Th)的病態(tài)活化是促使B細(xì)胞多克隆激活的主要原因。Th細(xì)胞主要分為T(mén)h1和Th2細(xì)胞，Th

21、1細(xì)胞分泌IL-2和IFN-等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和單核細(xì)胞活化，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)；Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-6、IL-10，參與介導(dǎo)體液免疫；Th1/Th2比例失衡可導(dǎo)致一系列免疫病理?yè)p害。系統(tǒng)性紅斑狼瘡則存在Th1/Th2比例失衡，其中以Th2細(xì)胞過(guò)度活化為主。在Th2細(xì)胞因子中， IL-10與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病關(guān)系非常密切，是目前狼瘡中研究得較為深入明確的細(xì)胞因子。IL-10是一種多功能的細(xì)胞因子，能直接刺激B細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)抗體產(chǎn)生。研究表明，狼瘡患者PBMC IL-10 mRNA表達(dá)和培養(yǎng)上清IL-10水平均明顯增高，并且與自身抗體產(chǎn)生和狼瘡活動(dòng)性密切相關(guān)13。IL-10

22、還增強(qiáng)生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞表達(dá)抗凋亡蛋白Bcl-2，使B細(xì)胞壽命延長(zhǎng)14。除了直接促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化外，本文的結(jié)果提示IL-10還可能通過(guò)促進(jìn)Blys的表達(dá)而間接影響B(tài)細(xì)胞的增殖、存活和分泌功能。 對(duì)影響系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者 Blys分泌上游因素的研究有助于進(jìn)一步深入探討狼瘡發(fā)病機(jī)制以及尋找治療狼瘡的新靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的Blys基因和膜結(jié)合型蛋白的表達(dá)均增強(qiáng)，IL-10可促進(jìn)Blys基因和蛋白的表達(dá)，因此，阻斷IL-10的作用，有助于治療體液免疫介導(dǎo)的系統(tǒng)性自身免疫病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡。已有人嘗試應(yīng)用小鼠抗IL-10單抗治療數(shù)例狼瘡患者，延緩了病情進(jìn)展并延

23、長(zhǎng)其生存時(shí)間15。本實(shí)驗(yàn)為抗IL-10抗體應(yīng)用于人類(lèi)狼瘡患者提供了一定的依據(jù)，當(dāng)然抗IL-10抗體廣泛應(yīng)用于臨床還需要更深入的研究和驗(yàn)證。【參考文獻(xiàn)】 MOORE P A, BELVEDERE O, ORR A, et al. BLyS: member of the tumor necrosis factor family and B lymphocyte stimulator J. Science,1999,285(5425):260-263.CROWLEY J E, TREML L S, STADANLICK J E, et al. Homeostatic niche specificat

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