1、HBV preS1基因酵母表達載體的構建及表達 作者：張曦，藺淑梅，吳列秀，陳天艷，葉峰，趙英仁，張樹林【摘要】 目的 構建HBV preS1基因的酵母表達載體，探討HBV preS1蛋白的功能。方法 以HBV ayw亞型全長質粒PCP10為模板，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增HBV preS1基因，克隆到pGEMT載體中命名為TpreS1，以Nco和Mlu雙酶切TpreS1后回收與酵母表達載體pSos連接，對重組質粒進行序列測定后命名為pSospreS1，經醋酸鋰法將其轉化酵母菌cdc25(a)，提取酵母蛋白質進行Western免疫印跡分析。

2、結果 成功構建了HBV preS1基因的酵母表達載體，Western免疫印跡分析顯示HBV preS1基因在酵母細胞中正確表達。結論 pSospreS1的構建為通過SOS招募系統(sosrecruitment system, SRS)篩選與HBV preS1蛋白相互作用的蛋白和進一步探討HBV preS1蛋白在HBV致病中的作用奠定了基礎。 【關鍵詞】 乙肝病毒 preS1蛋白 酵母表達載體ABSTRACT: Objective To construct the yeast expression vector of HBV preS1 gene for investigating the po

3、tential role of preS1 protein in mediating the attachment of HBV particles to human hepatocytes. Methods PCR was performed to amplify HBV preS1 gene from the plasmid PCP10/HBV ayw subtype containing the whole fragment of HBV, and the PCR product was cloned into pGEMT vector and then named TpreS1. HB

4、V preS1 gene was cut from TpreS1 by Nco and Mlu, and cloned into yeast expression plasmid pSos; the reconstructed plasmid was tested by autosequencing assay and named pSospreS1. pSospreS1 was transformed into yeast cell cdc25(a) by LiAc mediated transformation, and the yeast protein was isolated and

5、 analyzed by Western blot. Results The yeast expression vector of HBV preS1 gene was constructed successfully, and the presence of HBV preSl protein in yeast cells was confirmed by Western blot analysis. Conclusion Reconstruction of pSospreS1 has laid a foundation for better understanding of the mec

6、hanism of HBV preS1 protein in viral endocytosis and is helpful in seeking the preS1 related protein that is supposed to interact with preS1 protein in vitro by sosrecruitment system.KEY WORDS: hepatitis B virus; preS1 protein; yeast expression vector乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是一種嚴重危害人類健康的重要病原體，其

7、感染人體后可引起急、慢性乙型肝炎，并與肝硬化、肝癌密切相關。和其他病毒一樣，HBV也是通過與靶細胞表面的相應受體結合而進入細胞，從而實現對機體的感染。preS1區是HBV與肝細胞膜的直接結合位點。目前認為preS1蛋白與HBV的急性感染1、介導入胞2、病毒復制、轉錄和分泌有關。因此，研究HBV preS1蛋白及其肝細胞受體，對進一步闡明乙型肝炎的發病機制具有重要的意義。為了進一步研究HBV preS1蛋白的功能及其相關作用蛋白在HBV入胞中的作用，我們構建了HBV preS1基因的酵母表達載體。1 材料與方法1.1 材料SOS招募系統(sosrecruitment system, SRS)包括

8、cdc25酵母菌株，誘餌蛋白融合載體pSos，靶蛋白融合載體pMyr，陽性對照質粒pSos MAFB、pMyr MAFB、pMyr SB，陰性對照質粒pSos Col、pMyr Lamin C，預制肝文庫均為Stratagene公司產品；HBV ayw質粒由本室保存；PCR相關試劑及T載體、T4連接酶均購自TaKaRa公司；限制性內切酶Nco、Mlu購自NEB公司；酵母培養及轉化相關試劑購自Clontech公司；Hep B preS1的單克隆抗體為SANTA公司產品。1.2 方法1.2.1 PCR引物設計和合成根據HBV ayw亞型的preS1基因序列設計特異性引物，上游引物P1：CCA TG

9、G CG ATG GGG CAG AAT CTT TCC AC；下游引物P2：ACG CGT TTA GGC CTG AGG ATG AGT GTT TCT C，由上海生工生物工程公司合成。1.2.2 目的基因的擴增以HBV ayw亞型全長質粒PCP10為模板進行PCR擴增。反應體系：質粒1L，10×Buffer 5L，dNTP(10mmol/L)1L，MgCl2(25mmol/L)4L，P1(10moL/L)1L，P2(10moL/L)1L，Taq DNA聚合酶(5u/L)0.6L，加滅菌水至終體積50L。反應條件：94 3min，94 1min，53 1min，72 1min，共

10、30個循環，72 5min。取5L反應產物進行20g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。1.2.3 PCR產物的克隆鑒定PCR產物經北京鼎國膠回收試劑盒回收純化后，與T載體按克分子31的比例，在T4連接酶的催化下，16過夜進行體外連接重組，將連接產物全部轉化大腸桿菌DH5感受態細胞，在鋪有IPTG和XGal的氨芐青霉素LB平板上進行藍白菌落篩選。隨機挑取白色菌落，以堿裂解法小量提取質粒并行PCR及雙酶切鑒定后，由上海生工生物工程公司進行測序，測序正確者命名為TpreS1。1.2.4 誘餌質粒的構建和鑒定用Nco和Mlu雙酶切TpreS1和pSos，回收preS1及pSos載體片段，用T4連接酶進行體外連接

11、重組，轉化大腸桿菌DH5感受態細胞，菌落PCR篩選出陽性克隆后，以堿裂解法小量提取質粒，行限制性內切酶分析，鑒定正確者送上海生工生物工程公司利用酵母表達載體pSos的引物(P1：CCAAGACCAGGTACCATG；P2：GCCAGGGTTTTCCCAGT)測序，測序正確者命名為pSospreS1。1.2.5 制備酵母感受態細胞所用酵母菌株為cdc25(a)，采用醋酸鋰轉化法，按照試劑盒(Stratagene公司)說明書操作。將凍存的cdc25(a)劃線接種于新鮮的YPAD平板，倒置于室溫(2225)孵育46d，挑取45個單克隆于1mL YPAD液體培養基中，劇烈振蕩后接種于含50mL YPA

12、D的250mL三角燒瓶中，室溫(2225)、220250r/min振搖1416h至A600>1.0。在2L的三角燒瓶中用YPAD稀釋過夜菌液后(終體積300mL，A600=0.20.3)，置搖床室溫(2225)、220250r/min振搖3h至A600>0.7。取75L菌液鋪于YPAD平板，封口膜封閉后置37孵育46d。將剩余的菌液室溫(2225)、1000r/min離心5min，棄上清；以50mL ddH2O重懸細胞，再置室溫(2225)、1000r/min離心10min，棄上清；用50mL LiSORB重懸細胞，室溫(2225)孵育30min，室溫(2225)1

13、000r/min離心5min，棄上清；再用300L LiSORB重懸酵母細胞，加入600L預先準備好的鮭精DNA與LiSORB的混合物，小心輕柔完全混勻，加入5.4mL PEG/LiOAc和530L DMSO，小心徹底混勻，在1.5mL的Ep管中分裝500L，其余的每管100L分裝。1.2.6 轉化酵母感受態細胞將質粒pSospreS1和pSos分別加入100L制備好的cdc25(a)酵母感受態細胞。每管加入2L新鮮制備的1.4mol/L 巰基乙醇，小心混勻后置室溫(2225)孵育30min，42熱休克20min，迅速置冰上3min，14000r/min室溫(2225)離心30s，棄上清，以5

14、00L 1mol/L的山梨醇懸浮細胞，將轉化液全部鋪于100mm SD/glucose (L)瓊脂平板上，置室溫(2225)孵育46d至長出單克隆。挑取pSospreS1平板上較大(直徑>2mm)的菌落，應用酵母表達載體pSos的引物進行酵母菌落PCR，快速篩選酵母轉化子，鑒定轉化是否成功。1.2.7 pSospreS1在酵母細胞中的表達挑取pSospreS1和pSos單克隆分別接種于含5mL SD/glucose (L)液體培養基的50mL離心管中，置振蕩器室溫(2225)、大于250r/min培養23d至A600>1.0，1000r/min室溫離心5min，棄去

15、上清液；用1mL冰預冷的ddH2O重懸酵母細胞后，加入150L新鮮制備的NaOH/巰基乙醇，漩渦混勻30s，置冰上15min；再次漩渦混勻后加入150L的TCA水溶液(550g/L)，漩渦混勻后置冰上10min，12000r/min、4離心10min，棄上清后重復離心一次；用30L SU buffer重懸蛋白抽提物，65水浴3min，行80g/L SDSPAGE電泳，轉膜，Western免疫印跡分析按常規方法進行。一抗為1200稀釋的Hep B preS1的單克隆抗體，二抗為1500稀釋的堿性磷酸酶標記的馬抗鼠IgG，BCIP/NBT顯色。2 結 果2.1 PCR擴增HBV preS1基因編碼

16、序列以HBV ayw亞型全長質粒PCP10為模板，在50L反應體系中進行PCR。取擴增產物5L，在20g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定，可見擴增片段約為324bp(圖1)，與預期片段大小一致，且無非特異性擴增現象。2.2 HBV preS1基因的克隆鑒定將回收純化后的PCR產物與T載體連接后獲得的重組質粒命名為TpreS1，首先行PCR鑒定，再用Nco和Mlu對TpreS1進行雙酶切鑒定。鑒定正確的TpreS1重組質粒進行測序，序列分析表明所擴增的preS1基因序列與HBV ayw亞型的preS1基因序列完全一致(GenBank DQ315776)。2.3 構建和鑒定誘餌質粒2.3.1 用Nco

17、和Mlu雙酶切TpreS1和pSos后(圖2)，回收preS1及pSos載體片段，用T4連接酶進行體外連接重組。2.3.2 對體外連接重組后生長的單克隆隨機挑取5個進行菌落PCR鑒定(圖3)。2.3.3 將篩選出的陽性克隆提取質粒，以Nco和Mlu雙酶切，然后在20g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定(圖4)，可見插入片段大小正確。2.3.4 利用酵母表達載體pSos的引物對鑒定正確的pSospreS1重組質粒進行測序，序列分析表明插入片段的基因序列與HBV ayw亞型的preS1基因序列完全一致(GenBank DQ315776)，插入方向正確，融合區域的讀碼框正確，表明誘餌質粒構建成功。2.4

18、提取pSos和pSospreS1質粒的酵母蛋白質，進行SDSPAGE和Western免疫印跡分析 結果顯示對照無表達，而轉化了pSospreS1者Sos蛋白(約116.7ku)和preS1蛋白(約11.9ku)融合表達成功，Western免疫印跡分析可見明顯目的條帶(約128ku)且無雜帶(圖5)。3 討論已知病毒感染機體的第一步是通過病毒吸附蛋白(virus attachment protein, VAP)與相應宿主細胞受體結合而實現的，這一過程常常成為決定病毒侵嗜范圍與發病機制的主要因素。已有研究證實HBV preS1蛋白在HBV附著、侵入肝細胞的過程中發揮著重要作用。近年來，隨著認識的逐

19、漸深入，人們發現其不僅參與HBV的裝配34和分泌5，還可調節HBV引起的細胞及體液免疫，增強新型基因疫苗的免疫效應6，提示preS1蛋白在慢性乙型肝炎的發生、發展過程中起著重要的作用。然而由于研究方法和策略的差異，在HBV preS1蛋白受體的確認上眾說紛紜7。目前已知的在肝細胞膜上能與HBV preS1蛋白結合的分子(可能的HBV受體) 均是蛋白質89，如：IL6、IgA、人源去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)、HBV結合因子(HBVBF)10、p80(protein 80)11、HBV結合蛋白(HBVBP)12等。因此進一步探明HBV preS1蛋白及其受體的結構、具體功能及作用機制對于預防

20、和阻斷HBV感染肝細胞，阻止其進一步作用，以及控制慢性乙型肝炎的蔓延均具有深遠的意義。酵母雙雜交系統作為發現和研究活細胞內蛋白質與蛋白質之間相互作用的技術平臺，在近幾年來得到了廣泛的運用。該系統是在真核模式生物酵母中進行的，不但可用來研究活細胞內蛋白質之間的相互作用， 而且還能用來發現新的作用蛋白質，是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質之間關系的技術?，F在國內外已有很多學者將其應用于HBV preS1蛋白受體的研究，但是由于在傳統的GAL4 雙雜交系統中HBV preS1蛋白存在強烈的自激活作用，尤其是在preS1蛋白與肝細胞相互作用的關鍵部位(2147aa)，使假陽性率過高，限制了研究的進展。近

21、年來新出現的一種酵母雙雜交系統SRS(sosrecruitment system)，它不像GAL4系統那樣需要依賴于轉錄激活，在不宜采用GAL4系統的一些檢測中發揮著重要作用；同時它還可以用來檢測一些不能很好地定位于細胞核的蛋白質之間的相互作用，并且允許被檢測的蛋白質發生轉錄后修飾，因此已被用于多種膜蛋白的研究1314。我們以HBV ayw亞型全長質粒PCP10為模板，PCR擴增HBV preS1基因的全長基因序列，與酵母表達載體pSos進行體外連接重組，成功構建了誘餌質粒pSospreS1。誘餌質粒pSospreS1成功轉化cdc25(a)酵母感受態細胞后，對其酵母蛋白提取物行Western

22、免疫印跡分析，用HBV preS1蛋白的單克隆抗體檢測到約128ku的蛋白條帶，表明HBV preS1基因與hSos基因片段在cdc25酵母細胞融合表達成功。本研究為通過SRS篩選與HBV preS1蛋白相互作用的蛋白分子，進一步研究HBV preS1基因及其表達產物preS1蛋白在HBV入胞中的作用奠定了實驗基礎，也為制備受體模擬分子，通過阻斷病毒入胞從而預防和治療乙型肝炎創造了條件?！緟⒖嘉墨I】 1LE GUILLOU DB, DUCLOSVALLEE JC, EBERLE F, et al. Evaluation of an enzymelinked immunosorbent assa

23、y for detection and quantification of hepatitis B virus preS 1 envelope antigen in serum samples:comparison with two commercial assays for monitoring hepatitis B virus DNA J. Viral Hepat, 2000, 7(5):387392.2ATKINS GJ, QIAO M, COOMBE DR, et al. Hepatitis B virus binding to leucocyte plasma membranes

24、utilizes a different region of the preS1 domain to the hepatocyte receptor binding site and does not require receptors for opsonins J. Immunol Cell Biol, 1997, 75(3):259266.3POISSON F, SEVERAC A, HOURIOUX C, et al. Both preS1 and S domains of hepatitis B virus envelope proteins interact with the cor

25、e particle J. Virology, 1997, 228(1):115120.4YU M, EMERSON SU, COTE P, et al. The GDPAL region of the preS1 envelope protein is important for morphogenesis of woodchuck hepatitis virus J. Hepatology, 1998, 27(5):14081414.5BRUSS V, THOMSSEN R. Mapping a region of the large envelope protein required f

26、or hepatitis B virion maturation J. J Virol, 1994, 68(3):16431650.6RAZ R, DAGAN R, GALLIL A, et al. Safety and immunogenicity of a novel mammalian cellderived recombinant hepatitis B vaccine containing PreS1 and PreS2 antigens in children J. Vaccine, 1996, 14(3):207211.7CHOUTEAU P, LE SEYEC J, CANNI

27、E I, et al. A short N proximal region in the large envelope protein harbors a determinant that contributes to the species specificity of human hepatitis B virus J. J Virol, 2001, 75(23):1156511572.8SCHNEIDERSCHAULIES J. Cellular receptors for viruses:links to tropism and pathogenesis J. J Gen Virol, 2000, 81(Pt 6):14131429.9METTENLEITER TC. Brief overview on cellular virus receptors J. Virus Res, 2002, 82(12):38.10BUDKOWSKA A, MAILLARD P, THE