1、目錄GSH檢測(cè)方法（酶法）1GSH檢測(cè)方法（普通法）3S-腺苷蛋氨酸（SAM）檢測(cè)方法4ATP和ADP檢測(cè)方法6NADH和NAD+檢測(cè)方法8葡萄糖檢測(cè)方法10尿素檢測(cè)方法11無機(jī)硒檢測(cè)12有機(jī)硒檢測(cè)14氧化性有關(guān)酶的酶活（GPx、CAT、SOD、MDA等）檢測(cè)15己糖激酶測(cè)定方法16磷酸果糖激酶測(cè)定方法17丙酮酸激酶測(cè)定方法18-谷氨酰半胱氨酸合成酶測(cè)定方法19普魯蘭產(chǎn)量及其分子量20總糖的測(cè)定-硫酸蒽酮法22蔗糖檢測(cè)方法23NH4+濃度測(cè)定（改良的Berthelot法）24蛋白質(zhì)含量測(cè)定-考馬斯亮藍(lán)方法25胞內(nèi)pH（pHi）的測(cè)定26整理人：王玉磊（1-11） 楊波（12-15） 董穎穎（1

2、6-19） 余小六（20-26）GSH檢測(cè)方法（酶法）原理DTNB是一個(gè)由二硫鍵連接的帶有兩個(gè)苯環(huán)的化合物，可以寫成D-S-S-D，其中D代表苯環(huán)，在酶反應(yīng)體系中存在如下反應(yīng)： G-S-H + D-S-S-D G-S-S-D + DSH G-S-H + G-S-S-D G-S-S-G + DSH谷胱甘肽還原酶的作用： G-S-S-G + NADPH 2GSH + NADP+ 其中，DSH在412 nm處有最大吸收峰。當(dāng)反應(yīng)體系中有微量GSH或者GSSG，足量的DTNB、NADPH和谷胱甘肽還原酶酶活，循環(huán)反應(yīng)可以一直進(jìn)行下去，反應(yīng)液的顏色會(huì)越來越深。在反應(yīng)開始的5 min中內(nèi)，反應(yīng)速率呈線性增

3、加，并和體系內(nèi)谷胱甘肽（包括氧化型和還原型）濃度成正比關(guān)系。如果反應(yīng)體系中不存在谷胱甘肽還原酶和NADPH，則只有最初的GSH能和DTNB反應(yīng)，當(dāng)GSH濃度很低時(shí)，生成的顏色物質(zhì)基本不可測(cè)。通過這樣的循環(huán)反應(yīng)，使得該方法可以檢測(cè)到很低濃度的GSH，靈敏性和專一性強(qiáng)。試劑（1） 125mM磷酸鈉緩沖液，6.3mM EDTA，PH 7.5 配制方法： .稱取NaH2PO4.H2O(分子量138)22.25g，EDTA（分子量372.24）2.35g配成1L溶液；. 稱取Na2HPO4.2H2O(分子量178)17.25g，EDTA（分子量372.24）2.35g配成1L溶液； . 量取900mLN

4、a2HPO4.2H2O溶液（pH約為7.9左右）加入試劑瓶，加入磁力拌器，邊攪拌邊慢慢加入NaH2PO4.2H2O溶液，直至pH達(dá)到7.5。后者的用量大約在100ml左右。（2）6mM DTNB稱取23.8mg DTNB（分子量396.3，SIGMA D-8130），溶于10mL磷酸鈉緩沖液中，4可穩(wěn)定一個(gè)月。每次用量100L，可測(cè)約100個(gè)樣。（3）0.3mM NADPH（分子量833.4）稱取12.5 mg溶解于50mL磷酸鈉緩沖液中，4穩(wěn)定一星期。每次用量700L，可測(cè)70個(gè)樣左右。（4）50U/mL谷胱甘肽還原酶（GR） 如酶性質(zhì)為：172U/mg蛋白，蛋白含量為9.8mg/mL，相當(dāng)

5、于1685.6U/mL酶液。取30L酶液加到970L磷酸鈉緩沖液即可。每次用量10L，可測(cè)約100個(gè)樣。所配制的酶液在4可穩(wěn)定一個(gè)星期甚至更長(zhǎng)時(shí)間。操作步驟在2mL體積的比色皿中順序加入100LDTNB，700LNADPH和經(jīng)適當(dāng)稀釋的樣品（25mL酒精萃取后的上清液稀釋400倍:10L+3990L H2O）200L。室溫下加入10L谷胱甘肽還原酶啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)量412nm處反應(yīng)體系的初始OD值和反應(yīng)3min后的OD值。標(biāo)準(zhǔn)曲線123456GSH（nmol）00.20.40.60.81.00.01mM GSH溶液（L）020406080100水（L）200180160140120100DTNB（

6、L）100100100100100100NADPH(L)700700700700700700GR(L)101010101010注意事項(xiàng)（1）采用精確的微量移液器（2）反應(yīng)比色杯。實(shí)驗(yàn)的樣品只能一個(gè)個(gè)的測(cè)，用在普通分光光度計(jì)上的是4mL比色皿，太大，必須用只有一半大（0.5 cm）厚的比色皿。 (3) 反應(yīng)溫度.嚴(yán)格來說，為保證重復(fù)性，應(yīng)在25下進(jìn)行反應(yīng)，但是我們的分光光度計(jì)不能恒溫，因此每次都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。（4）反應(yīng)時(shí)間需精確控制，否則會(huì)影響反應(yīng)速率計(jì)算，產(chǎn)生較大誤差。（5）加入GR時(shí)，需要用封口膜把比色皿封起來 （6）樣品中的GSH濃度盡可能低一些，否則反應(yīng)速率太大，沒法控制，所以稀釋倍數(shù)

7、要盡量大些參考文獻(xiàn)Tietze, F., 1969. Enzymatic method for quantitative determination of monogram amounts of total and oxidized glutathione: application to mammalian blood and other tissue. Anal. Biochem. 29, 502-522.GSH檢測(cè)方法（普通法）原理DTNB與GSH反應(yīng)產(chǎn)物D-S-H（D代表苯環(huán)）在412 nm處有最大吸收峰，在一定范圍內(nèi)，GSH的濃度與反應(yīng)液的顏色成正比關(guān)系。試劑（1） DTNB溶液：50

8、mM乙酸鈉（M=136.08，含三個(gè)結(jié)晶水）、2mMDTNB（M=396.36） 100mL溶液中含有：三水和乙酸鈉0.6804g，DTNB 0.0793g。（2） Tris-HCl溶液：1M三羥甲基胺基甲烷（M=121.14），pH 8.0100mL溶液中含有：Tris堿12.114g，加濃HCl并稀釋至pH=8.0。 操作步驟 針對(duì)細(xì)胞提取得到的樣品，無需稀釋即可直接檢測(cè)： 0.2mLDTNB溶液+0.4mL Tris-HCl溶液+4mLH2O+500L樣品，于412nm處檢測(cè)吸光度值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得GSH含量。 標(biāo)準(zhǔn)曲線 GSH標(biāo)準(zhǔn)液濃度（g/L） 項(xiàng)目 00.10.20.30.40.

9、5水（mL）4.54.34.34.34.34.3Tris-HCl（mL）0.40.40.40.40.40.4DTNB（mL）0.20.20.20.20.20.2GSH標(biāo)準(zhǔn)液（L）0200200200200200注意事項(xiàng)樣品要最后加，加完樣品后，在第0min，2min，4min時(shí)充分振蕩。參考文獻(xiàn)Tietze, F., 1969. Enzymatic method for quantitative determination of monogram amounts of total and oxidized glutathione: application to mammalian blood

10、and other tissue. Anal. Biochem. 29, 502-522.S-腺苷蛋氨酸（SAM）檢測(cè)方法原理 HPLC法， 利用C18色譜柱對(duì)SAM進(jìn)行分離， 分離后的SAM在254 nm處有最大吸收峰，SAM的濃度與峰面積成正比關(guān)系。試劑流動(dòng)相配制（一級(jí)水配制）：.0.5mol/L的甲酸銨（化學(xué)純，用甲酸溶液調(diào)pH至4.0）溶液1L。.10%的甲醇(HPLC級(jí))溶液200mL操作步驟1. 制樣，10 mL發(fā)酵液離心取細(xì)胞沉淀，向沉淀中加10 mL 0.35 M稀硫酸，4 靜置萃取 2 h，3500 r/min離心3 min，上清液經(jīng)0.22m膜過濾即得樣品（約需1 mL）2

11、. 抽濾裝置清洗：洗衣粉清洗一次 一級(jí)水潤(rùn)洗兩次 烘干備用3. 準(zhǔn)確配置流動(dòng)相，并進(jìn)行抽濾（0.45 m），同時(shí)抽濾一瓶一級(jí)水4. 對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行超聲（10-20 min），除去空氣5. 慢調(diào)流速至0.8 mL/min，待壓力穩(wěn)定后，平衡基線約1 h6. 進(jìn)樣7. 待全部樣品檢測(cè)完，清洗液相系統(tǒng)和色譜柱（先一級(jí)水沖洗約0.5 h-1 h，用10%甲醇沖洗0.5 h-1 h，最后用純甲醇沖洗約1 h） HPLC檢測(cè)條件色譜柱：C18柱（4.6nm×250nm）， 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器 流動(dòng)相：0.5mol/L的甲酸銨溶液 流速：0.8mL/min 柱溫：25 檢測(cè)池溫度：30 檢測(cè)濃度的線

12、性范圍：0-0.5 g/L標(biāo)準(zhǔn)曲線HPLC分析SAM濃度的外標(biāo)曲線 SAM發(fā)酵液樣品的HPLC圖譜注意事項(xiàng)1. 在靜置萃取的過程中要適時(shí)搖晃樣品，使萃取更充分2. 樣品和流動(dòng)相一定要經(jīng)過微膜過濾，且流動(dòng)相要經(jīng)過超聲處理3. 操作過程中要留意系統(tǒng)壓力變化參考文獻(xiàn)李東陽, 于健, 田露, 等.利用重組Pichia pastoris生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸J.生物工程學(xué)報(bào), 2002, 18(3): 295-299.ATP和ADP檢測(cè)方法原理HPLC法，ATP和ADP在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)不同，利用C18色譜柱可以實(shí)現(xiàn)二者的分離，進(jìn)一步利用紫外檢測(cè)器對(duì)分離后的二者的信號(hào)進(jìn)行收集，在254 nm處有最大吸

13、收峰，在一定范圍內(nèi)二者的濃度與峰面積成正比關(guān)系。試劑 流動(dòng)相配制（一級(jí)水配制）：. PBS溶液（1.36 g KH2PO4加0.1 mol·L-1 NaOH溶液15.2 mL，用水稀釋至100 mL，pH 6.5）.10%的甲醇(HPLC級(jí))溶液200mL操作步驟1制樣，取5 mL發(fā)酵液，經(jīng)4，8000 r·min-1冷凍離心10 min得到酵母泥，將濕細(xì)胞重新懸浮在5 mL 0.2 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）中，超聲波破碎10 min（功率22%，破碎10 s，間隔10 s），離心后得到的上清液經(jīng)0.22m膜過濾即得樣品（約需1 mL）2.抽濾裝置

14、清洗：洗衣粉清洗一次 一級(jí)水潤(rùn)洗兩次 烘干備用3.準(zhǔn)確配置流動(dòng)相，并進(jìn)行抽濾（0.45 m），同時(shí)抽濾一瓶一級(jí)水4.對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行超聲（10-20 min），除去空氣5.用一級(jí)水以0.8 mL/min流速?zèng)_洗柱子0.5 h，然后利用流動(dòng)相平衡系統(tǒng)約1 h6.進(jìn)樣7.待全部樣品檢測(cè)完，清洗液相系統(tǒng)和色譜柱（先一級(jí)水沖洗約0.5 h-1 h，用10%甲醇沖洗0.5 h-1 h，最后用純甲醇沖洗約1 h）HPLC檢測(cè)條件色譜柱：C18柱（4.6nm×250nm），檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器 流動(dòng)相：0.01 M PBS溶液 流速：0.8mL/min 柱溫：35檢測(cè)濃度的線性范圍：0-50 mg/L

15、標(biāo)準(zhǔn)曲線HPLC分析ATP、ADP濃度的外標(biāo)曲線注意事項(xiàng)檢測(cè)ATP和ADP濃度的流動(dòng)相為緩沖鹽，因緩沖鹽與有機(jī)溶劑混合易形成細(xì)小沉淀，造成系統(tǒng)或者柱子的堵塞，因而在檢測(cè)前和檢測(cè)后必須用一級(jí)水對(duì)整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行徹底的沖洗。參考文獻(xiàn)Sato K, Yoshida Y, Hirahara T, Ohba T. On-line measurement of intracellular ATP of Saccharomyces cerevisiae and pyruvate during sake mashing J. J. Biosci. Bioeng., 2000, 90(3): 294-301NADH

16、和NAD+檢測(cè)方法原理HPLC法，NADH和NAD+在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)不同，利用C18色譜柱可以實(shí)現(xiàn)二者的分離，進(jìn)一步利用紫外檢測(cè)器對(duì)分離后的二者的信號(hào)進(jìn)行收集，在254 nm處有最大吸收峰，在一定范圍內(nèi)二者的濃度與峰面積成正比關(guān)系。試劑 流動(dòng)相配制（一級(jí)水配制）：. 10.93 g NaH2PO4和3.04 g Na2HPO4溶于水中，加入四丁基溴化銨3.22 g，調(diào)節(jié)pH為6.5，真空抽濾后定容至1 L，按86:14（v·v-1）比例和乙腈混合.10%的甲醇(HPLC級(jí))溶液200mL操作步驟1制樣，取5 mL發(fā)酵液，經(jīng)4，8000 r·min-1冷凍離心10

17、min得到酵母泥，將濕細(xì)胞重新懸浮在5 mL 0.2 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）中，超聲波破碎10 min，離心后得到的上清液經(jīng)0.22m膜過濾即得樣品（約需1 mL）2.抽濾裝置清洗：洗衣粉清洗一次 一級(jí)水潤(rùn)洗兩次 烘干備用3.準(zhǔn)確配置流動(dòng)相，并進(jìn)行抽濾（0.45 m），同時(shí)抽濾一瓶一級(jí)水4.對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行超聲（10-20 min），除去空氣5.用一級(jí)水以0.8 mL/min流速?zèng)_洗柱子0.5 h，然后利用流動(dòng)相平衡系統(tǒng)約1 h6.進(jìn)樣7.待全部樣品檢測(cè)完，清洗液相系統(tǒng)和色譜柱（先一級(jí)水沖洗約0.5 h-1 h，用10%甲醇沖洗0.5 h-1 h，最后用純甲醇沖洗約1

18、h）HPLC檢測(cè)條件色譜柱：C18柱（4.6nm×250nm）， 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器 流動(dòng)相：見試劑 流速：0.8mL/min 柱溫：35檢測(cè)濃度的線性范圍：0-50 mg/L標(biāo)準(zhǔn)曲線HPLC分析NADH、NAD+濃度的外標(biāo)曲線參考文獻(xiàn)Miseta A, Tökés-Füzesi M, Aiello D P, Bedwell D M. A Saccharomyces cerevisiae mutant unable to convert glucose to glucose-6-phosphate accumulates excessive glucos

19、e in endoplasmic reticulum due to core oligosaccharide trimming J. Eukaryot. Cell, 2003, 2(3): 534-541葡萄糖檢測(cè)方法原理DNS與還原性糖在共沸條件下，生成的物質(zhì)在520 nm處有最大吸收峰，且在一定范圍內(nèi)吸收峰的強(qiáng)度（OD值）與還原糖濃度成線性關(guān)系。試劑DNS：甲液:溶解6.9g苯酚于15.2mL10%NaOH中，并稀釋至69mL，在此溶液中加入6.9g NaHSO3。乙液：稱取255g酒石酸鉀鈉，加到300mL10%NaOH中，再加入880mL 1%的3，5-二硝基水楊酸。甲、乙液混合得黃色

20、試劑，貯存于棕色瓶中，室溫放置7-10天后備用。操作步驟0.04mL樣品+1.96mL水+1.5mLDNS+沸水浴五分鐘，冷卻至室溫并定容至25mL520nm處檢測(cè)OD值濃度范圍 0-0.5 g/L標(biāo)準(zhǔn)曲線 葡萄糖母液1g/L：稱取0.1160g葡萄糖，溶于100mL去離子水。 反應(yīng)體系試管號(hào) 項(xiàng)目01（0.1g/L）2（0.2g/L）3（0.3g/L）4（0.4g/L）5（0.5g/L）DNS（mL）1.51.51.51.51.51.5葡萄糖母液（mL）00.20.40.60.81水（mL）21.81.61.41.21 體系共3.5mL，沸水浴五分鐘，迅速冷卻，定容至25mL，測(cè)520處的O

21、D值。參考文獻(xiàn)Miller G. Use of 3,5-dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars J. Anal. Chem., 1959, 31: 426-428尿素檢測(cè)方法原理二乙酰一肟顯色法試劑酸性試劑：在三角燒瓶中加蒸餾水約100ml，然后加入濃硫酸44ml 及85%磷 酸66ml，冷卻至室溫，加入硫氨脲50mg 及硫酸鎘（CdSO4.8H2O）2g ，溶解后用蒸餾水稀釋至1L，置棕色瓶放冰箱保存，可穩(wěn)定半年；二乙酰一肟溶液：稱取二乙酰一肟20g ，加蒸餾水約900ml，溶解后，再用蒸餾水稀釋至

22、1L，置棕色瓶中，貯放冰箱內(nèi)可保存半年不變；尿素標(biāo)準(zhǔn)貯存液（100mmol/L）：稱取干燥純尿素（MW=60.06）0.6g ，溶解于水，并稀釋至100ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。尿素標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（5mmol/L）：取5.0ml貯存液用去氨蒸餾水稀釋至100ml。 操作步驟空白管：蒸餾水0.02ml + 二乙酰一肟 0.5ml + 酸性試劑 5ml ；檢測(cè)管：樣品0.02ml + 二乙酰一肟 0.5ml + 酸性試劑 5ml ；混勻后，置沸水浴中加熱12min ，取出，置冷水中冷卻5min后，用分光光度計(jì)波長(zhǎng)540nm，比色杯光徑1.0cm，以空白管調(diào)零，讀取測(cè)定管吸光度。濃度范圍0- 10 mmol/L標(biāo)

23、準(zhǔn)曲線 尿素濃（mmol/L）0246810尿素（ml）00.020.020.020.020.02蒸餾水（ml）0.0200000二乙酰一肟(ml)0.50.50.50.50.50.5酸性試劑（ml）555555參考文獻(xiàn)葉應(yīng)嫵, 王毓三. 全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第二版） M. 南京: 東南大學(xué)出版社, 1997, 260- 261.無機(jī)硒檢測(cè)原理：Se能夠催化氯酸鉀氧化苯肼生成偶氮離子，繼而與變色酸偶合成紅色偶氮染料，生成的紅色偶氮染料的吸光度與一定濃度范圍的硒成正比，因而可利用催化吸光光度法測(cè)定硒酵母中的硒含量。試劑：變色酸：0.03mol/L，稱取變色酸1.0930g，定容至l00ml。鹽

24、酸苯肼：0.03mol/L，稱取0.4400g鹽酸苯肼，定容至100ml。EDTA：0.02mol/L，稱取EDTA 鈉鹽0.7450g定容至100ml。氯酸鉀：0.6mol/L，稱取7.3500g氯酸鉀定容至100ml。HCIKC1緩沖液：0.2mol/L ，取濃鹽酸2.50ml稀釋至150ml；再取氯化鉀2.2500g，定容至150ml，兩者混勻。亞硒酸鈉標(biāo)液：稱取亞硒酸鈉0.08167g，定容至500ml，然后再稀釋500倍操作步驟：取10 mL發(fā)酵液，3500 r/min離心10 min收集菌體，蒸餾水離心洗滌3次。將濕菌體懸浮于5 mL去離子水中，沸水浴30 min，離心，測(cè)定上清液

25、中硒的濃度。向25 mL比色管中依次加入乙二氨四乙酸二鈉（EDTA-2Na）溶液1 mL、HCl-KCl緩沖液2 mL、氯酸鉀2 mL、變色酸2 mL、鹽酸苯肼1 mL和待測(cè)樣品2 mL，混勻，在沸水浴中加熱20 min，于冷水中迅速冷卻后，利用酶標(biāo)儀測(cè)定520 nm下吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線：反應(yīng)體系10ml 標(biāo)準(zhǔn)樣2ml 試劑8ml 母液 2µg/ml梯度µg/ml00.020.040.060.080.10Se含量µg00.20.40.60.81所需標(biāo)準(zhǔn)樣濃度00.10.20.30.40.5從母液中取 µl0100200300400500水（ml）2.01.

26、91.81.71.61.5 管號(hào)方法123456標(biāo)準(zhǔn)樣(mL)222222EDTA(mL)111111HCl-KCl緩沖液(mL)2.02.02.02.02.02.0氯酸鉀(mL)2.02.02.02.02.02.0變色酸(mL)2.02.02.02.02.02.0鹽酸苯肼(mL)111111沸水浴 20 min，于冷水中冷卻，于520nm測(cè)OD有機(jī)硒檢測(cè)原理：Se2-+2H+ H2Se 將H2Se通過載氣（氬氣）導(dǎo)入石英爐進(jìn)行測(cè)定。操作步驟：.樣品的消化取5 mL發(fā)酵液，在3500 r/min下離心10 min，蒸餾水離心洗滌3次，收集濕菌體。將濕菌體置于小燒杯中并加入混合酸（濃HNO3 :

27、 濃HClO4 = 4:1)10 mL，加熱直到溶液上面有滾滾白煙時(shí)停止加熱，此時(shí)溶液變成無色，冷卻后，定容至100 mL待測(cè)。.樣品檢測(cè) 采用氫化物原子熒光光譜法。稱取0.5 g2 g（精確至0.001 g）試樣，液體試樣吸取1.00 mL10.00 mL，置于消化瓶中，加10.0 mL混合酸及幾粒玻璃珠，蓋上表面皿冷消化過夜。次日于電熱板上加熱，并及時(shí)補(bǔ)加硝酸。當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙時(shí)，再繼續(xù)加熱至剩余體積2 mL左右，切不可蒸干。冷卻，再加5.0 mL鹽酸，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙出現(xiàn)，將六價(jià)硒還原成四價(jià)硒。冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，混勻備用。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

28、吸取10.0 mL試樣消化液于15 mL離心管中，加鹽酸2.0 mL，鐵氰化鉀溶液1.0 mL，混勻用原子熒光光譜儀檢測(cè)。氧化性有關(guān)酶的酶活（GPx、CAT、SOD、MDA等）檢測(cè)原理GPx：谷胱甘肽過氧化物酶可以促進(jìn)過氧化氫（H2O2）與還原型谷胱甘肽（GSH）反應(yīng)生成H2O及氧化型谷胱甘肽（GSSG），谷胱甘肽過氧化物酶的活力可以利用其酶促反應(yīng)的速度來表示，測(cè)定此酶促反應(yīng)中還原型谷胱甘肽的消耗，則可求出酶的活力。CAT：過氧化氫酶（CAT）分解H2O2的反應(yīng)可通過加入鉬酸銨而迅速終止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在405nm處測(cè)定其生成量，可計(jì)算出CAT的活力。SOD

29、：采用經(jīng)典的氮藍(lán)四唑（NBT）顯色法。通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子，將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲臜，后者在560nm處有強(qiáng)吸收。而SOD可清除超氧陰離子，從而抑制了甲臜的形成。反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明超氧化物歧化酶活性愈低，反之則酶活性愈高。據(jù)此通過比色分析就可以計(jì)算出超氧化物歧化酶活性水平。MDA：丙二醛在較高的溫度下可與硫代巴比妥酸（TBA）發(fā)生反應(yīng)，形成紅色的MDA-TBA加合物，該加合物在535 nm處有最大吸收峰，據(jù)此可以通過比色法進(jìn)行MDA的檢測(cè)。相關(guān)操作步驟及其它，請(qǐng)?jiān)斠姼鳈z測(cè)試劑盒。己糖激酶測(cè)定方法原理 D-葡萄糖+ATP6-磷酸葡萄糖+ADP 6-磷酸葡萄糖+NAD

30、P+6-磷酸葡萄糖酸鹽+NADPH反應(yīng)體系：100 mM Tris-buffer(pH 7.6)1.0 ml 500 mM D-葡萄糖0.4 ml 250 mM MgCl20.12 ml 36 mM ATP0.8 ml 10 mM NADP0.3 ml H2O0.08 ml 細(xì)胞破碎液0.1 ml 酶活測(cè)定在37恒溫下進(jìn)行。用分光光度計(jì)于340 nm下每隔30 s讀取一次吸光值（A），共讀取3 min。以A對(duì)時(shí)間作圖，取反應(yīng)最初線性部分計(jì)算酶活。注意事項(xiàng) 最后加細(xì)胞破碎液，之后立即混勻放入分光光度計(jì)中測(cè)定。酶活定義 1個(gè)酶活單位表示為在1分鐘內(nèi)該酶催化形成產(chǎn)物的微摩爾數(shù)。參考文獻(xiàn) Barnar

31、d E A. Hexokinase from yeast J. Methods Enzymol, 1975, 42: 6-20.磷酸果糖激酶測(cè)定方法原理 果糖-6-磷酸+ATP果糖-1,6-二磷酸+ADP 磷酸烯醇式丙酮酸+ADP丙酮酸+ATP 丙酮酸+NADH乳酸+NAD反應(yīng)體系：0.2 mM NADH0.1 ml 0.1 M Tris-buffer(pH 7.6)0.1 ml 8 mM MgCl20.1 ml 0.1 M 葡萄糖-6-磷酸0.1 ml 1 mM ATP0.2 ml 2.7 U/ml 醛縮酶0.2 ml 4.7 U/ml 甘油磷酸脫氫酶0.1 ml 2.5 mM 二硫蘇糖醇0

32、.1 ml 細(xì)胞破碎液0.1 ml酶活測(cè)定在37恒溫下進(jìn)行。用分光光度計(jì)于340 nm下每隔30 s讀取一次吸光值（A），共讀取3 min。以A對(duì)時(shí)間作圖，取反應(yīng)最初線性部分計(jì)算酶活。注意事項(xiàng) 最后加細(xì)胞破碎液，之后立即混勻放入分光光度計(jì)中測(cè)定。酶活定義 1個(gè)酶活單位表示為在1分鐘內(nèi)該酶催化形成產(chǎn)物的微摩爾數(shù)。參考文獻(xiàn) Zhang J, Fu R Y, Hugenholtz J, et al. Glutathione protects Lactococcus lactis against acid stress J. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(16):

33、5268-5275.丙酮酸激酶測(cè)定方法原理 磷酸烯酮式丙酮酸+ADP丙酮酸+ATP 丙酮酸+NADHL-乳酸+NAD+反應(yīng)體系：0.1 M Tris-buffer(pH 7.6)0.82 ml 0.5 M KCl0.02 ml 0.25 M MgCl20.01 ml 0.01 M 磷酸烯醇式丙酮酸0.05 ml 0.1 M ADP0.05 ml 0.01 M NADH0.02 ml 1500 U/ml 乳酸脫氫酶0.02 ml酶活測(cè)定在37恒溫下進(jìn)行。用分光光度計(jì)于340 nm下每隔30 s讀取一次吸光值（A），共讀取3 min。以A對(duì)時(shí)間作圖，取反應(yīng)最初線性部分計(jì)算酶活。注意事項(xiàng) 最后加細(xì)胞

34、破碎液，之后立即混勻放入分光光度計(jì)中測(cè)定。酶活定義 1個(gè)酶活單位表示為在1分鐘內(nèi)該酶催化形成產(chǎn)物的微摩爾數(shù)。參考文獻(xiàn) Reibstein D, Hollander J A, Pilkis S J, et al. Studies on the regulation of yeast phosphofructo-1-kinase: its role in aerobic and anaerobic glycolysis J. Biochemistry, 1986, 25(1): 219-227.-谷氨酰半胱氨酸合成酶測(cè)定方法原理 有機(jī)物經(jīng)酸氧化分解，使磷在酸性條件下與鉬酸銨結(jié)合生成磷鉬酸銨，此化合

35、物經(jīng)過對(duì)苯二酚，亞硫酸鈉還原成藍(lán)色化合物鉬藍(lán)。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)660 nm處測(cè)定鉬藍(lán)的吸光值，以測(cè)定磷的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：25 mM ATP0.1 ml 100 mM 谷氨酸0.1 ml 1 g/L 牛血清蛋白0.05 ml 0.032 M 磷酸二氫鉀01020304050 H2O625615605595585575 0.1 M Tris-HCl(pH 8.0)25 l 0.1 M L-氨基丁酸 100 l 37放置半小時(shí)，后加入125 l三氯乙酸（10%）終止反應(yīng)。然后加入1.6%的鉬酸銨與1%的硫酸亞鐵的混合溶液（其中前者的用量為1000 L，后者的用量為400 L），加去離子水定容至

36、10 mL。用分光光度計(jì)于660 nm下讀取吸光值。樣品測(cè)定時(shí)，直接加入100 l細(xì)胞破碎液代替磷酸二氫鉀溶液。注意事項(xiàng) 鉬酸銨需用15%的硫酸配置；鉬酸銨與硫酸亞鐵需單獨(dú)配置，在加之前混合，混合均勻后再用，且先用現(xiàn)配。酶活定義 1個(gè)酶活單位表示為每毫克蛋白釋放的磷（Pi）的微摩爾數(shù)。參考文獻(xiàn) Kenchappa R S, Ravindranath V. -Glutamyl cysteine synthetase is up-regulated during recovery of brain mitochondrial complex I following neurotoxic insul

37、t in mice J. Neurosci Lett, 2003, 350(1): 51-55.普魯蘭產(chǎn)量及其分子量1. 分批發(fā)酵中取樣方式用不同不同規(guī)格的注射器取樣品，取樣時(shí)間點(diǎn)通常是0 、6、9、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72。2. 發(fā)酵液的處理用于檢測(cè)常規(guī)非活性指標(biāo)取發(fā)酵液20ml，80加熱20min，于12000rpm室溫（25-30）離心20min。3. 生物量和普魯蘭產(chǎn)量將離心所得菌體沉淀于70烘箱烘干至恒重（36h-48h），稱量得生物量。取離心所得上清液10ml，加入2倍體積無水乙醇沉淀，4過夜（12h or so），于412000rpm離心1

38、0min，棄去上清，留多糖沉淀于70烘箱烘干至恒重（36h-48h）。參考文獻(xiàn)：江南大學(xué)博士普魯蘭的發(fā)酵及改性研究4. 分子量的估計(jì)分子量用粘均分子量來表示,具體如下：取5ml上清加入加入水稀釋,具體的體積因樣品點(diǎn)而異；一般除6h、9h點(diǎn)加10ml水外，其余點(diǎn)加水25ml（20ml）；充分搖勻，得到稀釋后的多糖溶液。分子量估計(jì)方法：配制試劑：配制0.05M和0.15M的無水硫酸鈉溶液用于稀釋在烏氏粘度計(jì)中的樣品；無水硫酸鈉分子量142。在30恒溫下，取10ml稀釋后的多糖溶液，加入烏氏粘度計(jì)，同時(shí)加入5ml 0.15M硫酸鈉溶液，用洗耳球充分混勻，根據(jù)具體情況（流出時(shí)間在110-200秒內(nèi)比較

39、好）繼續(xù)加入一定體積的0.05M的硫酸鈉溶液，用秒表記錄流出時(shí)間。然后用多糖濃度數(shù)據(jù)和流出時(shí)間計(jì)算分子量。具體計(jì)算如下：若約定純?nèi)軇┑恼扯葹?,同溫度下溶液的粘度為。定義如下參數(shù)：1.相對(duì)粘度：2.增比粘度：3.比濃粘度：一點(diǎn)法通用式：然后根據(jù)公式： 單位dL/g。參考文獻(xiàn)高分子物理；網(wǎng)絡(luò)資源（ppt，武漢百特純）；Roukas, T., & Biliaderis, C. G. (1995). Evaluation of carob pod as a substrate for pullulan production by Aureobasidium pullulans. Applie

40、d Biochemistry and Biotechnology, 55, 2744.Stephen E. Harding, Kjell M. Vårum, Bjørn T. Stokke and Olav Smidsrød(1991). Molecular weight determination of polysaccharides. Advances in Carbohydrate Analysis, 1, 63-144.總糖的測(cè)定-硫酸蒽酮法原理糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一

41、定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量。濃度范圍 小于0.1 g/L試劑A.蒽酮試劑：稱取200mg蒽酮溶于100ml 98%的濃硫酸，即配即用（使用硫酸注意安全操作）；B. 0.1g/l葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（靈敏度比DNS法高）。標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)0123456葡萄糖標(biāo)液體積ul01002004006008001000水的體積ul10009008006004002000糖濃度g/l00.010.020.040.060.080.1加入蒽酮試劑ml4444444各管加入蒽酮試劑后立即混勻迅速置于冰浴中；待各管都加入蒽酮試劑后，同時(shí)置于沸水浴中，準(zhǔn)確加熱7min，立即取出，冰浴中迅速冷卻，待各管

42、達(dá)室溫后，以第一管（水也可以）為空白，于620nm處迅速測(cè)定各管OD值。參考文獻(xiàn)梁麗軍,曾哲靈,熊濤，呂偉(2008). 蒽酮硫酸法測(cè)定大蒜多糖含量. 食品科學(xué),29,499-502.蔗糖檢測(cè)方法試劑（1） DNS：甲液:溶解6.9g苯酚于15.2mL10%NaOH中，并稀釋至69mL，在此溶液中加入6.9g NaHSO3乙液：稱取255g酒石酸鉀鈉，加到300mL10%NaOH中，再加入880mL1%的3，5-二硝基水楊酸。1、 乙液混合得黃色試劑，貯存于棕色瓶中，室溫放置7-10天后備用。（2）6M HCl：60mL濃鹽酸+56mL水（3）6M NaOH：24g氫氧化鈉+100mL水操作步

43、驟(1) 1mL糖（樣品：稀釋50倍-20L樣+980L水）+ 0.2mLHCl先沸水浴十分鐘，在冷水浴冷卻至室溫(2)在上述液體中加入0.2mLNaOH，振蕩30秒，中和多余的酸，再加入DNS試劑，沸水浴五分鐘，冷水浴冷卻至室溫，定容至25mL，測(cè)520nm處OD值。標(biāo)準(zhǔn)曲線配制1.0g/L的蔗糖溶液作為母液濃度（g/L）項(xiàng)目 00.20.40.60.81.0母液（mL）00.20.40.60.81.0水（mL）10.80.60.40.20NH4+濃度測(cè)定（改良的Berthelot法）試劑溶液A：10g/l苯酚+10mg/l亞硝鐵氰化鈉；溶液B：90g/l Na2HPO4·12H2

44、O + 6g/l NaOH + 10ml NaOCl操作步驟0.2 ml樣品+4 ml 溶液A + 4 ml溶液B（注意順序：先加入200ul樣品,加入A液后,混勻;加入B液后再混勻）。37保溫反應(yīng)30 min，測(cè)定OD630nm濃度范圍 小于0.1 g/L標(biāo)準(zhǔn)曲線試管號(hào)項(xiàng)目0010.02g/L20.04g/L30.06g/L40.08g/L50.1g/L(NH4)2SO4溶液（mL）00.040.080.120.160.2水（mL）0.20.160.120.080.040A液（mL）4 ml4 ml4 ml4 ml4 ml4 mlB液（mL）4 ml4 ml4 ml4 ml4 ml4 ml參

45、考文獻(xiàn)E. D. Rhine, G. K. Sims, R. L. Mulvaney, and E. J. Pratt(1998). Improving the Berthelot Reaction for Determining Ammonium in Soil Extracts and Water. Soil Sci. Soc. Am. J., 62, 473-480 .蛋白質(zhì)含量測(cè)定-考馬斯亮藍(lán)方法試劑考馬斯亮藍(lán)G-250 100mg溶于50ml乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000ml（配制好用濾紙過濾）；B標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)

46、氮含量。根據(jù)其純度用0.15mol/l NaCl（約0.9%生理鹽水）配制成1.0mg/ml蛋白質(zhì)溶液；標(biāo)準(zhǔn)曲線試管編號(hào)0123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(ml)00.010.020.030.040.050.060.15mol/l NaCl (ml)0.100.090.080.070.060.050.04考馬斯亮藍(lán)試劑(ml)5.05.05.05.05.05.05.0搖勻，1小時(shí)內(nèi)以0管為空白對(duì)照。在595nm處比色（5-20min內(nèi)測(cè)）。參考文獻(xiàn)趙英永，戴云，崔秀明，張文斌，馬妮（2006）. 考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定草烏中可溶性蛋白質(zhì)含量. 云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),15,235-2

47、37.李志江（2008）. G250染色法測(cè)定啤酒中蛋白質(zhì)含量.釀酒，35，70-71.胞內(nèi)pH（pHi）的測(cè)定原理激發(fā)所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，隨pH變化而變化；其根本原因是因pH不同，熒光物質(zhì)的解離狀態(tài)不同，不同的解離狀態(tài)具有不同的熒光能力。藥品5-FAM，5-cFDA(水相里易分解，不穩(wěn)定)，兩性霉素B，二甲亞砜（其作為溶劑，但有點(diǎn)傷及細(xì)胞，因此，所配置溶液較濃）。操作步驟1.取-70冰凍含細(xì)胞發(fā)酵液，于30，200rpm下，融化復(fù)活90-120min。2.稀釋，使細(xì)胞濃度為OD620nm=0.6-0.8之間（細(xì)胞越新鮮越有活力越好；選取適中濃度發(fā)酵液直接稀釋使其在上述范圍內(nèi)，然后統(tǒng)一個(gè)稀釋倍數(shù)即可）。3.透性細(xì)胞的制備a 用終濃度5mg/l的兩性霉素B制備透性細(xì)胞，于30，200rpm下，孵育60min。使用的緩沖液pH=7.4（偏堿性使兩性霉素B最好的發(fā)揮作用）。b 將孵育后的細(xì)胞懸液，離心（10000rpm，4，10min）得到細(xì)胞沉淀，用不同pH的緩沖液復(fù)溶（pH4-8，如4、5、5.4、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.4、8.0）；然后加入終濃度為0.2umol/l的5-羧基熒光素（5-F