1、SSL-CA09-553島津應用數(shù)據(jù)集色譜分析 LCMSMS-060超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法測定蜂蜜中5種四環(huán)素類抗生素的殘留摘 要：本文建立了一種使用島津超高效液相色譜儀和三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用測定蜂蜜中5種四環(huán)素類抗生素殘留的方法。蜂蜜樣品中的四環(huán)素類抗生素經(jīng)固相萃取富集后，使用超高效液相色譜LC-30A快速分離，三重四極桿質(zhì)譜儀LCMS-8040進行定量分析。使用外標法繪制5種四環(huán)素類抗生素的校準曲線，線性范圍寬，校準曲線的相關(guān)系數(shù)均在0.9996以上。對5 g/L、10 g/L和50 g/L混合標準溶液進行精密度實驗，連續(xù)6次進樣保留時間和峰面積的相對標準偏差分別在0.20%

2、1.14%和0.62% 3.79%之間，系統(tǒng)精密度良好。其檢出限為31.963.4 ng/L，定量限為127254 ng/L，樣品加標回收率在86.9 98.1%之間。關(guān)鍵詞：四環(huán)素 抗生素 三重四極桿質(zhì)譜 蜂蜜四環(huán)素類抗生素(Tetracyclines, TCs)是臨床上廣泛應用的廣譜抗生素。然而，不合理地使用該類藥物，如用藥劑量過大、用藥時間過長、濫用藥物及不遵守休藥期提前屠宰等，導致該類藥物及其代謝產(chǎn)物殘留于動物的肌肉、蛋、奶、臟器組織及分泌物中。四環(huán)素類抗生素并不能被動物完全吸收，有相當部分以原形或代謝物形式進入食物鏈和環(huán)境中，間接對人體健康造成影響。近年來，蜂蜜產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速。我國蜜蜂

3、大多是從國外引進的，發(fā)病率比較高，雖然國家提倡生物防治，但還是有一部分人用化學藥物、抗生素來給蜜蜂治病，導致蜂蜜中抗生素含量較高。因此，迫切需要建立高效靈敏的蜂蜜中四環(huán)素的檢測方法。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是近些年來發(fā)展很快的分析技術(shù)，具有高的選擇性和靈敏度，對復雜基體中的藥物殘留具有準確的定性能力。本文建立了一種使用島津超高效液相色譜儀LC-30A和三重四極桿質(zhì)譜儀LCMS-8040聯(lián)用測定蜂蜜中的五種四環(huán)素類抗生素的方法。1. 實驗部分1.1儀器本實驗使用島津超高效液相色譜儀LC-30A與三重四極桿質(zhì)譜儀LCMS-8040聯(lián)用系統(tǒng)。具體配置為LC-30AD×2輸液泵，DGU

4、-20A5在線脫氣機，SIL-30AC自動進樣器，CTO-30AC柱溫箱，CBM-20A系統(tǒng)控制器，LCMS-8040三重四極桿質(zhì)譜儀，LabSolutions Ver. 5.53色譜工作站。1.2分析條件液相條件色譜柱：Shim-pack XR-ODS II, 2.0 mm I.D.× 100 mm L., 2.2 m粒徑。流動相：A0.1%甲酸的水溶液；B甲醇流速：0.25 mL/min柱溫：室溫。進樣量：20 L洗脫方式：梯度洗脫，B相初始濃度為20%，洗脫程序見表1。表1 梯度洗脫程序Time(min)ModuleCommandValue5.00 PumpsPump B Co

5、nc.956.00 PumpsPump B Conc.956.01 Pumps Pump B Conc.208.00 ControllerStop質(zhì)譜條件離子化模式： ESI(+) 離子噴霧電壓：4.5 kV霧化氣： 氮氣 3.0 L/min 干燥氣： 氮氣 15 L/min碰撞氣： 氬氣 DL溫度： 250 加熱模塊溫度：400 掃描模式： 多反應監(jiān)測(MRM)駐留時間： 10 ms延遲時間： 3 ms MRM參數(shù)：見表21.3樣品制備標準溶液配制：稱取適量五種標準物質(zhì)，分別為四環(huán)素、土霉素、去甲基金霉素、金霉素和強力霉素，用甲醇配制1000 mg/L的混合標準儲備溶液溶液，用甲醇+0.1甲

6、酸水溶液(V/V, 1:4)稀釋成不同濃度的混合標準工作液。樣品前處理方法：蜂蜜樣品的制備、凈化、提取參照GB/T 23409-2009 蜂王漿中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法。表2 MRM優(yōu)化參數(shù)化合物名稱英文名CAS. NO前體離子產(chǎn)物離子Q1 Pre Bais(V)CE(V)Q3 Pre Bais(V)四環(huán)素Tetracycline60-54-8445.20410.10*-22-20-29427.15-22-14-30土霉素Oxytetracycline79-57-2461.20426.10*-23-19-30443.20-23-14-21去甲基金霉素

7、Demeclocycline hydrochloride64-73-3465.10448.10*-23-19-30430.10-23-22-30金霉素Chlorotetracycline57-62-5479.15444.20*-24-22-30462.15-24-18-22強力霉素Doxycycline564-25-0445.15428.25*-22-19-30154.20-22-34-28注：*表示定量離子2結(jié)果與討論2.1 標準樣品一級質(zhì)譜圖和產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖四環(huán)素的一級質(zhì)譜圖見圖1，產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖2。 圖1 四環(huán)素的一級質(zhì)譜圖圖2 四環(huán)素的產(chǎn)物離子掃描圖(CE值-20V)土霉素

8、的一級質(zhì)譜圖見圖3，產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖4。 圖3 土霉素的一級質(zhì)譜圖 圖4 土霉素的產(chǎn)物離子掃描圖(CE值-19V)去甲基金霉素的一級質(zhì)譜圖見圖5，產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖6。圖5 去甲基金霉素的一級質(zhì)譜圖 圖6 去甲基金霉素的產(chǎn)物離子掃描圖(CE值-19V)金霉素的一級質(zhì)譜圖見圖7，產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖8。圖7 金霉素的一級質(zhì)譜圖 圖8金霉素的產(chǎn)物離子掃描圖(CE值-22V)強力霉素的一級質(zhì)譜圖見圖9，產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖10。 圖9 強力霉素的一級質(zhì)譜圖 圖10 強力霉素的產(chǎn)物離子掃描圖(CE值-19V)2.2標準樣品的MRM色譜圖54321圖11 標準樣品的MRM色譜圖(100 g

9、/L)（1、四環(huán)素；2、土霉素；3、去甲基金霉素；4、金霉素；5、強力霉素）2.3 線性范圍將0.2 g/L、0.5 g/L、1 g/L、2.5 g/L、5 g/L、10 g/L、50 g/L、100 g/L和200 g/L不同濃度的混合標準工作液按1.2中的分析條件進行測定，外標法定量。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制校準曲線如圖1216所示；所得校準曲線線性關(guān)系良好，線性方程及相關(guān)系數(shù)見表3。 圖12 四環(huán)素校準曲線 圖13 土霉素標準曲線 圖14 去甲金霉素標準曲線 圖15 金霉素標準曲線圖16 強力霉素標準曲線表3校準曲線參數(shù)No.名稱校準曲線線性范圍（µg/L）相關(guān)系數(shù)

10、r1四環(huán)素Y = (49259.9)X + (-1866.27) 0.22000.99992土霉素Y = (28905.9)X + (-348.296)0.51000.99973去甲基金霉素Y = (27468.4)X + (1698.49) 0.51000.99964金霉素Y = (12102.7)X + (571.906)0.51000.99975強力霉素Y = (77333.8)X + (5973.94) 0.21000.99982.4 精密度實驗對不同濃度混合標準工作液連續(xù)測定6次，考察儀器的精密度，保留時間和峰面積的重復性結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示：不同濃度標準品保留時間和峰面積的相對

11、標準偏差分別在0.20% 1.34%和0.62% 3.79%之間，儀器精密度良好。表4 保留時間和峰面積重復性結(jié)果(n=6)樣品名稱RSD%（5 µg/L）RSD%（10 µg/L）RSD%（50 µg/L）R.T.AreaR.T.AreaR.T.Area四環(huán)素1.143.210.932.651.101.42土霉素0.822.760.912.870.790.62去甲基金霉素0.883.270.783.040.702.90金霉素0.483.790.462.980.381.80強力霉素0.202.710.221.720.201.202.5 檢出限配制濃度為為200 n

12、g/L標樣7份，直接進樣分析，對上述結(jié)果剔除利群值后將各自的7次測定結(jié)果計算標準偏差S，此時檢出限MDL3.14×S，定量下限LOQ=4×MDL。測定結(jié)果如表5所示。表5 四環(huán)素類抗生素的檢出限和定量下限No.名稱標準偏差(S)檢出限(ng/L)定量下限(ng/L)1四環(huán)素14.946.81872土霉素20.263.42543去甲基金霉素17.855.92244金霉素18.457.82315強力霉素10.231.91272.6 回收率實驗以蜂蜜為待測樣品，檢測5種四環(huán)素類抗生素。在2 g蜂蜜樣品中檢出四環(huán)素，濃度為0.249 µg/kg。色譜圖如圖17。為了研究該

13、分析方法對蜂蜜樣品中四環(huán)素類抗生素的實際檢測效果，向蜂蜜樣品中加入濃度為2 µg/kg的5種四環(huán)素類抗生素標準物質(zhì)，加標色譜圖如圖18所示，加標回收率見表6。2.7實際樣品的MRM色譜圖1圖17 蜂蜜樣品樣的MRM色譜圖（檢出1四環(huán)素） 54321圖18 蜂蜜加標(2 µg/kg)樣品的MRM色譜圖（1、四環(huán)素；2、土霉素；3、去甲基金霉素；4、金霉素；5、強力霉素）表6 四環(huán)素類抗生素加標回收率結(jié)果No.名稱樣品1實測濃度(µg/kg)樣品2實測濃度(µg/kg)平均回收率(%)1四環(huán)素2.182.2598.1 2土霉素1.931.8795.2 3去甲基金霉素1.671.8186.9 4金霉素1.781.7688.3 5強力霉素1.