1、第四章 藥物的含量測定方法與驗證1、藥物的含量：指藥物中所含主成分的量，是評價藥物質量的重要標準。2、可供藥物含量測定的分析方法：（1）容量分析法優(yōu)點：操作簡便，結果準確，方法耐用性高。缺點：方法缺乏專屬性。適用：適用于對結果準確度與精密度要求較高的樣品的測定。（2）光譜分析法優(yōu)點：簡便，快速，靈敏度高，并具有一定的準確度。缺點：方法專屬性稍差。適用：適用于對靈敏度要求較高、樣本量較大的分析項目。（3）色譜分析法優(yōu)點：高靈敏度與高專屬性，并具有一定的準確度。缺點：結果計算需要對照品。適用：適用于對方法的專屬性與靈敏度要求較高的復雜樣品的含量測定。3、為確保分析結果的可靠性，要求分析方法應準確、

2、穩(wěn)定、耐用。4、驗證內容包括：準確度、精密度、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。§4-1 定量分析方法的分類與特點一、容量分析法容量分析法：也稱滴定法。是將已知濃度的滴定液（標準物質溶液）由滴定管滴加到被測藥物的溶液中，直至滴定液與被測藥物反應完全（通過適當方法指示），然后根據滴定液的濃度和被消耗的體積，按化學計量關系計算出被測藥物的含量。當滴定液與被測藥物完全作用時，反應達到化學計量點。在進行容量分析時，當反應達到化學計量點時應停止滴定，并準確獲取滴定液被消耗的體積。但在滴定過程中反應體系常常無外觀現象的變化，必須借助適當的方法指示化學計量點的到達。其中，最常用的方法是借

3、助指示劑的顏色或電子設備的電流或電壓變化來判斷化學計量點。指示劑的顏色或檢測設備的電信號的突變點通常被稱為滴定終點。但滴定終點與滴定反應的化學計量點不一定恰好符合，二者之差被稱為滴定誤差。滴定誤差是容量分析法中系統(tǒng)誤差的重要來源之一，為了減少滴定誤差，要選用合適的指示劑或指示方法（如在非水溶液中常見用電位滴定法），使滴定終點盡可能的接近滴定反應的化學計量點。（一）容量分析法的特點與適用范圍1、容量分析法的特點（1）方法簡便易行：本法所用儀器廉價易得，操作簡便、快速。（2）方法耐用性高：影響本法測定的試驗條件與環(huán)境因素較少。（3）測定結果準確：通常情況下本法的相對誤差在0.2%以下，適用于對準確

4、度要求較高的試樣的分析。（4）方法專屬性差2、容量分析法的適用范圍由于容量分析法具有以上特點，被廣泛應用于化學原料藥物的含量測定，而較少應用于藥物制劑的含量測定。（二）容量分析法的有關計算1、滴定度：指每1ml規(guī)定濃度的滴定液所相當的被測藥物的質量。 中國藥典用毫克（mg）表示。2、滴定度的計算被測物質分子（A）與滴定劑（B）進行反應當反應完全時，被測藥物的量（wA）與滴定劑的量（wB） 滴定度T：單位體積（VB=1ml）的滴定液相當于被測藥物的量。 不同藥物的摩爾質量以及與滴定劑反應的摩爾比不同，同一滴定液對不同被測藥物的滴定度是不同的。例1用溴酸鉀法測定異煙肼M(C6H7N3O)=137.

5、14的含量時，溴酸鉀滴定液的摩爾濃度為0.01667mol/L（以溴酸鉀為單元），化學反應式如下則滴定度3、含量的計算（1）直接滴定法：實際的滴定度（T）=滴定度（T）×濃度校正因數（F）實際的體積（V）=滴定體積（V）×濃度校正因數（F）(2)間接滴定法生成物滴定法：指被測藥物與化合物A作用，定量生成化合物B，再用滴定液滴定化合物B。該法的百分含量計算方法與直接滴定法相同，只是在計算滴定度時需考慮被測藥物與化合物B以及化合物B與滴定劑三者之間的化學計量關系（摩爾比）。例2葡萄糖酸銻鈉的含量測定：取本品約0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水100ml，鹽酸15ml與碘化

6、鉀試液10ml，密塞，振搖后在暗處放置10分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液（0.1mol/L）滴定，至近終點時，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍色消失，并將滴定的結果用空白試液校正。每1ml硫代硫酸鈉滴定液（0.1mol/L）相當于6.088mg的銻（Sb）。反應式：1mol銻與1mol碘化鉀作用生成1mol碘單質，而1mol碘單質消耗2mol硫代硫酸鈉。所以，硫代硫酸鈉滴定液（0.1mol/L）對葡萄糖酸銻鈉（以Sb=121.76計算）的滴定度剩余量滴定法：亦稱回滴定法。先加入定量過量的滴定液A，使其與被測藥物定量反應，待反應完全后，再用另一滴定液B回滴定反應后剩余的滴定液A。在計算含量時，要考慮滴定過程

7、中是否進行空白試驗校正。當不進行空白試驗校正時：當進行空白試驗校正時：例3司可巴比妥鈉的含量測定：取本品約0.1g，精密稱定，置250ml碘瓶中，加水10ml，振搖使溶解，精密加溴滴定液（0.05mol/L）25ml，再加鹽酸5ml，立即密塞并振搖1分鐘，在暗處放置15分鐘后，注意微開瓶塞，加碘化鉀試液10ml，立即密塞，搖勻后，用硫代硫酸鈉滴定液（0.1mol/L）滴定，至近終點時，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍色消失，并將滴定的結果用空白試驗校正。已知：M=260.27；司可巴比妥鈉與溴反應比為1:1；W=0.1022g；F（Na2S2O3）=1.038；供試品滴定消耗硫代硫酸鈉滴定液15.7

8、3ml；空白試驗消耗硫代硫酸鈉滴定液23.21ml。計算：溴滴定液的滴定度T（Br2）及司可巴比妥含量。二、光譜分析法光譜：當物質吸收輻射能（或熱能）后，其內部發(fā)生能級躍遷。記錄由能級躍遷所產生的輻射能隨波長的變化所得到的圖譜。光譜分析法：利用物質的光譜進行定性、定量和結構分析的方法。（一）紫外-可見風光光度法紫外光區(qū)：波長為200-400nm；可見光區(qū)：波長為400-760nm1、朗伯-比耳定律單色光輻射穿過被測物質溶液時，在一定的濃度范圍內被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層厚度（光路長度）成正比。E通常采用百分吸收系數（E1%1cm）表示，其物理意義為：當待測溶液濃度為每100ml中還有

9、待測藥物1g（1%，g/ml），該液層厚度為1cm時的吸光度值。計算出供試品含量：2、方法特點與適用范圍（1）簡便易行：本法使用的儀器價格較低廉，操作簡單，易于普及。（2）靈敏度高：本法靈敏度可達10-710-4g/mL，適用于低濃度試樣分析。（3）準確度較高：本法的相對誤差約為2%5%。（4）專屬性較差：由于紫外-可見分光光度法具有以上特點，故本法較少應用于原料藥的含量測定，可用于藥物制劑的含量測定，但更多應用于藥物制劑的定量檢查，如片劑的溶出度或含量均勻度檢查。3、儀器校正和檢定（1）波長儀器波長的允許誤差為：紫外光區(qū)±1nm，500nm處±2nm。（2）吸光度的準確度

10、可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。（3）雜散光的檢查（4）對溶劑的要求含有雜原子的有機溶劑，通常均具有很強的末端吸收。因此，當作溶劑使用時，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長。當溶劑不純時，也可能增加干擾吸收。因此，在測定供試品之前，應先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近是否符合要求。（5）測定法對照品比較法按各品種項下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分規(guī)定量的100%±10%，所用溶劑也應完全一致，在規(guī)定的波長測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度后，按下式計算供試品中被測溶液的濃度：原料藥百分量的計算公式如下： 固體制劑含量相當

11、于標示量的百分數計算公式： 吸收系數法按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數計算含量：當測定液體含量時 當測定固體（片劑）含量時 計算分光光度法比色法（二）熒光分析法（詳見藥物分析P151）1、方法特點與適用范圍（1）高靈敏度（2）熒光自熄滅（3）易受干擾2、干擾的排除（1）溶劑（2）溶液（3）玻璃量器（4）溫度3、測定法與含量計算三、色譜分析法色譜分析法：是根據混合物中各組分的色譜行為差異（如在吸附劑上的吸附能力的不同或在兩相中的分配系數不同），將各組分從混合物中分離后再（在線或離線）選擇性對待測組分進行分析的方法。色譜分析法是一種分離

12、分析方法，是分析混合物的最有力的手段。1、色譜分析發(fā)的特點與適用范圍（1）高靈敏度：最低檢出濃度可達10-1510-12g/mL。（2）高專屬性：可實現對待測組分的選擇性檢測。（3）高效能與高速度廣泛應用于藥物制劑的含量測定，尤其是復方制劑含量測定的首選方法。2、色譜分析法的分類（1）依據分離原理吸附色譜法；分配色譜法；離子交換色譜法；分子排阻色譜法（2）依據分離方式紙色譜；薄層色譜；柱色譜；高效液相色譜；氣相色譜（一）高效液相色譜法采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑（固定相）的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。1、對儀器的一般要求（1）色譜柱（2）檢測器（3）流動相2、系統(tǒng)適用

13、性試驗（1）色譜柱的理論板數（n）：用于評價色譜柱的分離效能。（2）色譜峰的分離度（R）：衡量色譜系統(tǒng)效能的關鍵指標。（3）色譜系統(tǒng)的重復性（4）色譜峰的拖尾因子（T）：用于評價色譜峰的對稱性。3、測定法（1）內標法采用內標法，可避免因樣品前處理及進樣體積誤差對結果的影響。（2）外標法外標法簡便，但要求進樣量準確及操作條件穩(wěn)定。（二）氣相色譜法采用氣體為流動相（載氣）流經裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。1、對儀器的一般要求（1）載氣：氮氣、氦氣、氫氣（2）色譜柱：填充柱、毛細管柱（3）檢測器（4）進樣：溶液直接進樣、頂空進樣2、系統(tǒng)適用性試驗3、測定法或：§4-2 樣品分析

14、的前處理方法樣品前處理：分析前采用一定方法使待測藥物或元素轉化為適宜的狀態(tài)滿足分析方法對試樣的要求1、含鹵素元素（1）鹵素與脂肪鏈的碳原子相連結不牢固，經堿溶液直接回流即可解離。（2）鹵素與芳環(huán)相連結合牢固，需在堿性溶液中加還原劑（如鋅粉），回流，使C-X鍵斷裂，轉化為無機鹵化物后測定。2、含金屬元素（1）含金屬的有機化合物：金屬離子不直接與碳原子相連，為有機酸或酚的金屬鹽或配位化合物。（2）有機金屬藥物：金屬離子直接與碳原子以共價鍵相連，結合狀態(tài)比較牢固，在溶液中不能直接離解出金屬離子（少見）。一、不經有機破壞的前處理方法（一）水解法1、酸水解法常用于水難溶的含金屬的有機藥物將它們與適當的無

15、機酸（如鹽酸）共熱，可將不溶性金屬鹽類水解置換為可溶性鹽。2、堿水解法適用于鹵素原子結合不牢固的含鹵素有機藥物，如鹵素與脂肪碳鏈相連者。（二）還原法含碘有機藥物，當碘原子直接與芳環(huán)連接時，碘的結合較牢固，采用堿性溶液回流時難以使碳碘鍵斷裂，但可在堿性溶液中加還原劑鋅粉回流，使其碳碘鍵斷裂而轉化為無機碘化物。（三）直接測定法1、配位滴定法2、氧化還原滴定法二、經有機破壞的前處理方法待測原子與碳原子結合牢固者，用有機破壞的方法將藥物分子中有機結構部分完全破壞，使有機結合形式的待測原子轉變?yōu)榭蓽y定的無機離子（或氧化物、無機酸等）后方可采用適當的分析方法。（一）濕法破壞本法適用于含氮有機藥物分析的前處

16、理，在生物制品分析中用于氮（包括蛋白質）、磷、硫柳汞及氯化鈉測定法的前處理。本法亦用于生物樣品中金屬元素測定時的生物基質的去除。凱氏定氮法以基于硫酸硫酸鹽有機破壞法的含氮有機藥物定量分析方法。（1）原理：將含氮藥物與硫酸在凱氏燒瓶中共熱，藥物分子中有機結構被氧化分解（亦稱消解或消化）成二氧化碳和水，有機結合的氮則轉變?yōu)闊o機氨，并與過量的硫酸結合為碳酸氫銨，經氫氧化鈉堿化后釋放出氨氣，并隨水蒸氣餾出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或堿滴定液滴定。（2）儀器：凱氏燒瓶（半微量法3050mL；常量法500mL）、安全瓶、圓底燒瓶、連有氮氣球的蒸餾器、漏斗、直形冷凝管、錐形瓶、橡皮管夾（3）

17、方法常量法：取供試品的量應約相當于含氮量2530mg，精密稱定，加供試品為固體或半固體，可用濾紙稱取，并連同濾紙置干燥的500ml凱氏燒瓶中；然后依次加入硫酸鉀（或無水硫酸鈉）10g和硫酸銅粉末0.5g，再沿瓶壁緩緩加硫酸20ml；在凱氏燒瓶口放一小漏斗，并使凱氏燒瓶成45度斜置，用直火緩緩加熱，使溶液的溫度保持在沸點以下，等泡沸停止，強熱至沸騰，待溶液呈澄明的綠色后，除另有規(guī)定外，繼續(xù)加熱30分鐘，放冷，沿瓶壁緩緩加水250ml,振搖使混合，放冷后，加40%氫氧化鈉溶液75ml，注意使沿瓶壁流至瓶底，自成一液層，加鋅粉數粒（以防暴沸），用氮氣球將凱氏燒瓶與冷凝管連接；另取2%硼酸溶液50ml

18、，置500ml錐形瓶中，加甲基紅溴甲酚綠混合指示劑10滴；將冷凝管的下端插入硼酸溶液的液面下，輕輕擺動凱氏燒瓶，使溶液混合均勻，加熱蒸餾，至接收液的總體積約為250ml時，將冷凝管尖端提出液面，使蒸氣沖洗約1分鐘，用水淋洗尖端后停止蒸餾；餾出液用硫酸滴定液（0.05mol/L）滴定至溶液由藍綠色變?yōu)榛易仙⒌味ǖ慕Y果用空白試驗校正。每1ml硫酸滴定液（0.05mol/L）相當于1.401mg的氮（）。半微量法取供試品的量應約相當于含氮量1.02.0mg，精密稱定，使用3050ml的凱氏燒瓶；消解劑用量相應減少，加硫酸鉀（或無水硫酸鈉）0.3g與30%硫酸銅溶液5滴，再沿瓶壁滴加硫酸2.0m

19、l，消解操作與常量法基本相同。蒸餾與滴定操作如下：取2%硼酸溶液10ml，置100ml錐形瓶中，加甲基紅溴甲酚綠混合指示液5滴，將冷凝管的下端插入液面下。然后將凱氏燒瓶中內容物經由D漏斗轉入蒸餾瓶C中，用水少量淋洗凱氏燒瓶及漏斗數次，再加入40%氫氧化鈉溶液10ml，用水少量再洗漏斗數次，關G夾，加熱A瓶，進行水蒸氣蒸餾，至硼酸溶液開始由酒紅色變?yōu)樗{綠色時起，繼續(xù)蒸餾約10分鐘后，將冷凝管尖端提出液面，使蒸氣繼續(xù)沖洗約1分鐘，用水淋洗尖端后停止蒸餾。餾出液用硫酸滴定液（0.005mol/L）滴定至溶液由藍綠色變?yōu)榛易仙⒌味ǖ慕Y果用空白試驗（空白和供試品所得餾出液容積應基本相同，為7075

20、ml）校正。每1ml硫酸滴定液（0.005mol/L）相當于0.1401mg的氮（N）。（4）注意在硫酸中加入硫酸鉀（或無水硫酸鈉）的目的？提高硫酸沸點，從而提高消解溫度。加入催化劑硫酸銅的作用是什么？硫酸銅的優(yōu)點？加快消解速度，以縮短消解時間。硫酸銅低毒、價廉、無揮發(fā)性。消解過程中為什么常需加入輔助氧化劑？高氯酸用量有什么要求？使分解完全并縮短消解時間。高氯酸為強氧化劑，用量不宜過大。若使用量過大，可能生成高氯酸銨而分解或將氮元素氧化生成氮氣而損失，而且高氯酸在高溫加熱時易發(fā)生爆炸。消解注意問題a.凱氏瓶放小漏斗，瓶內放玻璃珠或沸石。b.消解液無色或綠色。（一般為綠色，繼續(xù)加熱30分鐘）c.

21、毒氣櫥中進行，初小火，泡沸停止后大火。半微量法測定時的蒸餾裝置在使用之前應清洗，操作方法？連接蒸餾裝置，A瓶中加水適量與甲基紅指示液數滴，加稀硫酸使成酸性，加玻璃珠或沸石數粒，從D漏斗加水約50ml，關閉G夾，開放冷凝水，煮沸A瓶中的水，當蒸氣從冷凝管尖端冷凝而出時，移去火源，關H夾，使C瓶中的水反抽至B瓶，開G夾，放出B瓶中的水，關B瓶及G夾，將冷凝管尖端插入約50ml水中，使水自冷凝管尖端反抽至C瓶，再抽至B瓶，如上法放去。如此將儀器內部洗滌23次。（二）干法破壞本法主要適用于含鹵素、硫、磷等有機藥物定量分析的前處理。1、高溫灼燒法本法將含待測元素的有機藥物經高溫灼燒灰化，使有機結構分解而

22、待測元素轉化為無機元素或可溶性無機鹽的前處理方法。本法主要適用于含鹵素藥物的鑒別，亦用于含磷藥物的含量測定。根據分析對象與目的不同，常加無水碳酸鈉、硝酸鎂、氫氧化鈣、氧化鋅等輔助灰化。2、氧瓶燃燒法（1）原理：將分子中含有待測元素的有機藥物在充滿氧氣的密閉燃燒瓶中充分燃燒，使有機結構部分徹底分解為二氧化碳和水，而待測元素根據電負性的不同轉化為不同價態(tài)的氧化物（或無氧酸），被吸收于適當的吸收液中（多以酸根離子形式存在），以供待測元素的檢查或定量測定用。（2）優(yōu)點：本法是快速分解有機結構的最簡單方法。它不需要復雜的設備，在極短的時間內即可使有機結合的待測元素定量轉化為無機形式。（3）儀器：燃燒瓶為

23、500ml、1000ml或2000ml磨口、硬質玻璃錐形瓶，瓶塞應嚴密、空心，底部熔封鉑絲一根（直徑為1mm），鉑絲下端做成網狀或螺旋狀，長度約為瓶身長度的2/3。（4）方法在燃燒瓶內按個品種項下的規(guī)定加入吸收液，并將瓶口用水濕潤；小心急速通氧氣約1分鐘（通氣管口應接近液面，使瓶內空氣排盡），立即用表面皿覆蓋瓶口，備用；點燃包有供試品的濾紙包或紙袋尾部，迅速放入燃燒瓶中，按緊瓶塞，用水少量封閉瓶口，待燃燒完全（應無黑色碎片），充分振搖，使生成的煙霧完全吸入吸收液中，放置15分鐘，用水少量沖洗瓶塞及鉑絲，合并洗液及吸收液。用同法另作空白試驗。然后按各品種項下規(guī)定的方法進行檢查或測定。（5）特點快

24、速、簡便、破壞完全。儀器簡單。適用于含鹵素、硫、磷、硒等。樣品用量少（1020mg）。§4-3 藥品質量標準分析方法驗證1、需驗證的分析項目 2、驗證內容：準確度、精密度、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性一、準確度準確度：指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。（一）含量測定方法的準確度1、原料藥的含量測定（1）用已知純度的對照品或供試品進行測定。（2）用本法所得的結果與已知準確度的另一方法測定的結果進行比較。 2、制劑的含量測定（1）已知量被測物的制劑各組分混合物（包括制劑輔料）進行測定。（2）向制劑中加入已知量的被測物進行測定。（3）用本

25、法所得的結果與已知準確度的另一方法測定的結果進行比較。 （二）雜質定量測定方法的準確度雜質定量測定方法多采用色譜法，其準確度可通過向原料藥或制劑中加入已知量雜質進行測試。（三）數據要求在規(guī)定范圍內，至少用9個測定結果進行評價。二、精密度精密度：指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻供試品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度。精密度一般用標準偏差（s或SD）或相對標準偏差表示（RSD）。（一）驗證內容1、重復性：同一實驗室，同一人，多次測定。2、中間精密度：同一實驗室，不同人，不同儀器。3、重現性：不同實驗室，不同人。（二）數據要求 精密度驗證中所測數據均應報告標準偏差、相對標準偏差和可信限。三、專

26、屬性專屬性：指在其他成分（如雜質、降解產物、輔料等）可能存在下，采用的方法能正確測定出被測物的特性。（一）鑒別反應應能與可能共存的物質或結果相似化合物區(qū)分，不含被測成分的供試品，以及結果相似或組分中的有關化合物，均應呈負反應。（二）含量測定和雜質測定1、雜質可獲得：對于含量測定，試樣中科加入雜質或輔料，考察測定結果是否受干擾，并可與未加雜質和輔料的試樣比較測定結果；對于雜質測定，也可向試樣中加入一定量的雜質，考察雜質之間能否得到分離。2、雜質或降解產物不能獲得：可將含有雜質或降解產物的試樣進行測定，與另一個經驗證了的方法或藥典方法比較結果；用強光照射、高溫、高濕、酸堿水解或氧化的方法進行加速破壞，以研究可能的降解產物及其降解途徑。含量測定方法應比對二法的結果，雜質檢查應比對檢出的雜質個數。四、檢測限檢測限：指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量。LOD是一種限度檢驗效能指標，它反映方法是否具有靈