1、課題課題2 2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數土壤中分解尿素的細菌的分離與計數微生物的培養與應用細菌脲酶細菌脲酶尿素尿素CO(NHCO(NH2 2) )2 2重要的農業氮肥。重要的農業氮肥。只能被土壤中細菌分解為只能被土壤中細菌分解為NHNH3 3才能被植物吸才能被植物吸收利用收利用 CO(NHCO(NH2 2) )2 2 + H + H2 2O COO CO2 2 +2NH+2NH3 3課題背景課題背景課題目的課題目的土壤中尿素分解菌的分離與計數從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌統計每克土樣中究竟含有多少這樣的細菌思考：思考：PCRPCR技術要求使用耐高溫的技術要求使用耐高溫的DNADNA聚合

2、酶，聚合酶，這種酶要能忍受這種酶要能忍受93 93 左右的高溫。如果請你來尋左右的高溫。如果請你來尋找這種耐高溫的酶，你會去哪里尋找？找這種耐高溫的酶，你會去哪里尋找？( () )A A土壤中土壤中 B B海水中海水中C C熱泉中熱泉中 D D冷庫中冷庫中C C如何尋找如何尋找耐高溫耐高溫的酶？的酶？ 尋找尋找高溫高溫環境；環境；原理：熱泉原理：熱泉70-8070-80的的高溫條件淘汰了絕大多數高溫條件淘汰了絕大多數的微生物，使得耐熱的的微生物，使得耐熱的TaqTaq細菌脫穎而出。選出細菌脫穎而出。選出耐高溫細菌后，從耐高溫菌種中提取耐高溫酶。耐高溫細菌后，從耐高溫菌種中提取耐高溫酶。1 1、

3、自然界中目的菌株的刷選原理：、自然界中目的菌株的刷選原理：一、篩選菌株一、篩選菌株2 2、實驗室中篩選微生物的原理：、實驗室中篩選微生物的原理：（純且活的菌種純且活的菌種）在尋找目的菌株時，要根據它對在尋找目的菌株時，要根據它對生存環境生存環境的要求，的要求，到相應的環境中去找。到相應的環境中去找。人為提供人為提供有利于目的菌株生長的條件有利于目的菌株生長的條件( (包括營養、包括營養、溫度、溫度、pHpH等等) )，同時，同時抑制或阻止抑制或阻止其他微生物生長。其他微生物生長。 KH KH2 2POPO4 4 1.4g 1.4g NaHPO NaHPO4 4 2.1g 2.1g MgSO M

4、gSO4 4 H H2 2O 0.2gO 0.2g 葡萄糖葡萄糖 10.0g10.0g 尿素尿素 1.0g1.0g 瓊脂瓊脂 15.0g15.0g 將上述物質溶解后，將上述物質溶解后，用蒸餾水定容到用蒸餾水定容到1000mL1000mL。 該培養基的配方中，為微該培養基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質？分別是什么物質？ 此配方能否篩選出分解尿此配方能否篩選出分解尿素的細菌？為什么？素的細菌？為什么？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素氮源：氮源：尿素尿素能。只有產生脲酶的細菌能。只有產生脲酶的細菌能利用尿素作為氮源而生能利用尿素作為氮源而生存。存

5、。3 3、方法：、方法： 利用選擇培養基分離利用選擇培養基分離選擇培養基：選擇培養基：允許允許特定種類特定種類的微生物生長，同時的微生物生長，同時抑制或阻止抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基。其他種類微生物生長的培養基。(1)(1)在培養基中在培養基中加入某種化學物質加入某種化學物質。利用選擇培養基分離微生物的方法：利用選擇培養基分離微生物的方法：例如，加入例如，加入青霉素青霉素可以分離出可以分離出 ； 加入加入高濃度的食鹽高濃度的食鹽可以得到可以得到 。 酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌這里的加入是在培養成分的基礎上加入這里的加入是在培養成分的基礎上加入。(2)(2)改

6、變改變培養基中的培養基中的營養成分營養成分。例如，缺乏例如，缺乏氮源氮源時可以分離時可以分離 ； 尿素尿素作為作為唯一氮源唯一氮源時，可以分離出時，可以分離出 石油石油作為作為唯一碳源唯一碳源時，可以分離出時，可以分離出 固氮微生物固氮微生物能消除石油污染的微生物能消除石油污染的微生物能分解尿素的細菌能分解尿素的細菌(3)(3)改變改變微生物的微生物的培養條件培養條件。例如，將培養基放在例如，將培養基放在高溫環境高溫環境中培養可以得到中培養可以得到耐高溫的微生物耐高溫的微生物本課題使用的培養基的配方如下：本課題使用的培養基的配方如下：請分析后回答：請分析后回答： (1)(1)在該培養基的配方中

7、，為微生物的生長提供碳源和在該培養基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是氮源的分別是_和和_。 (2)(2)該培養基為該培養基為_培養基培養基( (按物理狀態分按物理狀態分) )，理由是理由是_。 (3)(3)想一想這種培養基對微生物是否具有選擇作用？如想一想這種培養基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，又是如何進行選擇的？果具有，又是如何進行選擇的？_ _ _。葡萄糖葡萄糖尿素尿素固體固體有凝固劑瓊脂有凝固劑瓊脂有選擇作用。此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能有選擇作用。此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長夠利用尿素的微生物才能夠生長二、二、統計菌落數目

8、統計菌落數目1 1、方法：、方法：常用稀釋涂布平板法統計活菌的數目常用稀釋涂布平板法統計活菌的數目原理：原理：當樣品的當樣品的 時，培養基表面生長時，培養基表面生長的的一個菌落一個菌落來源于樣品稀釋液中的來源于樣品稀釋液中的 。為了保證結果準確，一般選擇菌落數在為了保證結果準確，一般選擇菌落數在 統計統計通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少的活菌。中大約含有多少的活菌。要求：要求：3030 300 300 個菌落的平板個菌落的平板稀釋度足夠高稀釋度足夠高一個活菌一個活菌 例：兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤例：兩位同學用稀釋涂布平板法測

9、定同一土壤樣品中的細菌數。從對應稀釋倍數為樣品中的細菌數。從對應稀釋倍數為10106 6的培養基中，的培養基中，得到以下兩種統計結果。得到以下兩種統計結果。 1 1、甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統計的菌、甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統計的菌落數為落數為230230。 2 2、乙同學在該濃度下涂布了、乙同學在該濃度下涂布了A A、B B、C C三個平板，三個平板，統計的菌落數分別為統計的菌落數分別為2121、212212、256256，該同學以這三個，該同學以這三個平板上菌落數的平均值平板上菌落數的平均值163163作為統計結果。作為統計結果。 你認為這兩位同學的作法正確嗎？如果有問題，

10、你認為這兩位同學的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？錯在哪？ 甲：沒有甲：沒有重復實驗重復實驗（至少涂布（至少涂布3 3個平板）個平板） 乙：乙：A A組結果誤差過大，不應用于計算平均值組結果誤差過大，不應用于計算平均值 用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數，在對應稀釋倍數為的細菌數，在對應稀釋倍數為10106 6的培養基中，得的培養基中，得到以下幾種統計結果，正確的是到以下幾種統計結果，正確的是( () )A A涂布了一個平板，統計的菌落數是涂布了一個平板，統計的菌落數是230230B B涂布了兩個平板，統計的菌落數是涂布了兩個平板，統計的菌落數是215

11、215和和260260，取平均值，取平均值238238C C涂布了三個平板，統計的菌落數分別是涂布了三個平板，統計的菌落數分別是2121、212212和和256256，取平均值，取平均值163163D D涂布了三個平板，統計的菌落數分別是涂布了三個平板，統計的菌落數分別是210210、240240和和250250，取平均值，取平均值233233因為因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。觀察到的只是一個菌落。因此統計結果一般用因此統計結果一般用菌落數菌落數表示。表示。= =（平均菌落數（平均菌落數涂布的稀釋液體積）涂布的稀釋液體積）稀釋倍數

12、稀釋倍數 。缺點：缺點：操作復雜，實驗結果有一定的誤差。操作復雜，實驗結果有一定的誤差。 統計的菌落數往往比活菌的實際數目低統計的菌落數往往比活菌的實際數目低 每克樣品中的菌株數每克樣品中的菌株數= =（C/V)X MC/V)X MC:C:某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數；某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數；V:V:所用稀釋液的體積；所用稀釋液的體積；M:M:稀釋倍數。稀釋倍數。計算計算公式：公式：顯微鏡直接計數顯微鏡直接計數 優點：優點：缺點：缺點：計數方便，操作簡單計數方便，操作簡單死菌、活菌都計算在內，死菌、活菌都計算在內，統計結果比實際值偏大統計結果比實際值偏大（統計菌株數目）（統計

13、菌株數目）1 、產生標準形態菌落的細菌的最初數目和培養基分別是（、產生標準形態菌落的細菌的最初數目和培養基分別是（ ）A 一個細菌、液體培養基一個細菌、液體培養基 B 許多細菌、液體培養基許多細菌、液體培養基C 一個細菌、固體培養基一個細菌、固體培養基 D 許多細菌、固體培養基許多細菌、固體培養基2、某同學在稀釋倍數為、某同學在稀釋倍數為106 的培養基上測得平板上的菌落數的培養基上測得平板上的菌落數的平均值為的平均值為215，那么每毫升樣品中菌落數是（涂布平板時所用，那么每毫升樣品中菌落數是（涂布平板時所用稀釋液的體積為稀釋液的體積為0.1ml）A 2.15108 B 2.15109 C 2

14、15 D 21.5 3、下列有關檢測土壤中細菌總數實驗操作的敘述中，、下列有關檢測土壤中細菌總數實驗操作的敘述中，不正確的是（不正確的是（ ）A 用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨，高溫、高壓滅菌后道平板用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨，高溫、高壓滅菌后道平板B 取取104、105、106 倍土壤稀釋液和無菌水各倍土壤稀釋液和無菌水各0.1ml涂布不同平板涂布不同平板C 將實驗組和對照組平板倒置，將實驗組和對照組平板倒置，37恒溫培養恒溫培養24h-48hD 確定對照組無菌后，選擇菌落數在確定對照組無菌后，選擇菌落數在300以上的平板進行計數。以上的平板進行計數。CBD 利用選擇培養基進行尿素分解菌的分離過程中

15、，利用選擇培養基進行尿素分解菌的分離過程中，從對應稀釋倍數為從對應稀釋倍數為10106 6的培養基中，的培養基中，A A、B B兩同學分別兩同學分別得到以下兩種統計結果。得到以下兩種統計結果。 1 1、A A同學篩選出同學篩選出150150個菌落。個菌落。 2 2、B B同學篩選出同學篩選出5050個菌落。個菌落。 B B認為認為A A的培養基被雜菌污染了，或培養基中混入的培養基被雜菌污染了，或培養基中混入了其他含氮物質，因而導致不能分解尿素的細菌也能了其他含氮物質，因而導致不能分解尿素的細菌也能在該培養基中生長。在該培養基中生長。A A確認自己的操作無誤，但也拿確認自己的操作無誤，但也拿不出

16、能令人信服的證據。不出能令人信服的證據。 請你幫助請你幫助A A同學改進實驗，提供具有說明了的證同學改進實驗，提供具有說明了的證據。據。方案方案1 1：其他同學用：其他同學用A A同學的土樣進行實驗。同學的土樣進行實驗。 方案方案2 2：A A同學以不接種的培養基作為空白對照同學以不接種的培養基作為空白對照。2 2、增加實驗說服力的措施、增加實驗說服力的措施：排除實驗組中排除實驗組中非測試因素非測試因素對實驗結果對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。的影響，提高實驗結果的可信度。設置重復：設置重復：排除排除偶然因素偶然因素對實驗結果的影響。對實驗結果的影響。在培養過程中在培養過程中同一稀釋度

17、下同一稀釋度下應應涂布涂布至少至少3個平板個平板，才能增強說服力和準確性，才能增強說服力和準確性設置對照：設置對照：若對照的培養皿中無菌落生長，說明：若對照的培養皿中無菌落生長，說明：方法：方法：方法：方法：觀察培養物中是否有雜菌污染觀察培養物中是否有雜菌污染如如空白對照組空白對照組培養基未被雜菌感染培養基未被雜菌感染培養基混入其他雜菌培養基混入其他雜菌若實驗的培養基菌落數偏高或者菌落形態多樣，說明：若實驗的培養基菌落數偏高或者菌落形態多樣，說明：若牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落數大于選擇培養基若牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落數大于選擇培養基上的數目，說明：上的數目，說明：觀察選擇培養物是否具有觀察選

18、擇培養物是否具有選擇作用選擇作用如如完全培養基對照組完全培養基對照組選擇培養基具有篩選作用選擇培養基具有篩選作用距地表約距地表約3 3 8cm8cm土壤層土壤層菌落計數菌落計數配制土壤溶配制土壤溶液液系列稀釋系列稀釋涂布平板與涂布平板與培養培養三、實驗設計三、實驗設計1 1、實驗流程：、實驗流程：2 2、操作流程：、操作流程：（1 1）土壤取樣）土壤取樣 取樣原因：取樣原因：土壤要求：土壤要求：取樣部位：取樣部位：土壤土壤“微生物的天然培養基微生物的天然培養基”，含有大量，含有大量的微生物，數量最大，種類最多。的微生物，數量最大，種類最多。富含富含有機質有機質，pHpH接近接近中性中性且且潮濕

19、潮濕。測細菌數：測細菌數：測放線菌：測放線菌：測真菌數：測真菌數：（2 2）樣品稀釋）樣品稀釋 稀釋原因：稀釋原因：稀釋標準：稀釋標準：稀釋倍數：稀釋倍數：樣品的稀釋程度樣品的稀釋程度直接影響平板上生長直接影響平板上生長的菌落數目的菌落數目選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養，選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養，保證獲得保證獲得菌落數在菌落數在30-30030-300之間之間，便于計數。，便于計數。一般用一般用10104 4、10105 5、10106 6稀釋液稀釋液一般用一般用10103 3、10104 4、10105 5稀釋液稀釋液一般用一般用10102 2、10103 3、10104 4稀釋液

20、稀釋液思考：為什么分離不同的微生物要用不同的稀釋度？思考：為什么分離不同的微生物要用不同的稀釋度？土壤中各類微生物的數量不同土壤中各類微生物的數量不同如果是第一次做這個實驗，稀釋倍數的范圍如果是第一次做這個實驗，稀釋倍數的范圍可以放寬可以放寬103-107.1 、關于土壤取樣的敘述，錯誤的是（、關于土壤取樣的敘述，錯誤的是（ ）A 土壤取樣，應選取肥沃、濕潤的土壤土壤取樣，應選取肥沃、濕潤的土壤 B 先鏟去表層土先鏟去表層土3-8cm左右，再取樣左右，再取樣C 取樣用的小鐵鏟和信封在使用前不用滅菌取樣用的小鐵鏟和信封在使用前不用滅菌D 應在火焰旁稱取土壤應在火焰旁稱取土壤2、下列關于、下列關于

21、“土壤中分解尿素的細菌的分離土壤中分解尿素的細菌的分離”實驗步驟排列實驗步驟排列正確的是正確的是土壤取樣土壤取樣稱取稱取10g土壤加入盛有土壤加入盛有90ml無菌水的錐形瓶中無菌水的錐形瓶中吸取吸取0.1ml進行平板涂布進行平板涂布依次稀釋至依次稀釋至101、102、103、104、105、106、107 稀釋度稀釋度A B C D CC（三）微生物的培養與觀察（三）微生物的培養與觀察 1 1、接種：用適當的稀釋液涂布平板、接種：用適當的稀釋液涂布平板 2 2、培養：細菌：、培養：細菌：3030 3737，1 1 2d;2d; 放線菌放線菌:25:25 28, 528, 5 7d;7d; 霉菌霉菌: 25: 25 28, 328, 3 4d.4d. 3 3、觀察：、觀察：a.a.每每24h24h統計一次菌落數目統計一次菌落數目 b.b.以以“穩定穩定菌落菌落”為觀察對象為觀察對象 （四）鑒定：篩選后必鑒定（四）鑒定：篩選后必鑒定鑒別培養基：不影響微生物的生存鑒別培養基：不影響微生物的生存酚紅培養基：鑒定分解尿素的細菌酚紅培養基：鑒定分解尿素的細菌。原理：原理：脲酶催化尿素分解成氨脲酶催化尿素分解成氨培養基培養基堿性增強堿性增強 酚紅變紅酚紅變紅為了調查某河流的水質狀況，某研究小組測定了該河流為了調查某河流的水質狀況，某研究小組測定了該河流水樣中的細菌含量，并進行了細菌分