1、南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張茵張茵20152015年年4 4月月實驗二 柱層析法提取溶菌酶實驗?zāi)康恼莆侦o態(tài)和動態(tài)離子交換的方法；掌握靜態(tài)和動態(tài)離子交換的方法；掌握從生物材料中提取活性蛋白質(zhì)方法。掌握從生物材料中提取活性蛋白質(zhì)方法。實驗材料起始緩沖液：起始緩沖液： 0.1M 磷酸鈉緩沖液（pH7.0）洗脫液：洗脫液： 50mM NaCl溶液200mL（溶劑：起始緩沖液） 500mM NaCl溶液150mL（溶劑：起始緩沖液）l再生溶液：再生溶液：0.5M NaOH溶液儀器：儀器：磁力攪拌器等磁力攪拌器等其他材料：其他材料：新鮮雞蛋新鮮雞蛋實驗流程樣品的預(yù)處理樣品的預(yù)處理靜態(tài)

2、吸附和洗滌靜態(tài)吸附和洗滌動態(tài)洗脫雜質(zhì)和溶菌酶動態(tài)洗脫雜質(zhì)和溶菌酶再生樹脂再生樹脂洗滌管道洗滌管道背景知識蛋清中的溶菌酶蛋清中的溶菌酶 一種堿性球蛋白一種堿性球蛋白，MwMw14700Da14700Da， pIpI10.511.010.511.0，在酸性條件在酸性條件下（下（pH4pH47 7）較耐熱，而在中、堿性條件下熱穩(wěn)定性較差。）較耐熱，而在中、堿性條件下熱穩(wěn)定性較差。 蛋清中主要的蛋白質(zhì)蛋清中主要的蛋白質(zhì) 卵白蛋白，占卵白蛋白，占5454，pIpI4.54.54.84.8，分子量約為，分子量約為 45000Da45000Da； 卵伴白蛋白，卵伴白蛋白，pIpI6.056.056.66.6

3、，分子量約為，分子量約為 7000078000Da7000078000Da； 卵球蛋白，卵球蛋白，pIpI5.55.85.55.8，分子量約為，分子量約為360003600045000Da45000Da； 卵類粘蛋白，卵類粘蛋白，pIpI3.93.94.34.3，分子量約為，分子量約為28000Da28000Da； 卵粘蛋白粘度較大且不溶于水。卵粘蛋白粘度較大且不溶于水。實驗原理蛋清中的蛋白質(zhì)大多數(shù)呈酸性或者弱酸性，在蛋清中的蛋白質(zhì)大多數(shù)呈酸性或者弱酸性，在pHpH7.07.0的條件下，這些蛋白質(zhì)的條件下，這些蛋白質(zhì)帶負電荷或者少量的正電帶負電荷或者少量的正電荷荷；而等電點約為；而等電點約為1

4、1.011.0的溶菌酶的溶菌酶帶正電荷帶正電荷，牢固地，牢固地吸附在陽離子交換樹脂上，再通過吸附在陽離子交換樹脂上，再通過不同離子強度的不同離子強度的 NaClNaCl溶液將弱酸性蛋白質(zhì)和溶菌酶溶液將弱酸性蛋白質(zhì)和溶菌酶分級洗脫分級洗脫下來。下來。離子交換層析分離溶菌酶離子交換層析分離溶菌酶Na+ 陽離子交陽離子交換樹脂換樹脂陽離子交陽離子交換樹脂換樹脂陽離子交陽離子交換樹脂換樹脂+-靜態(tài)和動態(tài)離子交換法l 靜態(tài)離子交換法靜態(tài)離子交換法優(yōu)點：優(yōu)點：操作簡單；操作簡單；設(shè)備要求低；設(shè)備要求低；適合于粘度較高適合于粘度較高的樣品。的樣品。 缺點：缺點： 交換不完全；交換不完全；不適宜用作多種不適宜

5、用作多種成分的分離；成分的分離； 而且樹脂有一定而且樹脂有一定的損耗。的損耗。動態(tài)離子交換法動態(tài)離子交換法優(yōu)點：優(yōu)點：分辨率高，適分辨率高，適合多組分樣品合多組分樣品的分離；的分離；交換完全；交換完全；洗脫液中溶質(zhì)洗脫液中溶質(zhì)濃度高；濃度高；缺點：缺點：設(shè)備要求高；設(shè)備要求高；操作參數(shù)多。操作參數(shù)多。洗脫 改變離子強度，在緩沖液中加入適改變離子強度，在緩沖液中加入適當(dāng)?shù)漠?dāng)?shù)腒ClKCl、NaClNaCl等非緩沖鹽類等非緩沖鹽類 改變改變pHpH值，用緩和的酸或者堿洗脫值，用緩和的酸或者堿洗脫。分階段分階段梯度洗脫：梯度洗脫：先采用先采用洗脫能力弱洗脫能力弱的溶的溶液，使易解吸附的組分流出，然后

6、依次使用液，使易解吸附的組分流出，然后依次使用洗脫能力強洗脫能力強的溶液，解吸附較難洗脫的組分。的溶液，解吸附較難洗脫的組分。連續(xù)梯度洗脫：連續(xù)梯度洗脫：其洗脫效果優(yōu)于分階段梯其洗脫效果優(yōu)于分階段梯度洗脫，適合于度洗脫，適合于高分辨率高分辨率的分離目的，或者的分離目的，或者摸索分階段梯度洗脫的條件。摸索分階段梯度洗脫的條件。離子強度離子強度分階段洗脫分階段洗脫連續(xù)洗脫連續(xù)洗脫離子強度離子強度洗脫峰洗脫峰洗脫峰洗脫峰連續(xù)梯度洗脫的裝置連續(xù)梯度洗脫的裝置 C = C C = CB B - -（C CB B - C- CA A）（）（1 - V1 - V2 2/V/V1 1）B1/A1B1/A1 C

7、 CA A 、C CB B 梯度混合器梯度混合器A A瓶、瓶、 B B瓶的濃度；瓶的濃度； A1 A1 、B1 B1 A A瓶、瓶、B B瓶的橫切面積；瓶的橫切面積； V V2 2流經(jīng)層析柱的體積，流經(jīng)層析柱的體積，V V1 1梯度洗脫液的總體積。梯度洗脫液的總體積。總結(jié)離子交換的操作流程離子交換的操作流程樹脂的選擇（陽離子交換樹脂還是陰離子交換樹脂的選擇（陽離子交換樹脂還是陰離子交換樹脂）樹脂）樹脂的預(yù)處理（鹽型還是氫型、羥型）樹脂的預(yù)處理（鹽型還是氫型、羥型）緩沖液的種類、緩沖液的種類、pHpH值和離子強度值和離子強度洗脫洗脫樹脂的再生樹脂的再生離子交換的操作參數(shù)離子交換的操作參數(shù)流速（吸

8、附的速度和洗脫速度）流速（吸附的速度和洗脫速度）樣品的體積和濃度樣品的體積和濃度實驗步驟樣品的預(yù)處理樣品的預(yù)處理 取取2 2個新鮮雞蛋，在其一端敲一個小洞，收集蛋清，加入約其體積個新鮮雞蛋，在其一端敲一個小洞，收集蛋清，加入約其體積1.51.5倍倍的起始緩沖液，攪拌均勻，用的起始緩沖液，攪拌均勻，用4 4層紗布過濾除去不溶性物質(zhì)，層紗布過濾除去不溶性物質(zhì)，檢查其檢查其pHpH值是否為值是否為7.07.0，否則用，否則用0.5M0.5M酸、堿調(diào)節(jié)。酸、堿調(diào)節(jié)。靜態(tài)吸附和洗滌靜態(tài)吸附和洗滌靜態(tài)吸附溶菌酶：靜態(tài)吸附溶菌酶：傾出層析柱中平衡好的樹脂，傾去多余平衡緩沖液，傾出層析柱中平衡好的樹脂，傾去多

9、余平衡緩沖液，將蛋清溶液倒入樹脂中，在磁力攪拌器上將蛋清溶液倒入樹脂中，在磁力攪拌器上輕輕攪拌輕輕攪拌，室溫下攪拌吸附，室溫下攪拌吸附約約45min45min，注意攪拌速度（勿起大量泡沫、勿打破樹脂）。吸附結(jié)束，注意攪拌速度（勿起大量泡沫、勿打破樹脂）。吸附結(jié)束，吸取吸取 200L 200L 上清于上清于 dorfdorf管中、管中、4 4度保存?zhèn)溆茫ǘ缺４鎮(zhèn)溆茫?biāo)記標(biāo)記“1 1”），傾倒上），傾倒上清。清。洗滌雜質(zhì)：洗滌雜質(zhì)：取取與樹脂體積相當(dāng)與樹脂體積相當(dāng)?shù)钠鹗季彌_液的起始緩沖液攪拌洗滌樹脂約攪拌洗滌樹脂約5min5min，重重復(fù)復(fù)2 2次次，每次洗滌后，吸取，每次洗滌后，吸取 200L

10、200L 洗滌液于洗滌液于 dorfdorf管中、管中、4 4度保存?zhèn)溆枚缺４鎮(zhèn)溆茫?biāo)記標(biāo)記“2”2”“3”3”），傾去洗滌液。），傾去洗滌液。 動態(tài)洗脫動態(tài)洗脫用少量起始緩沖液將樹脂調(diào)勻，重新裝填層析柱，用少量起始緩沖液將樹脂調(diào)勻，重新裝填層析柱，裝填結(jié)束后，用起始緩沖液（裝填結(jié)束后，用起始緩沖液（用滴管沿層析柱內(nèi)壁用滴管沿層析柱內(nèi)壁緩緩加入，勿沖擊樹脂面，高度約緩緩加入，勿沖擊樹脂面，高度約2cm2cm即可即可）封閉樹）封閉樹脂面，將層析系統(tǒng)組裝好，核酸蛋白檢測儀調(diào)基線脂面，將層析系統(tǒng)組裝好，核酸蛋白檢測儀調(diào)基線（T T檔調(diào)檔調(diào)“100”100”，A A檔調(diào)檔調(diào)“0”0”），開始用），開始

11、用 50mM 50mM NaClNaCl洗脫液洗脫液恒速洗脫雜質(zhì)恒速洗脫雜質(zhì)。（流速約。（流速約23mL/min)23mL/min)2.2. 洗脫雜蛋白：洗脫雜蛋白：洗脫開始，即計時，然后洗脫開始，即計時，然后每隔每隔2min2min，記錄下吸光值，記錄下吸光值和電和電導(dǎo)率值（使用導(dǎo)率值（使用LPLP層析系統(tǒng)的同學(xué)記錄電導(dǎo)率值），當(dāng)層析系統(tǒng)的同學(xué)記錄電導(dǎo)率值），當(dāng)洗脫峰結(jié)束洗脫峰結(jié)束（流出液的吸光值從開始上升到下降，直至平穩(wěn)流出液的吸光值從開始上升到下降，直至平穩(wěn)），洗脫完成。），洗脫完成。在在洗脫峰洗脫峰吸光值最大處吸光值最大處收集少量洗脫液于收集少量洗脫液于 dorfdorf管管中，中，標(biāo)

12、記標(biāo)記“4 4”）3.3. 收集溶菌酶：收集溶菌酶：更換更換 500mM NaCl500mM NaCl洗脫液洗脫液，同樣記錄，同樣在吸光值最，同樣記錄，同樣在吸光值最大處收集少量洗脫液于大處收集少量洗脫液于dorfdorf管中，管中，標(biāo)記標(biāo)記“5 5”），），此時是此時是溶菌酶的洗脫峰，所以溶菌酶的洗脫峰，所以整個洗脫峰要收集于燒杯中，整個洗脫峰要收集于燒杯中，4 4度保存度保存。再生樹脂再生樹脂 用用0.5M NaOH0.5M NaOH溶液（約溶液（約1 1倍柱床體積）洗滌樹脂，然后倍柱床體積）洗滌樹脂，然后用蒸餾水將堿液沖洗干凈，樹脂回收于燒杯中，浸泡用蒸餾水將堿液沖洗干凈，樹脂回收于燒杯中，浸泡于蒸餾水中，保鮮膜蒙好，室溫放置。于蒸餾水中，保鮮膜蒙好，室溫放置。l洗滌管道洗滌管道 將管道系統(tǒng)連接好，用約將管道系統(tǒng)連接好，用約100mL 70